鳜AKT2在传染性脾肾坏死病毒增殖中的作用

【目的】研究鳜AKT2(ScAKT2)在传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)增殖中的作用,为鳜ISKNV防控提供参考。【方法】克隆ScAKT2基因开放阅读框,构建原核表达载体,进行原核表达及蛋白纯化。用纯化后的ScAKT2重组蛋白免疫日本大耳兔后制备多克隆抗体,用间接ELISA法检测抗体的效价,用间接免疫荧光和Western blot法测定抗体的特异性。克隆鳜AKT2基因,构建过表达载体pCMV-EGFP-ScAKT2,将其转染至CPB细胞系中构建ScAKT2过表达细胞系,用荧光显微镜检测转染效率,用qRT-PCR法及Western blot法分别测定ScAKT2 mRNA水平和蛋白水平的表达,以鉴定ScAKT2过表达细胞系是否构建成功。将ISKNV接种至ScAKT2过表达细胞系中,用qPCR法及Western blot法分别测定ISKNV病毒拷贝数及ISKNV-MCP蛋白的表达,用qRT-PCR法测定ScIRF3、ScIRF7、ScMx、ScIL8、ScTRAF2和ScTRAF3等先天免疫因子mRNA水平的表达情况。【结果】PCR扩增获得1400 bp的AKT2 ORF片段,成功构建了原核表达质粒,诱导表达出72 ku的重组蛋白。成功制备了ScAKT2多克隆抗体,抗体效价达1∶256000,纯化后质量浓度约为10 mg/mL。成功构建了pCMV-EGFP-ScAKT2过表达载体和过表达ScAKT2的CPB细胞系,过表达ScAKT2 CPB细胞可极显著抑制ISKNV的增殖,能明显上调ScIRF3、ScIRF7、ScMx、ScIL8、ScTRAF2和ScTRAF3等先天免疫因子mRNA的表达水平。【结论】ScAKT2通过上调先天免疫因子的表达抑制ISKNV的增殖,为鳜ISKNV防控提供了新的潜在靶点。