超声辅助酶法制备菜籽肽及其组成、物理特性及结构分析

为提高低温压榨菜籽饼的附加值和应用价值,采用石油醚对低温压榨菜籽饼进行脱脂,然后利用超声预处理分别辅助木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶直接酶解制备菜籽肽,通过单因素试验探究超声功率、超声时间及酶添加量对菜籽肽得率的影响,通过响应面法优化超声辅助酶解工艺条件,并对所得菜籽肽的组成、物理特性以及结构进行分析。结果表明:碱性蛋白酶酶解的菜籽肽得率高于木瓜蛋白酶的;最佳超声辅助碱性蛋白酶酶解工艺条件为酶添加量12 289.79 U/g、超声时间21.82 min、超声功率306.56 W,该条件下菜籽肽得率为55.19%;最佳条件下所得菜籽肽的分子质量范围为88.02~1 290.00 Da,其中98.40%的菜籽肽分子质量小于500 Da,相较于未超声辅助酶解,所制备的菜籽肽氨基酸含量增加,粒径变小,Zeta电位绝对值变大,二级结构中α-螺旋和β-折叠含量增加,β-转角含量减少,二级结构更有序、稳定。综上,超声辅助酶法不使用有机溶剂,环境友好,且产品品质较好,可以用于高效提取菜籽肽。

新型布鲁顿氏酪氨酸激酶蛋白水解靶向嵌合体(BTK PROTAC)的设计合成及活性评价

目的 设计合成新型布鲁顿氏酪氨酸激酶蛋白水解靶向嵌合体(BTK PROTAC),并在体外评估这些分子对BTK蛋白的降解活性。方法 以Nurix Therapeutics公司临床化合物NX-5948为先导化合物,分析其与靶蛋白的相互作用,通过引入并环代替吡嗪胺的骨架跃迁思路对其进行结构改造,成功合成了一系列新型BTK PROTACs,通过时间分辨荧光共振能量转移技术(TR-FRET)、MTS法和蛋白质免疫印迹法分别测定目标化合物的激酶活性、细胞增殖抑制活性和BTK蛋白降解活性。结果 共合成6个目标化合物(化合物B~G),活性测试结果显示,大部分化合物都具有优异的细胞增殖抑制活性和BTK降解活性,其中化合物B表现出较优的BTK蛋白降解能力,其半数最大降解浓度(DC_(50))值约为0.1 nmol·L^(-1)。结论 基于NX-5948,通过骨架跃迁的方法设计合成了一类新颖的BTK PROTAC化合物,进行了构效关系的初步探索,可为BTK PROTAC降解剂的进一步研究提供参考。

岩大戟内酯B-17-琥珀酸酯对人肝癌HepG2细胞凋亡的影响

探讨岩大戟内酯B-17-琥珀酸酯(HJB-SA)对肝癌HepG2细胞凋亡的影响及作用机制。方法 采用流式细胞仪定量检测细胞的总凋亡率、线粒体膜电位去极化程度及细胞内活性氧含量变化;再采用Western blot法检测基于线粒体凋亡的相关蛋白(Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase3、Cyt-c)表达水平。结果 HJB-SA能显著升高HepG2细胞的凋亡率(P<0.01或P<0.001);显著降低HepG2细胞线粒体膜电位(P<0.05或P<0.01或P<0.001);增高HepG2细胞内ROS水平(P<0.05或P<0.01);使HepG2细胞内Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.05或P<0.01),Bax、cleaved-Caspase3及Cyt-c蛋白表达显著升高(P<0.05或P<0.01)。结论 HJB-SA可通过线粒体凋亡途径诱导肝癌HepG2细胞凋亡。

蛋壳膜抗氧化肽的研究进展

氧化应激是涉及人类多种疾病发生和人体衰老的一个重要因素。而抗氧化肽能够清除体内过剩自由基,延缓、抑制脂质过氧化。因此当机体内自由基过剩时,适量摄入抗氧化肽可预防氧化应激并降低发病率。蛋壳膜作为蛋白和生物活性肽等的潜在资源,应用价值可观。该文概述了蛋壳膜这一具有高附加值的生物膜,并对其抗氧化肽功能进行相应介绍,着重强调抗氧化肽的作用机理。旨在为开发利用蛋壳膜资源提供理论依据。

肽的分离纯化及其降糖活性研究进展

糖尿病是因胰岛素分泌不足、血糖水平增高而导致的代谢疾病.肽作为一种生物活性物质可参与生物体内复杂的生理活性反应,调节细胞功能活动.且肽具有储量丰富、毒副作用小、分子量小、作用靶点明确、易吸收等优点.因此,肽可作为一种新的降糖药物被开发利用.针对肽的分离纯化方法(包括膜分离法、色谱法、电泳法等)进行了总结,并对肽在降糖活性方面的研究进行综述,以期为开发降糖新药提供参考依据.

大豆多肽中α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制剂的虚拟筛选及体外活性验证

目的:通过抑制碳水化合物消化酶的活性延缓碳水化合物的消化,来预防和控制糖尿病的作用已经成为多领域的研究热点。β-伴大豆球蛋白是大豆蛋白中含量最高的功能性蛋白,但其胃肠道消化后产生的多肽是否具有抑制碳水化合物消化酶的活性还不得而知。方法:将β-伴大豆球蛋白进行胃肠道模拟消化,通过虚拟筛选和ADMET预测选出α-葡萄糖苷酶抑制肽和α-淀粉酶抑制肽,检测多肽对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制作用。结果:通过胃酶、胰酶和糜蛋白酶将β-伴大豆球蛋白虚拟酶解成95个小分子多肽;筛选出8个α-葡萄糖苷酶抑制肽和α-淀粉酶抑制肽;发现氢键和静电相互作用在多肽与α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶结合中起重要作用;体外验证发现四肽EASY具有较强α-葡萄糖苷酶抑制效果,其IC_(50)值为208.6μg/mL,未发现明显α-淀粉酶抑制效果。结论:α-葡萄糖苷酶抑制肽EASY具有抑制碳水化合物消化酶的活性,可能成为控制糖尿病的潜在抑制剂。

肌肽与皮肤健康护理

肌肽由β-丙氨酸和L-组氨酸组成,是一种水溶性二肽,具有抗氧化、抗糖化、抗紫外损伤、抗炎和调控脂质代谢等多种生物活性,主要分布于人体骨骼肌、脾脏和神经组织。由于广泛的生物活性,肌肽在化妆品和医药领域均有深入的研究报道,现已成为皮肤护理和疾病防治极具潜力的化合物。因此,探讨肌肽的活性机制对于功效护肤品的开发具有重要意义。目前关于肌肽的研究性文章偏多,但是护肤类综述却极为少见。本文重点总结了近年来关于肌肽在护肤领域的生物活性及功效机制的研究,以期为护肤品的开发及拓展应用提供一定的参考价值。

Caerin1.1抗菌机制中脯氨酸作用的光谱研究

Caerin1.1(GLLSVLGSVAKHVLPHVVPVIAEHL-NH2)是一种由澳大利亚树蛙皮肤分泌的天然抗菌肽,在抗细菌感染和抗癌活性等宿主防御活动中具有多种功能。这种肽的杀菌机制已经被讨论了很久。近年来人们发现caerin1.1不属于膜破坏家族抗菌肽,而是通过穿透细菌细胞膜来发挥杀菌机制。该序列中的两个脯氨酸残基被证明是抗菌活性所必需的,但具体原因尚不清楚。我们用羟基荧光素(FAM)作为供体,羟基四甲基罗丹明(TAMRA)作为受体,分别标记在caerin1.1的N端和磷脂膜上。在模拟液相生物环境条件下,通过荧光共振能量转移(FRET)研究脯氨酸对抗菌肽caerin1.1抗菌机制的影响机理。

螺旋藻中分析级藻蓝蛋白的高效制备

为了低成本高效生产分析级藻蓝蛋白(C-Phycocyanin,C-PC),本文以钝顶螺旋藻藻粉为原料,采用超声耦合高压均质高效提取藻蓝蛋白,通过盐析、透析和葡聚糖凝胶柱G-75纯化所提取的藻蓝蛋白,从而使得藻蓝蛋白的纯度达到分析级,同时利用SDS-PAGE和紫外吸光度分析纯化提物中的成分变化。实验结果表明,高压均质耦合超声法可有效提高藻蓝蛋白的产率,其最佳组合提取条件为:390 W超声2 min,超声2 s/间隔2 s,60 MPa处理3次,其粗提液中藻蓝蛋白产率和纯度(A 620/A 280)分别为131.2 mg·g^(-1)和0.69,比单独高压均质和超声的产率分别提高了51.07%和58.15%,且高于先前报道的。粗提液经过两步铵盐析(12%硫酸铵和50%硫酸铵)和透析,藻蓝蛋白纯度可提升至1.09(>0.7),最后经过25 min葡聚糖凝胶G-75层析纯化得藻蓝蛋白产率和纯度(A 620/A 280)分别为107.65 mg·g^(-1)和4.23(>4.0),达到分析级标准,其回收率达到82.05%,此外,分析级藻蓝蛋白的色度L*a*b*值分别为58.07,-15.44,-17.86,其主要与纯度、浓度及原料来源有关。采用SDS-PAGE凝胶电泳图分析藻蓝蛋白的分子量(17 kDa)及纯化效果,与先前报道的藻蓝蛋白分子量(15~21 kDa)基本一致。该研究结果为低成本高效生产分析级藻蓝蛋白提供技术支撑。

基于定量构效关系制备火麻仁蛋白ACE抑制肽

高血压是引发心血管疾病的主要因素,经常服用降压的药物会产生副作用,因而安全、高效的食源性降压肽成为关注点。本研究建立了血管紧张素转换酶(ACE)抑制肽的定量构效关系(QSAR)模型,确定ACE抑制肽的结构与其活性间的关系。将模型结果辅以计算机虚拟酶切精确掌握蛋白水解位点,筛选合适的蛋白酶水解火麻仁蛋白定向制备ACE抑制肽,并测定最终水解物的抑制效果。结果表明:基于二肽建立的SVM-AAindex模型具有最佳的预测性能(R~2为0.81,RMSE为0.53),且当二肽C端氨基酸为疏水性和芳香族氨基酸时具有较强的ACE抑制效果。蛋白质组分分析发现火麻仁蛋白含有34.60%的疏水性氨基酸和芳香族氨基酸是制备ACE抑制肽的良好来源。选择虚拟酶切产生较多短肽和生物活性肽的碱性蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶对火麻仁蛋白进行定向水解,获得的最终水解液的ACE抑制IC50值分别为1.89和2.30 mg/mL。本研究建立了一种高效精准的制备火麻仁蛋白ACE抑制肽的方法,在降血压药物上具有很好的应用前景。

多肽药物口服给药稳定性研究进展

与小分子药物相比,多肽药物因其高选择性与高效性已在医药领域得到广泛应用。但由于较差的药代动力学与有限的生物屏障渗透性等问题,多肽药物的口服生物利用度较低,其通常通过胃肠外途径给药。主要为多肽药物的口服给药进行综述、介绍了多肽类药物面临的挑战及改善其口服稳定性的策略,如酸碱度调节、酶抑制剂、渗透促进剂及化学法修饰,并对纳米粒载体给药系统进行阐述,以期为未来开发设计临床多肽类口服药物提供参考。

玉米源活性肽对脂质过氧化的抑制作用研究

玉米肽具有良好的自由基和活性氧清除等抗氧化活性,但对其脂质过氧化抑制作用的报道较少。本研究利用碱性蛋白酶、风味蛋白酶、中性蛋白酶以及模拟胃肠道消化(胰液酶+胃蛋白酶)水解制备玉米源活性肽,测定了不同蛋白酶所制备的玉米肽对ABTS自由基的清除活性,系统评价了其对亚油酸过氧化、蛋黄脂质过氧化和动物肝脏脂质过氧化的抑制作用。结果显示不同蛋白酶制备的玉米肽均具有一定的ABTS自由基清除活性以及脂质过氧化抑制作用,其中,模拟胃肠道消化所制备的玉米肽ABTS自由基清除活性最强,清除率最高达到(78.61±0.56)%;风味蛋白酶制备的玉米肽的亚油酸过氧化抑制作用最强,抑制率最高为(72.54±1.15)%;碱性蛋白酶制备的玉米肽的卵黄脂质过氧化的抑制作用最强,抑制率最高达到(82.50±0.46)%;模拟胃肠道消化制备的玉米肽的动物肝脏脂质过氧化抑制作用最强,抑制率最高达到(61.96±0.34)%。

柱前衍生超高效液相色谱法测量脂蛋白相关磷脂酶A2含量

目的:脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)在血液中的含量能够反映动脉粥样硬化及其它心脑血管疾病的进展,故建立Lp-PLA2柱前衍生超高效液相色谱(UPLC)测定方法。方法:Lp-PLA2酸水解后,经柱前衍生剂处理,以γ-氨基丁酸为内标,采用超高效液相色谱法测定其中丝氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、赖氨酸4种衍生物的含量,进而推算出Lp-PLA2纯品的含量。测定结果与同位素稀释质谱法相比较,验证方法的可行性。结果:在最优条件下,所建立的柱前衍生超高效液相色谱(UPLC)法测定的Lp-PLA2含量为0.1183 mg/mL,相对标准偏差为2.48%,扩展不确定度为0.0026 mg/mL(k=2),检出限和定量限分别为1.96×10^(-2)mg/mL和6.55×10^(-2)mg/mL。结论:该方法成本较低且溯源链清晰、准确度高,可作为一种补充验证方法用于Lp-PLA2标准物质的定量。

桑叶活性多肽的酶解工艺研究

本文选用不同的蛋白酶组合水解桑叶,考察桑叶水解物的酪氨酸酶抑制活性、α-葡萄糖苷酶抑制活性及抗氧化性。结果表明,采用中性蛋白酶+酸性蛋白酶依次水解桑叶,得到的水解液同时具有酪氨酸酶抑制活性、α-葡萄糖苷酶抑制活性及抗氧化性,酪氨酸酶抑制率、α-葡萄糖苷酶抑制率及羟自由基清除率分别为60.7%、87.5%和88.8%。膜分离得到的小于1000 Da多肽分子段综合活性最高。此外,通过体外模拟消化试验,桑叶多肽的酪氨酸酶抑制活性、α-葡萄糖苷酶抑制活性及抗氧化性表现出了抗消化性。与未经过胃肠液处理相比,酪氨酸酶抑制活性增强了5.2%。

鱼骨胶原肽磷酸化及其肽-钙螯合物的制备

利用三聚磷酸钠(STP)对鱼骨胶原肽(Fish bone collagen peptide,FBCP)进行磷酸化改性,优化FBCP磷酸化改性和其与钙螯合的工艺过程。结果表明,在3%FBCP、30%STP、pH 9、40℃、2 h条件下FBCP磷酸化程度最高,达到19.63 mg/g,磷酸化鱼骨胶原肽(PFBCP)的氮磷摩尔比为9.05。PFBCP的磷酸化程度越高,其钙螯合能力也越强。PFBCP在肽钙比为1∶1、pH 9、50℃、40 min条件下钙螯合能力最高,为89.96 mg/g。红外光谱分析表明,FBCP中的氨基、羟基参与了磷酸化改性,PFBCP通过磷酸基团、羧基和氨基与钙离子螯合。实验结果为鱼骨胶原肽-钙螯合物的制备提供理论依据。

从麦胚蛋白质中制备降血压肽的研究

用超临界CO2对小麦胚芽脱脂,碱溶酸沉淀法提取麦胚蛋白,用8种蛋白酶分别进行单一酶和复合酶水解麦胚蛋白生产降血压肽,用高效毛细管电泳(HPCE)测定其活性。碱性蛋白酶生产水解物的活性最大,其对麦胚蛋白作用的最适pH为9,温度为50～55℃,加酶量为24AU/kg,水解度为16.5%时所得水解物对ACE有强烈抑制用。

利用牡蛎制备ACE抑制肽的工艺优化

运用正交试验和响应面法优化牡蛎血管紧张素转换酶(angiotensin-Ⅰconverting enzyme,ACE)抑制肽的分步酶解制备工艺。采用复合蛋白酶和碱性蛋白酶对牡蛎进行分步酶解,以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析和ACE抑制率为考核指标优化工艺参数。结果表明,第1步复合蛋白酶最佳工艺参数为:料液比1∶4、加酶量1.2%、pH 7.0、反应温度50℃、酶解时间1 h;第2步碱性蛋白酶最佳工艺参数为:加酶量0.42%、pH 8.3、反应温度53℃、酶解时间73 min。凝胶过滤色谱法测得牡蛎酶解液分子质量在3 000 D以下小肽所占比例为99.72%,其ACE抑制活性IC50为0.8 mg/mL。同时,氨基酸组成分析表明,牡蛎肽中Glu含量最高,Cys含量最低;必需氨基酸和疏水性氨基酸含量分别占总氨基酸的36.6%和37.2%。本研究制备的低分子质量、高ACE抑制活性牡蛎肽,可为牡蛎资源的开发利用提供理论参考。

溶氧及pH对产朊假丝酵母分批发酵生产谷胱甘肽的影响

在 7L发酵罐中研究了溶氧和pH对产朊假丝酵母分批发酵生产谷胱甘肽的影响。结果表明 ,当葡萄糖浓度为 30g L且通气量控制在 5L min时 ,搅拌转速达到 30 0r min即可满足细胞生长和谷胱甘肽合成对溶解氧的需求。不同pH控制方式对谷胱甘肽分批发酵的影响有较大差异。不控制pH时 ,细胞干重和谷胱甘肽产量比控制pH为 5 5的发酵分别低 2 7%和 95 % ,且有 5 0 %的谷胱甘肽向胞外渗漏。研究了将pH控制在 4 0、4 5、5 0、5 5、6 0和 6 5的谷胱甘肽分批发酵过程 ,发现在pH 5 5时谷胱甘肽总产量最高。用前期研究建立的动力学模型模拟了不同pH (4 0～ 6 5 )下的分批发酵过程 ,并从动力学角度解释了pH对细胞生长和谷胱甘肽合成的影响。

环境条件及摇瓶补糖策略对谷胱甘肽发酵的影响

研究了酵母摇瓶发酵中ｐＨ、装液量、初糖浓度、碳氮磷比和补糖方式对谷胱甘肽（ＧＳＨ）发酵的影响。结果表明，ＧＳＨ发酵适宜的初始ｐＨ和装液量分别为６０和５００ｍｌ锥形瓶内装液量６０ｍｌ。初糖浓度对ＧＳＨ发酵有较大的影响，超过１２ｇ／Ｌ的初糖浓度将减少胞内ＧＳＨ含量。应用计算得出的一种以控制比生长速率为目的的摇瓶补糖策略，在总糖浓度为２６２ｇ／Ｌ下发酵１２ｈ，最终细胞浓度和胞内ＧＳＨ含量分别达到８７８ｇ／Ｌ和１３６ｍｇ／ｇ，发酵液内ＧＳＨ总量达到１１９４ｍｇ／Ｌ，细胞对糖产率达到０３３５ｇ／ｇ。

酶解海蜇胶原蛋白制备抗氧化肽工艺

为优化酶解海蜇胶原蛋白制备抗氧化肽的工艺条件,采用响应面分析法,研究了酶解温度,酶与底物的比值和pH值对此工艺的影响。以羟自由基清除率为响应值,最终确定温度47.3℃,酶与底物的比值2.8%和pH9.1。酶解液的羟自由基清除率为79.07%,与模型预测具有较好的拟合性。此工艺制备的酶解产物含有较高的疏水基氨基酸,相对分子质量主要分布在350～5000u之间,符合水解胶原蛋白的行业要求。