猪丹毒杆菌SpaA优势表位的串联表达及其免疫效果分析

构建串联SpaA优势表位的猪丹毒亚单位疫苗,对其免疫原性进行研究。将猪丹毒杆菌表面保护抗原A优势表位串联表达,提取并经亲和层析纯化获得重组蛋白,制备亚单位疫苗,分别免疫小鼠和猪,21日后攻毒。成功制备串联SpaA优势表位的猪丹毒亚单位疫苗,2μg重组蛋白可为小鼠抵抗1000MLD强毒攻击提供100%保护,100μg重组蛋白可为猪抵抗1MLD强毒攻击提供100%保护,可为猪抵抗2MLD强毒攻击提供67%保护。串联SpaA优势表位的猪丹毒亚单位疫苗具有良好的免疫原性。

兽用化学药品血药浓度法生物等效性试验注册资料技术评审要点及常见问题

生物等效性试验作为兽药获批上市的关键试验,其研究过程和技术评审都要遵循特定的法规和指导原则。以药动学参数为终点的血药浓度法生物等效性试验是目前普遍采用的研究方法,适用于药物活性成分吸收进入体循环具有全身作用的剂型(大多数内服剂型和特殊注射剂)。本文根据生物等效性定义、相关法规和指导原则,结合近年来新兽药注册资料,对血药浓度法生物等效性试验资料的技术评审要点及常见问题进行梳理,旨在为新兽药的研发和注册提供参考。

离子色谱法测定酒石酸沃尼妙林中酒石酸的含量

建立离子色谱-抑制电导检测法测定化学对照品中酒石酸盐的含量。以酒石酸沃尼妙林对照品为例,采用Dionex IonPac^(TM) AS19(4×250 mm)阴离子交换色谱柱和Dionex IonPac^(TM) AG18(4×50 mm)保护柱,以22 mmol/L氢氧化钾溶液为流动相,流速为1.0 mL/min等度洗脱,抑制电导检测器检测,测定酒石酸盐中酒石酸的含量。结果表明,该方法在1.0~50μg/mL浓度范围内线性关系良好(r=0.999),定量限为0.5μg/mL,酒石酸沃尼妙林在3个水平的加样回收率分别为98.79%、98.91%与96.50%,平均回收率为98.07%(RSD=2.20%,n=9)。用此方法测定3个厂家共5批样品,酒石酸沃尼妙林中酒石酸含量的数值与理论值基本一致。本文建立的离子色谱法准确、灵敏,可用于酒石酸盐成盐比例与含量的测定。

关于兽药生产企业执行GMP过程中质量管理薄弱环节的几点思考

本文从质量管理理念的发展与新版兽药GMP要求出发,剖析了目前兽药生产企业在质量管理理念、质量管理和质量控制力量及水平、GMP管理文件的执行、风险意识等方面的问题,提出了兽药生产企业应从强化质量管理理念、重视发挥QA和QC的作用、针对新版GMP要点和难点切实开展工作和真正建立风险管理机制方面切实采取措施,希望能借此帮助兽药生产企业完善质量管理,保证兽药GMP要求落实到位,推动兽药行业的高质量发展。

气肿疽梭菌C54-1株的制备与检定

为研究气肿疽梭菌C54-1株(CVCC60001)的菌种特性,制备了1批气肿疽梭菌C54-1株,并对菌种的形态及生化特性、培养特性、血清学特性、真空度、纯粹、剩余水分、毒力及免疫原性、16S rDNA等进行检定,以及对于该菌的适宜培养基促生长能力等方面进行了比较。实验结果表明,该冻干菌种的形态及生化特性、培养特性、血清学特性、真空度、纯粹、剩余水分、毒力及免疫原性均符合《中华人民共和国兽用生物制品规程》二〇〇〇版质量标准的规定。16S rDNA鉴定为气肿疽梭菌,相似度为99.93%。在免疫原性检定中,使用致死剂量攻毒时,免疫组能够4/4被保护,证明该菌明矾苗免疫效果良好。使用商品化梭菌培养基对于该菌培养进行了比对,证实商品化培养基替代厌气肉肝汤的可能性。本研究为气肿疽梭菌的制备和检定提供参考依据,并使用不同培养基进行比对研究,为该菌的稳定培养和疫苗工艺改进提供了研究基础。

高效液相色谱-串联质谱法检测牛组织和奶中咪多卡残留的研究

建立了一种检测牛组织和牛奶中咪多卡残留检测的高效液相色谱-串联质谱法。牛组织(肌肉、肝脏、肾脏、脂肪)和奶在NaAc缓冲体系中酶解,经HCl溶液提取,WCX固相萃取柱净化,以0.3%甲酸水溶液(含20 mM甲酸铵)和0.3%甲酸乙腈为流动相进行梯度洗脱,在HILIC色谱柱上分离,在电喷雾正离子(ESI^(+))模式下,用多反应监测(MRM)模式检测,同位素内标法定量。结果表明:咪多卡在2.5~1000 ng/mL的浓度范围内呈现良好线性关系,相关系数(R^(2))大于0.99;咪多卡在牛组织和奶中的检测限均为10μg/kg,定量限均为20μg/kg;咪多卡在牛组织和奶中20~4000μg/kg添加浓度水平上的回收率在70.9%~109%范围内;批内RSD在0.55%~9.59%之间,批间RSD在2.21%~12.1%之间。该方法具有灵敏度高、定量准确,重复性好等特点,可以满足牛组织和奶中咪多卡残留检测的要求。

我国限制使用的兽药在食品动物中的残留概况

从我国食品动物禁用、停用、特定时期不得使用以及允许使用但不得检出等层面,对我国兽药使用的限制、相关残留检测方法标准适用范围以及相关问题的分析和建议进行综述,以期为养殖业规范用药、食品安全监管部门政策制定和调整、科研机构针对不得检出兽药残留标准相关研究的开展提供参考。

我国禽用生物制品现状及禽用病毒类生物制品质量情况分析

对我国禽用生物制品基本现状及2013-2022年禽用病毒类生物制品的质量情况进行总结,分析存在的问题,提出强化SPF鸡(鸡胚)质量控制、持续开展风险监测方法研究、完善禽用标准物质、推动禽用新型生物制品研制的建议。

超高效液相色谱-串联质谱法检测畜禽肉中199种药物及代谢物残留

建立了一种可检测猪肉、鸡肉、牛肉和羊肉四种畜禽肉中199种药物及代谢物残留的超高效液相色谱-串联质谱法。样品经Mcllvaine-Na_(2)EDTA缓冲液和2%甲酸乙腈溶液提取后,高速离心去除蛋白质等杂质,用captiva EMR-Lipid小柱净化。以0.1%甲酸乙腈溶液和0.1%甲酸溶液为流动相洗脱,在C_(18)色谱柱上分离。ESI离子源正负离子模式同时扫描,并采用多反应监测模式(MRM)检测,基质匹配标准溶液外标法定量。结果表明:各药物及代谢物在空白猪肉、鸡肉、牛肉和羊肉基质匹配系列浓度范围内均呈现良好的线性关系,相关系数(r)均大于0.990;在4种基质中的定量限范围在0.5~20μg/kg之间;在定量限~200μg/kg添加浓度上的回收率范围为60%~120%,批内与批间相对标准偏差均小于20%。该方法具有简便快捷、选择性好、定性准确,重复性好等特点,可进行多种类药物及代谢物残留的同步处理和同时检测。对提高实际样品检测工作效率,更好的确保动物性食品安全,保护人类健康具有重要意义。

牛支原体NM001株单克隆抗体的制备与鉴定

为获得抗牛支原体NM001株单克隆抗体,并评价其特性,以牛支原体分离株NM001作为抗原免疫6周龄BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术和间接ELISA方法筛选到2株能稳定分泌抗牛支原体的单克隆抗体细胞,命名为2C5和7G3。其细胞上清的间接ELISA抗体效价分别为6.4×10^(3)和1.2×10^(4)。经亚型测定,单抗2C5和7G3均属于IgG1类,轻链均是λ型。制备腹水并对单抗进行纯化和特性鉴定,两株单抗的间接ELISA抗体效价分别为1.02×10^(5)和4.09×10^(5),且两株单抗与无乳支原体、山羊支原体山羊肺炎亚种、丝状支原体山羊亚种、绵羊肺炎支原体、牛巴氏杆菌均无交叉反应。Western Blot结果显示,2株单抗均能特异性识别牛支原体全菌蛋白中的相应蛋白。试验表明,单抗2C5和7G3能够与牛支原体发生特异性反应,从而为牛支原体血清学检测提供一定的物质基础。

猪圆环病毒2型疫苗及其效力评价方法比较研究

为探索对不同猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type2,PCV2)疫苗产品进行统一质量评价的可行性,对国内该类疫苗产品及其现有效力评价方法进行了归纳和比较研究。结果发现,目前猪圆环病毒2型疫苗类产品种类有25个,且疫苗毒株数量多达10余个,效力检验方法包括传统的免疫攻毒法、血清学方法和多种不同的替代方法,但尚没有统一的效力评价体系。本研究可为进一步完善PCV2疫苗效力评价方法、统一评价疫苗效力、提高产品质量提供参考。

卡洛芬注射液对靶动物奶牛安全性试验研究

为研究卡洛芬注射液对靶动物奶牛的安全性,将20头健康奶牛随机分为4组,每组5头,各组试验奶牛分别按0、1倍推荐剂量(1.4 mg/kg B.W.)、3倍推荐剂量(4.2 mg/kg B.W.)、5倍推荐剂量(7.0 mg/kg B.W.)单剂量皮下注射卡洛芬注射液,连续给药3 d。试验期间观察记录各组奶牛的饮食、精神、粪便情况及试验前后的体重变化,测定给药前、给药后第1天及给药后第3天各组奶牛的血液生理生化指标,同时在给药后第3 d进行剖检,测定脏器指数,观察病理及组织学变化。结果显示,卡洛芬注射液各剂量组奶牛的临床体征、血液生理生化指标、剖检及组织显微结构等均未见明显异常,未出现中毒症状及死亡。与对照组相比,3倍剂量组和5倍剂量组血液生理指标中血小板平均宽度差异显著(P<0.05),5倍剂量组血液生化指标白蛋白数量明显增加(P<005),但所有指标均在正常范围内波动。结果表明,卡洛芬注射液在临床上推荐以1.4 mg/kg B.W.给药对靶动物奶牛是安全的。

动物mRNA疫苗生产厂房布局与工艺设计要点探究

mRNA疫苗技术具备研发周期短、安全性优良、生产技术通用性强的特点,但由于mRNA疫苗的特殊工艺,传统的生物制品厂房设计已不能完全满足其制备要求。科学合理的厂房工艺设计是确保mRNA疫苗产能与质量的主要条件,因此,如何设计既符合工艺要求又满足兽药GMP的动物mRNA疫苗生产厂房成为摆在我们面前急需探究的课题。鉴于不同国家在能源结构、环保要求、设计理念等方面存在差异,在借鉴欧美已有的mRNA疫苗规模化生产设施和我国人用mRNA疫苗厂房设计的基础上,提出了符合我国兽药GMP规范的mRNA疫苗厂房生产设施、工艺关键点和设计方案,以期为国内动物mRNA疫苗车间建设提供参考。

兽用中药制剂工艺的传承与创新

为了推动兽用中药制剂工艺的传承与创新发展,本文在总结中兽医方剂传承基础上,研究兽用中药粉碎与超微粉碎、提取等现代工艺发展,剖析中药制剂剂型定位及生产投料存在的问题,探索兽用中药制剂工艺传承创新导向和途径,对《中国兽药典》制剂通则提出修改建议,为兽用中药制剂研究和2025年版《中国兽药典》编撰提供参考。

细菌内毒素检查法评审要点与注册资料常见问题分析

通过梳理细菌内毒素检查法建立的关键步骤,对细菌内毒素限值制定、MVD或MVC的计算、实验材料、实验过程和质量标准等涉及的评审要点进行了归纳总结,对评审过程中发现的常见问题进行了分析,以期为新兽药生产企业制定相应产品的细菌内毒素检查方法提供参考。

一株鸡传染性贫血病毒对不同日龄SPF鸡的致病性研究

为评价鸡传染性贫血病毒AV1550株的致病性,取1日龄、7日龄和14日龄SPF鸡分别经胸部肌肉注射不同病毒含量的病毒液,同时设置正常对照,隔离饲养观察21 d。感染后14 d采血测定红细胞压积,21 d统计死亡率、体重变化以及胸腺、骨髓、法氏囊病变情况并测定1日龄SPF鸡感染后不同组织中的病毒载量。结果表明,1日龄SPF鸡感染AV1550株后,表现出精神沉郁、增重减缓、贫血等明显的临床症状,死亡率为53.9%;死亡鸡或观察期结束时存活鸡剖检,可见胸腺萎缩,骨髓变成淡黄色;不同剂量感染后14 d,均能引起红细胞压积显著下降;21 d时,胸腺病毒载量最高,可达10^(6.7) copies/mg。7日龄SPF鸡感染后,出现增重减缓,高感染剂量(100000EID_(50))出现贫血,部分鸡出现胸腺萎缩和骨髓病变,但病变率低于30%。14日龄SPF鸡感染后,不引起明显临床症状。研究证实,CAV对SPF鸡的致病性具有明显的日龄依赖性,红细胞压积降低、骨髓病变、胸腺萎缩以及胸腺病毒载量测定可作为评价CAV致病的指标。

羊链球菌CVCC55001、CVCC55002株对昆明小鼠的致病性研究

为研究羊链球菌CVCC55001、CVCC55002株对昆明系(KM)小鼠的致病性,使用羊链球菌CVCC55001、CVCC55002株分别对昆明小鼠进行毒力测定,观察临床和剖检症状,对死亡小鼠进行细菌分离培养,并对典型菌落进行形态、生化特性以及PCR鉴定。毒力测定结果显示CVCC55001对于昆明小鼠的最小致死剂量为9 CFU,CVCC55002对于昆明小鼠的最小致死剂量为11 CFU。感染羊链球菌死亡小鼠主要剖检症状为肝脏出血、肠道液化性坏死、脾脏肿大,病理变化为肝细胞出现大量坏死、肠道黏膜层广泛自溶、脾脏组织广泛坏死出血。本研究建立了羊链球菌CVCC55001、CVCC55002株的昆明小鼠攻毒感染模型,确定了最小致死剂量,对羊链球菌感染和致病性研究展开初步探索,为疫苗研究及评价提供了平台支撑。

分光光度法与活菌计数法测定副鸡禽杆菌菌液浓度的相关性研究

为建立一种快速测定副鸡禽杆菌菌液浓度的方法,本研究选取副鸡禽杆菌血清A、B和C型代表性菌株(CVCC254株、CVCC257株和CVCC256株),培养制备菌液,分别在450、540、600、650 nm波长测定其吸光度值(OD值),同时测定活菌计数值。回归分析两组数据,获取回归方程及标准曲线,分析回归方程的测定系数(R^(2))和标准曲线的点线离散度,确定最适测定波长。再选取不同培养时间点(10、12、14、16、18、20 h)的菌液,在最适波长下测定其OD值并代入回归方程获取活菌数,同时采用活菌计数法获取活菌计数值,将两组数据使用SPSS 17.0软件进行统计分析,进一步验证分光光度法与活菌计数法测定菌液浓度的相关性。结果显示,3株菌液在600 nm波长测定的OD值与活菌计数值之间均呈最佳的线性关系,确定其菌液浓度最适测定波长均为600 nm,其回归方程分别为y=14.302x-0.1441(R^(2)=0.9962)、y=14.464x-0.2746(R^(2)=0.995)和y=14.681x-0.01326(R^(2)=0.9989),y为活菌计数值(×10^(8)CFU/mL),x为OD600值。3株培养至衰退期前的菌液在600 nm波长测定的OD值代入回归方程计算获得的活菌数值与其活菌计数值无显著差异(P>0.05)。研究结果表明,衰退期前副鸡禽杆菌菌液的分光光度法与活菌计数法具有良好的相关性。因此,该分光光度法可用于快速测定衰退期前副鸡禽杆菌菌液浓度。

犬PD-1单克隆抗体的筛选与鉴定

为筛选犬程序性死亡受体1(cPD-1)单克隆抗体,以原核表达并纯化复性的cPD-1胞外区蛋白为靶抗原免疫BALB/c小鼠,应用单克隆抗体杂交瘤细胞技术和间接ELISA方法,经3轮轮筛选和克隆化,获得1株能稳定分泌抗cPD-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株1F9。间接ELISA检测显示1F9杂交瘤细胞株连续传代培养能稳定分泌单克隆抗体,效价达到1∶2048,亚型鉴定重链为IgG1,轻链为κ;以HEK293细胞表达cPD-1胞外区蛋白为检测抗原,Western-blot和间接免疫荧光试验进行鉴定,结果显示1F9单克隆抗体能特异性结合cPD-1胞外区蛋白。本研究通过小鼠杂交瘤技术成功筛选到1株鼠源cPD-1单克隆抗体。

蛋鸡兽用抗菌药使用减量化养殖现状与研究对策

不合理使用抗菌药严重威胁到蛋鸡养殖健康,引起鸡蛋中药物残留和细菌耐药性产生风险,影响鸡蛋食品安全和公共卫生安全。本文基于我国自2018年起开展的涵盖蛋鸡养殖的兽用抗菌药使用减量化行动,从蛋鸡养殖的减量化现状、问题、对策等方面进行综述,以期为推动蛋鸡兽用抗菌药使用减量化养殖提供参考。