构建大肠杆菌合成生物群落利用混合糖同步发酵生产L-乳酸

目的:实现大肠杆菌混合糖发酵产L-乳酸过程中对葡萄糖-木糖的同步利用。方法:以L-乳酸工程菌大肠杆菌JH16(E.coli B,△frdBC△pflB△ackA△adhE,ldhA::ldhL)为出发菌株,通过RED同源重组技术敲除木糖转运及代谢基因xylFGH、xylE和xylA,获得不能利用木糖的菌株大肠杆菌JH16031。以大肠杆菌JH2705(E.coli JH16,△ptsG△mglB)为出发菌株,敲除葡萄糖转运及代谢基因crr、malX和galP,获得不能利用葡萄糖的菌株大肠杆菌JH27071,以构建大肠杆菌合成生物群落。通过摇瓶和5 L发酵罐试验确定该合成生物群落在混合糖发酵时较优的混合接种比例。结果:以60 g/L葡萄糖和40 g/L木糖为碳源进行发酵,当JH16031与JH27071初始接种比为1∶50,初始OD_(600nm)=0.5,混合糖的利用率最高,在84 h内消耗97%的糖,并在96 h内结束发酵。葡萄糖消耗速率为705 mg/(L·h),木糖消耗速率为435 mg/(L·h),L-乳酸产率为951 mg/(L·h),L-乳酸产量达到92 g/L,糖酸转化率为91%。结论:构建大肠杆菌合成生物群落可实现利用混合糖发酵产L-乳酸过程中葡萄糖和木糖的同步利用。研究结果为工业发酵生产中,使用低成本的木质纤维素为原料,降低发酵成本,提高混合糖利用率提供技术支持。

利用竹基纤维素为碳源生物转化L-乳酸的潜力研究

以竹材制浆厂备料工段产生的废弃竹屑为原料,采用蒸汽爆破预处理且提取半纤维素后的竹基纤维素为碳源,同时对预处理前后竹屑采用扫描电子显微镜&能谱仪和激光粒度分析仪进行表征;用分步水解发酵工艺,结合高效液相色谱对发酵L-乳酸工艺关键参数进行了分析,探究了该碳源生物转化L-乳酸的潜力。结果表明,蒸汽爆破预处理提高了原料酶解还原糖释放量,在总固体(total solids,TS)质量浓度140 g/L、酶添加量60 FPU/g、酶解54 h条件下糖化,总糖质量浓度可达31.19 g/L。将糖化液用于发酵试验,在起始糖质量浓度19.43 g/L,发酵初始pH 6.5、菌株接种量5%、发酵17 h条件下,L-乳酸质量浓度可达6.28 g/L,其糖酸转化率高达80.87%。综上,该实验为竹基纤维素的利用提供了高值化途径参考。

强化厌氧表达dld基因以提高大肠杆菌工程菌发酵产L-乳酸的光学纯度

为去除廉价发酵原料中的D-乳酸从而提高发酵最终产物L-乳酸的光学纯度,该研究通过构建带有不同厌氧诱导启动子(pflBp6、pnirB、pflBp6-pnirB)的D-乳酸脱氢酶基因(dld)的表达质粒,并将其分别转入大肠杆菌(Escherichia coli)HBUT-L,加强其在发酵产L-乳酸的同时消除外源D-乳酸的能力。通过装液量与转速的单因素试验筛选最优的质粒表达条件及菌株,并在无机盐培养基与玉米浆培养基中进行发酵验证。结果表明,在装液量为200 mL/250 mL、转速为150 r/min的条件下,含有启动子pflBp6-pnirB的表达质粒的工程菌株HBUT-L4发酵18 h时D-乳酸脱氢酶活力最高,为81.1 U/g。在此条件下进行无机盐培养基和玉米浆培养基发酵时,工程菌株HBUT-L4相对于出发菌株HBUT-L,D-乳酸消耗速率分别提高250%、217%,L-乳酸的光学纯度分别从96.32%、98.48%提升至99.95%、99.98%。在大肠杆菌工程菌发酵L-乳酸的过程中,带有厌氧诱导启动子pflBp6-pnirB的表达质粒可提高D-乳酸脱氢酶活力,强化菌株消除外源D-乳酸,进而提高L-乳酸的光学纯度的能力,具有重要的工业化应用价值。

餐厨垃圾发酵产乳酸菌种的筛选、鉴定及应用

从餐厨垃圾有机肥样品中筛选能够发酵餐厨垃圾产乳酸的菌株。经过平板分离纯化、形态观察及生理生化鉴定,获得了6株形态各异的单菌株。通过比较各菌株对温度、盐度和酸碱度的耐受性,最终确定M4、M5和M6为潜力菌株。经过分子生物学鉴定,确定菌株M4、M5和M6分别为乳酸片球菌、干酪乳杆菌和植物乳杆菌。将这3株菌株等比例制成复合菌剂作为菌种与枯草芽孢杆菌混合接种用于餐厨垃圾乳酸发酵实验,发现该复合菌剂能明显提高乳酸产量(约63.6%),且缩短发酵时间(约1/3)。该复合菌剂可用于餐厨垃圾处理工业,具有良好的应用前景和经济价值。

用乳酸细菌从有机废弃物生产乳酸

探讨了有机废物乳酸发酵的影响因素,包括菌种、营养物质、产物抑制、氧气和发酵方式,概述了利用含碳水化合物的有机废弃物和厨房垃圾生产乳酸的现状,并对未来的研究方向提出了展望。指出在厌氧条件下应用同型发酵乳酸细菌,采用原位产物分离技术和细胞再循环发酵通常会提高乳酸的产量;采取多菌种的联合发酵并优化提取工艺,将有助于实现有机废物工业化生产乳酸。

对羟基联苯法定量测定发酵液中的乳酸

对传统的对羟基联苯法进行了优化,应用于定量测定发酵液中的乳酸。首先对发酵液进行适当预处理,去掉蛋白质和葡萄糖,再利用正交设计对影响显色的几个重要因素进行了优化,结果表明,最佳测定波长为565nm;最佳显色条件为氢氧化钙0.05g,20%硫酸铜0.8ml,浓硫酸6ml,0.5%对羟基联苯0.125ml,静置时间15min,加热显色时间5min。标准曲线回归方程为A=0.0189C-0.0808(n=8),r=0.9989。在15～50μg/ml范围内呈良好线性关系。平均回收率为102.4%。显色稳定保持2h以上,RSD为2.6%(n=12)。该方法解决了传统对羟基联苯法显色时间长、准确度不高等问题,适合于发酵液中乳酸含量的测定。

产γ-氨基丁酸的乳酸菌株筛选及诱变

γ-氨基丁酸(-γaminobutyric acid,GABA)是中枢神经系统一种重要的抑制性神经递质。本研究从鲜奶中分离得到1株高产GABA的乳酸菌株hjxj-01,经初步鉴定为短乳杆菌。实验结果表明,在含5%的L-谷氨酸钠的GYP培养基中,此乳酸菌产GABA最大积累浓度为7 g/L。在此基础上,又先后使用了紫外线和γ射线对出发菌株进行了诱变处理。以正突变率为标准确定诱变条件。30W的紫外灯下,距离45cm照射及照射时间50 s为紫外线诱变的较佳条件;60Co射线诱变的适宜剂量为300 Gy。诱变后得到1株突变菌株hjxj-08119,经连续传代12次,遗传性状稳定,平均GABA产量达到17 g/L,较出发菌株hjxj-01提高142.9%。

乳酸纯化连续离交系统及工艺优化研究

L-乳酸通常采用离子交换树脂进行脱杂。间歇性的固定床操作树脂利用率低、再生剂及水耗高等劣势。本文旨在将高效的连续离子交换系统及杜邦公司的树脂AMBERLITETMFPC23UPS H及AMBERLITETMFPA55引入乳酸生产,重点研究了阳、阴树脂的杂质脱除率及处理能力,工业系统参数的调整、优化展现了连续离交树脂利用率高、出液品质稳定、收率高、成本低等优点。

细菌L-乳酸发酵的研究——响应面分析法(RSA)优化培养基及控氧研究

用响应面分析法(中心组合设计)对乳酸菌LB-1生产L-乳酸的培养基中三个主要组分(大米糖化液、玉米浆、番茄汁)进行了优化,建立了影响因素与响应值(L-乳酸产量)之间的函数关系,得到一个回归方程。根据回归方程寻优得出,当大米糖化液为13.23g/L、玉米浆浓度为13.9ml/L、番茄汁浓度为11.8ml/L时,L-乳酸产量能达到最高并且稳定。此外,还对发酵中的不同控氧发酵方式进行了较细致的研究,结果表明,兼性厌氧的乳酸菌发酵L-乳酸同样需要控氧,而且控氧对L-乳酸产量有相当大的影响。

EDTA定钙法测定发酵液中乳酸含量的探讨

EDTA定钙法是目前测定发酵液中乳酸含量的主要方法。本文采用对照乳酸结合高效液相色谱法对该方法的测定条件进行了研究。结果表明,发酵液中的乳酸必须预先用过量的CaCO3中和,再用NaOH调节pH至12.0以上,以钙黄绿素为指示剂时,测定结果的重复性和回收率较好。HPLC法与EDTA定钙法测定结果比较,发现EDTA定钙法测定的乳酸含量偏大,但可通过适当校正用于生产过程检测。

固定化米根霉电渗析发酵生产L－乳酸的研究

研究了海藻酸钙包埋法固定米根霉在三相流化床反应器中电渗析发酵生产Ｌ—乳酸的工艺。实验结果表明，采用电渗析可及时除去发酵过程中生成的Ｌ—乳酸，解除产物抑制。使发酵得以继续进行。间歇电渗析发酵产酸速率为８～１１ｇ／（Ｌ颗粒·ｈ），得率０．６９９／ｇ。连续补料电渗析发酵产酸速率１３．０ｇ／（Ｌ颗料·ｈ），得率０．７４９／ｇ。

三相流化床L-乳酸发酵及与离子交换分离耦合

L—乳酸因其能被人体代谢而将在食品、医药工业中代替DL—乳酸。另外均聚和共聚L—乳酸在医学及生产可生物降解的包装材料、农膜等方面有巨大的潜在市场。

细菌发酵生产L-乳酸高产菌株的选育

本文利用紫外线诱变方法 ,对出发菌株干酪乳杆菌YBQ1- 1进行诱变处理 ,以CaCO3 -溴甲酚紫平板、高锰酸钾 -溴化钾平板、高糖平板、乳酸梯度平板、纯乳酸平板进行筛选 ,最后得到一株正向突变株YBQH2 -14 ,其L -乳酸产量达到 93g/L ,对糖转化率达到 77.5 % ,比出发菌株产酸提高 4 8.5 %。

鼠李糖乳杆菌利用甘薯废渣发酵产乳酸的研究

【目的】研究鼠李糖乳杆菌发酵甘薯淀粉加工废渣生产乳酸的工艺条件,为薯渣的治理和利用提供新的技术思路。【方法】使用元素分析仪对甘薯淀粉废渣中的主要元素进行分析测定,同时,在以菌体OD值法确定的鼠李糖乳杆菌的生长对数期内分别取不同时间点设置4组乳酸发酵试验,以该菌利用葡萄糖液体培养基产乳酸的发酵效率为考察指标确定该菌的乳酸发酵最适种龄。在此基础上,利用鼠李糖乳杆菌对甘薯废渣直接进行固体发酵:采用单因素试验方法分别考察接种量、发酵温度、碳酸钙添加量,以及外加氮源对乳酸发酵效率的影响;此外,考察外加氮源对发酵结束后薯渣固体发酵醪中的生物量的影响;结合正交试验设计,得到影响薯渣发酵产乳酸因素的最优组合。【结果】元素分析结果显示甘薯淀粉废渣是一种高C、H含量的生物质,其干渣中C、H元素质量百分含量分别达40.34%、6.16%,而N元素质量百分含量仅为0.32%,虽C元素含量丰富,但N元素相对匮乏,需要外加氮源方可进一步促进其生长代谢。通过菌体OD值法确定的鼠李糖乳杆菌的生长曲线显示,菌体接入2 h后OD值迅速增长,菌体生长进入对数期。8 h后OD值基本不变,菌体进入稳定期。确定了种子的对数生长期在2—8 h。在该时间区间内以4 h龄种子的乳酸发酵效率最高,达92.39%,对应残糖浓度最低,为0.59 g·L^(-1),确定4 h是鼠李糖乳杆菌乳酸发酵的最适种龄。薯渣固体发酵中分批单因素试验结果依次为:接种量在10%时发酵效率达最高,为83.87%;发酵温度在37℃时发酵效率最高,达85.55%;Ca CO_3添加量在5%时发酵效率达最大值,为90.24%;4种无机氮源中尿素组发酵效率达91.01%;尿素在0.8%添加量下发酵效率最大值为94.13%,同时发酵醪中活菌数达4.32×10~8 cfu/g。依据以上单因素试验结果,Ca CO_3适宜添加量为5%,与中和发酵体系中初始糖(10%)产生的乳酸所需的理论添加值相符,故以5%作为其固定添加量,不再列入正交试验的考察范围。此外,加入了纤维素酶作为考察因素,确定正交试验因素与水平,开展四因素三水平的正交试验,最终确立了最适薯渣发酵条件:接种量10%、尿素添加量0.8%、纤维素酶含量0.4%、发酵温度35℃、碳酸钙添加量5%,在该条件下发酵效率可达(96.55±0.866)%,发酵醪中活菌数达3.04×10~8 cfu/g。【结论】建立了低成本、简工艺、高效率的甘薯废渣发酵生产乳酸工艺。该工艺不仅适于工业化生产乳酸,同时易于被广大甘薯淀粉加工农户利用。

有机溶剂萃取法提取乳酸

通过对萃取剂和稀释剂的筛选，确定了一个萃取相组成为５０％三烷基氧化膦（ＴＲＰＯ）／５０％磺化煤油的乳酸萃取体系．对萃合机理的研究表明，ＴＲＰＯ萃取乳酸的可能萃合物结构式为ＬＡ·ＴＲＰＯ．对乳酸萃取过程的各种影响因素进行了考察，从而得到了最佳操作条件．

玉米生粉发酵生产L-乳酸的研究

研究了以α 淀粉酶为主的多种酶配合作用对玉米生粉乳酸发酵的影响。添加纤维素酶、酸性蛋白酶和脂肪酶能够加强液化酶和糖化酶对玉米生粉的水解作用 ,提高产酸水平和底物利用率。各种酶的最适添加量为α 淀粉酶 :8u/g干淀粉 ;纤维素酶 :5u/g原料 ;酸性蛋白酶 :2u/g原料 ;脂肪酶 :1u/g原料。在此条件下 ,当玉米粉初始浓度为 14 0g/L时 ,摇瓶产酸 6 5 .72 g/L ,发酵罐中产酸可达 71.6 5 g/L ,达到并超过高温蒸煮乳酸发酵的水平。同时研究了底物浓度对产酸的影响。

高效液相色谱法测定米根霉乳酸发酵液中乳酸的光学纯度

以 2 ,3,6 三甲基 β 环糊精作手性流动相添加剂 ,C18柱为固定相 ,考察了流动相的pH和手性流动相添加剂浓度对乳酸对映体分离度的影响 ,建立了DL 乳酸的拆分定量分析方法。用归一化法分析DL 乳酸时引入了定量校正因子 ,确定了外标法测定L 乳酸的回归方程、精密度和回收率。测定了米根霉L 乳酸发酵液中D 型异构体的质量分数及其随放置时间的变化情况。

菜籽饼粕水解液为氮源细菌发酵产L-乳酸的发酵培养基优化

从降低L-乳酸生产成本和提高菜籽饼粕综合利用的角度考虑,尝试菜籽饼粕水解液为氮源利用细菌发酵产L-乳酸,在单因素及均匀试验的基础上,建立BP神经网络模型,并运用遗传算法对模型进行寻优,得出的发酵培养基最佳配方简化了培养基组成(g/L):葡萄糖110.43,菜籽饼粕(干重)水解液87.78,玉米浆21.18,柠檬酸氢二铵2.85,L-乳酸产量提高了9.30%。

高产L—乳酸米根霉RE3303菌株特性研究

为了获得更适于工业生产的产乳酸菌株，采用低能离子诱变方法，对出发菌米根霉PW352进行改良，获得高产L(+)—乳酸菌株RE3303，发酵周期为36h，产酸能力达131～136g／L，最高可达140g／L，体积产酸速率达3．61g／(L·h)，产率为86％～90％，产酸比PW352提高75％。

不同通气条件下米根霉发酵产L-乳酸的代谢调控

研究了不同摇瓶条件对米根霉发酵体系中乳酸脱氢酶(LDH)与乙醇脱氢酶(ADH)的酶活变化,以及乳酸和乙醇转化率的影响,结果表明:当装液量从10%增加到30%,乳酸的质量浓度及相应的LDH活力呈下降趋势,而乙醇质量浓度及ADH活力随着装液量的增加而提高。摇床转速为220r/min时,乳酸质量浓度最大,对应的LDH活力也最大;摇床转速为160r/min时,乙醇质量浓度与ADH活力较高。单膜封口发酵乳酸质量浓度与LDH活力分别比双膜封口发酵提高64.4%和49.9%,而双膜封口发酵时,乙醇最大质量浓度与最大ADH活力分别比单膜封口发酵提高30.0%和25.5%。