中国人TTV部分基因的克隆及序列测定

目的：了解我国人群中是否存在ＴＴ病毒（ＴＴＶ）感染，分析国内ＴＴ病毒株基因结构特点。方法：用ＰＣＲ方法检测血清标本中ＴＴＶＤＮＡ，对ＴＴＶＤＮＡ阳性的标本进行序列测定。结果：１０例临床诊断为非甲至非戊型肝炎病人血清标本中，用ＰＣＲ方法检测出５例为ＴＴＶＤＮＡ阳性。将其中的一株命名为ＴＴＶＣＨ１（ＴＴＶ中国株１）并进行序列测定，该序列与日本ＴＴＶ部分基因（ＣＬＯＮ２２）相对应位置的核苷酸同源性为９８％。用ＢＬＡＳＴ程序检索了ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＰＤＢ序列库的３３２９４９个序列数据，没有发现与之有明显同源性的序列；与已知的肝炎病毒（Ａ至Ｇ）也没有明显的相关性，而只同日本报道的部分基因有很高的同源性。结论：该研究建立了检测ＴＴＶ的ＰＣＲ方法并测定了ＴＴＶ中国株的部分基因序列，首次证实在我国人群中存在ＴＴＶ的感染。

大鼠急性痛风性关节炎模型的建立及特点

目的:建立急性痛风性关节炎动物模型,探索尿酸钠(monosodium urate, MSU)晶体的最佳诱导条件及炎症反应特点.方法:以改进方法制备MSU晶体,通过Wistar大鼠单侧踝关节注入50 μl不同浓度的MSU晶体诱导急性单关节炎,研究关节炎性变化与注入MSU剂量的关系;观测诱导关节炎后不同时间点的炎症指数、肿胀指数和功能障碍指数变化.结果:改进制备的MSU晶体呈骨针形,大小一致.5 mg/ml的MSU可导致明显的关节红肿.5～20 mg/ml范围内,关节红肿和功能障碍严重程度呈剂量依赖性增加,超过20 mg/ml后关节炎的严重程度不再随MSU注射用量的增加而加重,但可延长关节炎病程,并见关节腔内MSU晶体被大量蛋白样物质和炎性细胞包裹.将20 mg/ml的MSU注入大鼠踝关节可见迅速出现关节红肿和功能障碍,发生率100%;诱导后2 h出现,4 h表现明显,8～12 h达高峰期,24 h后自发减轻,5～6 d自行缓解;关节炎高峰期见三足步态,组织严重水肿,关节腔明显积液;关节液、关节滑膜及其周围组织见大量炎性细胞浸润,较好地模拟了人急性痛风性关节炎的病变特点.结论:改进方法制备的晶体提高了实验可重复性,并可成功诱导典型的大鼠急性关节炎.MSU剂量以每个踝关节20 mg/ml×50 μl为最佳.该模型适合于痛风的相关实验研究.

P53,Bax,Bcl-2蛋白表达及细胞凋亡在急性放射性皮肤溃疡发生发展过程中的作用探讨

目的 :研究细胞凋亡及一些凋亡相关基因 (p53,bcl 2 ,bax)的表达在急性放射性皮肤溃疡发生发展过程中的作用。方法 :采用Wistar大鼠以6 0 Coγ射线进行局部照射 ,建立急性放射性皮肤溃疡动物模型 ,观察病变 4 0d ,然后采用免疫组化方法检测皮肤溃疡组织中P53,Bcl 2 ,Bax蛋白表达 ,并采用原位末端标记法 (TUNEL)检测细胞凋亡。结果 :照后 14d照射野内开始出现皮肤溃疡 ,之后逐渐扩大、融合、加深 ;照后 11～ 4 0d ,P53蛋白表达明显增强 ,主要定位于血管内皮细胞和小血管平滑肌中 ;照后 14～ 2 1d为Bax蛋白表达高峰 ,之后逐渐减弱 ,主要定位于血管内皮细胞、部分成纤维细胞及新生表皮细胞中 ;Bcl 2则在照后 1～ 11d呈弱或中度阳性 ,定位于表皮、毛囊上皮及血管内皮中 ,之后为阴性或可疑阳性 ;照后 11～ 35d ,上述细胞特别是血管内皮细胞凋亡率较正常伤口愈合早期增高。结论 :辐射诱导的P53,Bax ,Bcl 2表达的变化及细胞凋亡率特别是血管内皮细胞凋亡率的增高与放射性皮肤溃疡发生、发展及难愈合 (不能形成有效肉芽组织 )

中国人庚型肝炎病毒（HGV）部分基因的克隆和cDNA序列测定

中国人庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）部分基因的克隆和ｃＤＮＡ序列测定周育森王海涛唐时幸王竟陈薇赵秋敏张习坦军事医学科学院微生物学流行病学研究所北京１０００７１在急、慢性输血后肝炎、散发性肝炎及暴发性肝炎中，有相当比例的病人用现有甲、乙、丙、丁、戊型肝炎的诊断...

高功率微波对大鼠心肌组织结构损伤及凋亡相关基因表达的研究

目的 :研究高功率微波 (highpowermicrowave ,HPM)对心肌组织结构、超微结构和凋亡相关蛋白表达的影响 ,以探讨HPM对心肌损伤的剂量效应关系、基本病变规律和分子病理机制。方法 :5个不同功率密度的HPM辐照大鼠 ,于伤后 1h ,6h ,2 4h ,7d ,14d及 2 8d采取心肌组织 ,通过光镜、电镜观察其病变规律 ,免疫组化检测Bax ,Bcl_2 ,c_Fos和P5 3蛋白的表达。结果 :HPM辐照后心肌纤维早期出现细胞水肿、水变性 ,中后期可见收缩带、透明样变 ,肌纤维断裂 ,灶性坏死。Bax,c_Fos,P5 3表达明显增强 ,Bcl_2表达一过性增强。结论 :HPM可对心肌造成严重损伤 ,损伤存在剂量效应关系。bcl_2 bax,c_fos和p5 3参与了HPM引起的心肌细胞凋亡。

可见光光谱法评价胶体金粒径及分布

目的 :利用可见光光谱法 ,建立便于实验室使用的评价胶体金粒径及分布的方法。方法 :制备不同颗粒直径的胶体金。利用紫外分光光度计对胶体金进行扫描 ,得到最大吸收峰波长及峰宽 ;通过透射电镜观察其颗粒直径及分布 ,再将二者结果进行比较 ,求出回归方程。结果 :在所研究范围内 ,胶体金最大吸收峰波长与粒径 ( 10～ 70nm)呈线性相关 ;峰宽越小粒子分布越均匀。结论 :使用可见光光谱法评价胶体金的粒径及分布 ,操作简便快捷 ,便于实验室使用。

肌酸激酶-MB假性升高原因及与疾病的关系研究

目的 :在生化检验中 ,明确某些非心源性疾病患者血清中心肌型肌酸激酶同工酶 (CK_MB)活性升高的原因及与疾病的关系。方法 :对常规检测中CK_MB活性异常 ,且CK_MB CK比值超过 30 %的 30例患者 ,进一步用CK同工酶琼脂糖凝胶电泳鉴定 ,并结合病情进行分析。结果 :经CK同工酶电泳证实 ,此组患者CK_MB活性实际为正常 ,但出现脑型肌酸激酶同工酶 (CK_BB)或异常CK同工酶带。结论 :干化学测定CK_MB时 ,如果出现CK_BB或异常CK同工酶 ,常出现CK_MB假性升高 ,可用CK_MB CK比率大于 30

扛板归化学成分的研究

目的:研究扛板归(Polygonum perfoliatum L.)的化学成分。方法:利用硅胶、Sephadex LH-20柱色谱等方法对扛板归进行分离纯化,根据理化性质、波谱数据(质谱、核磁共振谱)鉴定化合物的化学结构。结果:分离鉴定出12个单体化合物,分别为槲皮素(quercetin,1)、异鼠李素(isorhamnetin,2)、金丝桃苷(hyperrosid,3)、槲皮苷(quercitrin,4)、原儿茶酸(protocatechuic acid,5)、没食子酸(gallic acid,6)、鞣花酸(ellagic acid,7)、3,3′-二甲氧基-鞣花酸(3,3′-di-O-methyl ellagic acid,8)、1-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖(1-O-galloyl-β-D-glucose,9)、黏酸二甲酯-2-O-没食子酰基(mucic acid dimethyl ester-2-O-gallate,10)、咖啡酸乙酯(ethyl caffeate,11)、黏酸二甲酯(mucic acid dime-thyl ester,12)。结论:化合物10和12首次从该属植物中分离得到,化合物2、3、7、8和9首次从扛板归中分离得到。

中国人庚型肝炎病毒全基因cDNA克隆及序列测定

首次报道了中国人庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）全基因ｃＤＮＡ的克隆及序列测定。中国庚型肝炎病毒（ＨＧＶＣ９６４）基因全长为９１２８个核苷酸，编码一个长度为２８７０个氨基酸残基的多聚前体蛋白。５端有一个３６７ｂｐ的非翻译区，３端长度为１４７个核苷酸。基因组中Ｇ＋Ｃ占５９．９３％。该株病毒（ＨＧＶＣ９６４）与国外报道的３株ＨＧＶ序列比较，核苷酸同源性为８４．０％～８９．９％，氨基酸同源性均大于９１％。

一种改进的用于测定细胞周期的细胞制备方法

目的 :减少细胞的聚集数量 ,提高测试效率和结果的准确性。方法 :在用酒精固定细胞时分别加入终浓度为 0 % ,1.5 % ,3% ,6 %和 12 %的小牛血清 ,置 - 2 0℃分别固定细胞 1d ,3d和 7d。比较了不同浓度的血清和保存不同时间粘连细胞的数量及对细胞周期分析结果的影响。结果 :加入血清可明显减轻细胞的粘连 ,减少了细胞的聚集数量 ,尤以 3%小牛血清组最佳。样品可不必过滤 ,在上机测试时 ,进样针不堵塞 ,上样速度快 ,细胞周期分析更准确。随着保存时间的延长 ,聚集细胞的数量有增加的趋势。结论 :在制备用于测定细胞周期的样品时 ,固定细胞的过程中加入终浓度为 3%的小牛血清是一种简单的、能有效地保护细胞膜使细胞不易粘连的技术措施 ,且固定细胞的时间不宜超过 7d。

检测血管生长因子作用的鸡胚绒毛尿囊膜技术

采用改良的鸡胚绒毛尿囊膜(chorioallantoic membrane,CAM)技术,探讨血管生长因子在肿瘤发生发展过程中的作用。方法是将肿瘤细胞培养上清液或某些细胞因子,置于孵育9d鸡胚的CAM膜上,继续孵育3d后取膜,观察新生毛细血管的数量、长度与粗细,发现恶性程度高的肿瘤培养上清液促血管生长作用较强。

一种改进的大鼠脑组织灌注固定方法

目的 :改进常规脑灌注固定方法存在着的一些不足 ,使其组织结构更佳 ,提高灌注效率。方法 :改进灌注针头和灌注液 ,改变灌注的循环通路。结果和结论 :提高了灌注效率 ,节省灌注时间和灌注液 ,结构更加清晰 ,结果可靠。为有关脑组织的各种常规病理形态、免疫组化、原位杂交、原位PCR的实验研究提供了一种更加简便、快捷。

荧光定量PCR快速检测金黄色葡萄球菌方法的建立

目的利用SmartCycler系统建立一种简便、快速的荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,简称SAU)的方法。方法根据SAU特异nuc基因设计引物和探针,建立检测体系,并在体系中加入内质控IAC,通过另一个标记不同荧光基团的TaqMan探针来监测IAC。用SAU6538株污染饮用水和牛奶模拟实际样本,以评价体系的性能。结果以含nuc片段的线性质粒为模板,反应体系的灵敏度为5拷贝/μl;以6538株基因组DNA为模板,最低检测限为10fg/μl;用涂平板法计数并10倍梯度稀释的菌液提取DNA为模板,最低检测限为50cfu/ml。建立的定量标准曲线的循环域值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r2≥0.998),PCR效率E≥96.7%。用SAU6538污染饮用水和牛奶模拟实际样本,灵敏度可达5×102cfu/25ml样本。结论所建立的nuc-IAC荧光定量PCR具有内质控IAC,既能定量检测食物是否被污染,又能监测PCR体系,防止假阴性发生或低估病原菌污染量。

河南新乡2008年手足口病病原分离鉴定及病毒基因组特征

目的:对2008年分离自河南新乡手足口病患者粪便标本的病原进行分离鉴定及全基因组序列测定,并同相关毒株序列进行同源性比对和进化分析,以了解新分离病毒基因组序列特征及可能的传播来源。方法:将手足口病患者粪便标本接种敏感细胞进行分离传代培养,制备抗原片进行间接免疫荧光检测,采用特异性引物进行PCR鉴定,将病毒基因组分为8个片段进行RT-PCR扩增,扩增产物纯化后进行PCR测序。通过末端重叠序列拼接成全长病毒基因组序列,利用生物信息学软件对序列进行比对分析,绘制进化树。结果:测序获得的3株EV71病毒基因组全长均为7 405 nt,VP1氨基酸序列同源性达100%。Blast分析表明F3(F8)-Henan-08毒株均与安徽阜阳2008年分离的EV71毒株同源性最高,而F4-Henan-08毒株与我国台湾省2004年分离的EV71毒株同源性最高。序列进化分析表明,新分离毒株属于C4基因亚型。结论:新分离的河南EV71毒株与安徽阜阳分离的毒株可能具有相同来源。

细菌随机扩增多态性DNA分析中模板提取方法的优化

目的 :筛选出最佳模板提取方法用于随机扩增多态性DNA(RAPD)。方法 :对 4种方法 (挑丝法、沉淀法、加热裂解法和裂解剂裂解法 )提取的模板DNA进行琼脂糖凝胶电泳、紫外线扫描及随机扩增多态性DNA ,比较其片段大小、纯度及RAPD指纹图差异。结果 :挑丝法和沉淀法均可提取出大于 2 3kb且纯度较高的模板DNA ,二者指纹图完全一致且均有 2～ 4kb的较大片段。加热裂解法和裂解剂裂解法提取的模板有弥散、碎裂的DNA并纯度较差 ,指纹图上仅有 6 0 0～ 2 0 0 0bp的较小片段。结论 :用挑丝法或沉淀法提取的模板DNA最适于进行RAPD。

人肝再生增强因子的cDNA克隆与序列分析

利用大鼠肝再生增强因子（ａｕｇｍｅｎｔｅｒｏｆｌｉｖｅｒｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，ＡＬＲ）核苷酸序列，从人胎肝ｃＤＮＡ文库中筛选到人肝再生增强因子ｃＤＮＡ克隆，该克隆含有１．５ｋｂ的外源插入片段，核苷酸序列测定表明含３７５ｂｐ的读码框架，能编码１２５个氨基酸的蛋白质；与大鼠肝再生增强因子相比，核苷酸序列同源性达８７％，氨基酸序列同源性达８４．８％。

改进的质谱兼容的胶内酶切方法

目的:改善胶内酶切的肽段回收率,提高蛋白质的有效鉴定率。方法:将改进的胶内酶切“四步提取法”,应用到96个双向电泳蛋白质斑点分析。结果:该方法提高了胶内蛋白质酶切肽段的回收率,改善了质谱图谱的质量。蛋白质的有效鉴定率达89.6%,其中,数据库检索得分80分以上者达82%。另外,证实了酶解原液直接用于质谱分析可获得较好信噪比的谱图。结论:应用“四步提取法”使得酶解肽段提取率和蛋白质的有效鉴定率明显提高。

多位点序列分型技术及其研究进展

多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)技术是一种基于核酸序列测定的基因分型方法,该方法选用多个看家基因(housekeeping gene)进行序列分析,通过序列的变化反映菌株之间的进化关系,具有较高的分辨率,可通过网络实现实验室间数据共享及比较,已广泛用于细菌基因分型研究。该文综述了MLST技术的原理、设计方法、结果分析及应用等方面的进展,并与其他分型方法进行了比较。

地黄多糖对小鼠免疫功能的影响

目的:研究地黄多糖(RGPS)对正常小鼠免疫功能的影响。方法:以200、400、800 mg/(kg.d)剂量灌胃给药10 d,观察RGPS对小鼠胸腺指数、脾指数、吞噬指数、外周血CD4+和CD8+细胞的影响,采用体外给药的方法观察其对脾脏T淋巴细胞增殖、腹腔巨噬细胞吞噬活性的影响。结果:在一定的剂量范围内,RGPS可显著提高小鼠的脾指数,增强单核巨噬细胞的吞噬功能,提高CD8+细胞的比例,但对CD4+细胞无明显影响。体外实验表明,一定浓度的RGPS可明显促进T淋巴细胞增殖,增强腹腔巨噬细胞的吞噬活性。结论:地黄多糖可增强小鼠的非特异性免疫功能和细胞免疫功能。