SCAR分子标记技术在香菇菌株鉴定上的应用研究

为了建立一套基于DNA分子标记技术快速鉴定香菇菌株的有效方法,本研究首先通过对生产上常用的14个香菇菌株进行RAPD多态性分析,从香菇菌株162中扩增获得了一个片段长为1166bp的特异RAPD标记XG1166,随之利用分子克隆技术将该特异RAPD标记成功转化为稳定的SCAR标记。用同样的方法,本研究又从另一香菇菌株申香10号中获得了一段长度为347bp的特异SCAR标记SX347。试验结果表明,利用本研究获得的香菇菌株162和申香10号的特异SCAR标记,能在一天时间内准确鉴定出香菇菌株162或申香10号菌株的真伪。由此可见,SCAR分子标记是一种快速、稳定、准确鉴定香菇菌株的新方法, 可应用于食用菌种质资源保护利用、品种分类与鉴定和假种辨别。

小麦条锈菌条中31号生理小种SCAR检测标记的建立

建立小麦条锈菌Pucciniastriiformisf.sp.tritici生理小种的快速分子检测技术对我国小麦条锈病的监测和防治策略的制定具有重要价值,本文首次报道了利用SCAR—PCR技术进行条锈菌生理小种分子检测的方法。通过对我国目前主要优势小种条中31号RAPD片段的规模筛选,在对特异片段回收、克隆、测序的基础上,设计特异PCR引物,成功获得了条中31号生理小种专化的SCAR检测标记。

冬虫夏草及其相关类群的分子系统学分析

为了探明冬虫夏草及其相关类群的亲缘关系,以冬虫夏草、中国被毛孢及中华束丝孢(=冬虫夏草头孢=蝙蝠蛾多毛孢)共6株菌种作为内群和一株蛹草拟青霉作为外群进行了DNA随机多态型(RAPD)分析。此外,基于上述供试材料又在内群中增加了一株蝙蝠蛾拟青霉,并对内群和外群样品的nrDNA间隔区(ITS)碱基序列进行了测定;对于测定的8条序列连同来自GenBank中的4条相关序列进行了分子系统学分析。结果表明:中华束丝孢和中国被毛孢均系冬虫夏草菌的无性型。按照国际植物命名法规,中国被毛孢应为冬虫夏草菌无性型的正确名称。而蝙蝠蛾拟青霉为不同于冬虫夏草菌的另一种真菌;该名称由于不合格发表而不被国际植物命名法规所承认。

毛木耳漆酶纯化及其部分漆酶特性的研究

对毛木耳AuriculariapolytrichaAP4的粗酶液进行PAGE电泳后发现含有三种漆酶同工酶,并且通过运用NativeSDS-PAGE获得三种漆酶的分子量大小分别约为:LacA(110kD);LacB(84kD);LacC(65kD)。对漆酶粗酶液通过硫酸铵分级沉淀和离子交换柱层析进行纯化,用SDS-PAGE证明获得纯化的单一漆酶LacB。LacB漆酶的反应的最适温度为30℃,最适pH为3.0。此酶氧化ABTS的Km值为6.64×10-mmol/L,金属离子对酶活的影响很大,其中5Ca2+,Mg2+,Zn2+,Na2+,Ag2+对漆酶LacB有明显的激活作用;Co2+,Hg2+,Fe3+,Fe2+,Ba2+等对酶活有明显的抑制作用。LacB和其它真菌漆酶一样具有底物专一性不强的特点,并且LacB对RB亮兰染料有很好的脱色作用。

蝉拟青霉菌丝体与天然蝉花中化学成分的比较分析

以天然蝉花Cordyceps cicadae做对比,对一株蝉拟青霉Paecilomyces cicadae菌株发酵菌丝体的化学成分进行了分析,包括粗成分、生物活性成分、无机元素、氨基酸、脂肪酸等。结果表明:蝉拟青霉菌丝体中虫草多糖的含量为33.2mg/g,甘露醇的含量为78.9mg/g,麦角甾醇的含量为0.6256mg/g,腺苷的含量为1.0620mg/g,钙、铁、锌、硒和锰微量元素的含量分别为5187.59μg/g、207.23μg/g、41.93μg/g、0.087μg/g和28.24μg/g,18种氨基酸齐全,不饱和脂肪酸是优势脂肪酸,以亚麻油酸、油酸为主,其相对含量分别为53.91%和20.63%,与天然蝉花相比,发酵菌丝体中虫草多糖、甘露醇、麦角甾醇、腺苷、氨基酸总量、必需氨基酸总量和不饱和脂肪酸的含量明显高于后者,其它化学成分和天然蝉花中相应成分基本一致。

中国栽培白灵侧耳的RAPD和IGS分析

以RAPD和IGS为分子标记,研究了中国栽培白灵侧耳Pleurotus nebrodensis菌株的遗传多样性,RAPD结果表明,供试菌株间存在多态性;对供试菌株的IGS分析表明,白灵侧耳P. nebrodensis的IGS1区域较保守,菌株间没有多态性;IGS2区域进化较快,菌株间具丰富的多态性。IGS2-RFLP可应用于白灵侧耳的菌株鉴定鉴别,较RAPD更稳定,更具可操作性。

灵芝中有效成分灵芝酸的抑制肿瘤作用研究

本文采用了体外肿瘤细胞培养增殖抑制试验与体内肿瘤细胞抑制试验,结果显示灵芝酸在体外对肿瘤细胞株SW620、LS180、S180的增殖具有明显的抑制作用,体内抗肿瘤疗效试验显示灵芝酸对Lewis肺癌(足趾接种)具有一定的疗效,对荷Lewis肺癌的小鼠IL-2的生成及NK细胞的免疫活性均有一定的促进作用。因此可以认为灵芝酸通过直接细胞毒作用与激活免疫体系实现抑制肿瘤作用。

丛枝菌根真菌菌丝体吸附重金属的潜力及特征

应用玻璃珠分室培养系统获得丛枝菌根真菌材料,研究了离体真菌菌丝体对pH缓冲体系中Zn、Cd和Mn等金属离子的吸附特征。试验结果表明,真菌菌丝体对各金属离子吸附能力差异显著,对Cd最强,Zn次之,Mn最弱。试验条件下,菌体可分别吸附相当于自身干物重1.6%的Mn、2.8%的Zn和13.3%的Cdo吸附于菌丝体的Cd2+绝大部分可以被Ca2+交换吸附。另外研究了宿主植物根系对Cd的吸附作用,证实菌根真菌侵染改变了根系的吸附特性,相对于非菌根根系,菌根的CEC较高,对Cd的吸附能力较强。试验结果为重金属污染条件下丛枝菌根强化根系的屏障作用提供了直接证据。

AM真菌对青枯菌和根际细菌群落结构的影响

利用传统的平板培养与DGGE相结合的技术手段,研究了接种AM真菌对番茄根际土壤中的青枯菌和细菌群落结构的影响。结果表明,菌根根际土壤中的细菌总量和总DNA量都高于非菌根根际土壤,其中前者的青枯菌种群数量比后者低60倍;DGGE图谱也证实了AM真菌对青枯菌的抑制效应,还揭示出接种AM真菌对根际土壤中细菌群落结构所产生的复杂的影响。文章对AM真菌抑制青枯菌的机制进行了探讨。

青藏高原黄绿蜜环菌纯培养菌种的分离培养及分子鉴定

首次从采自青藏高原、与高原牧草嵩草属Kobresia草本植物形成外生菌根的黄绿蜜环菌Armillarialuteo-virens子实体中分离获得一组织分离菌株,运用rDNA-ITS和rDNA-IGS-1测序技术对该组织分离菌株是否为黄绿蜜环菌的纯培养菌种进行分子鉴定,并基于黄绿蜜环菌的5.8S/ITS和IGS-1序列进行核酸序列数据库GenBank同源性检索比对、构建系统发育树。结果表明,本研究获得的黄绿蜜环菌子实体组织分离菌株即为其纯培养菌种。基于ITS的系统发育分析表明黄绿蜜环菌与口蘑科内其它属间物种的系统发育关系较远;基于IGS-1的系统发育分析表明黄绿蜜环菌与蜜环菌属内的其它种序列差异较大,系统发育关系较远,而与Lepiota属内的部分种具有较近的系统发育关系。本研究首次基于分子手段对我国青藏高原的黄绿蜜环菌种进行了分离培养、分子鉴定和系统发育分析,为黄绿蜜环菌的科学分类提供了分子依据。

鲍氏层孔菌培养条件的研究

本项研究对分离于野外的鲍氏层孔菌从不同的温度、pH值以及不同的碳源和氮源的营养成分三方面进行室内培养,其结果显示鲍氏层孔菌营养菌丝生长的最适温度为28℃;最佳碳源为甘露醇和葡萄糖;最佳氮源为蛋白胨,其次为牛肉膏;而pH值在6.0-8.0的范围内变化对其菌丝体生长影响不大。这些结果为将来大规模人工培植鲍氏层孔菌提供了很好的指导作用。

中国香菇自然种质的rDNA遗传多样性分析

测定了全国范围内的59个野生香菇菌株rDNA的ITS区域的序列。所得序列的总长度在723-727个碱基之间,G+C含量也基本稳定在57.5%左右。用Phylip3.6软件包对59个ITS序列进行DNA数据分析。结果表明59个菌株被划分到3个不同的谱系中,其中谱系Ⅰ包括11个菌株,分布较为均衡,涉及东北、西北、西南和东部沿海等地区的8个省份;谱系Ⅱ包括14菌株,以西北、西南的4个省份为主;谱系Ⅲ包括34个菌株,覆盖范围最广,除东北和西北高原地区外,其它均有涉及。地缘关系分析表明以陕、甘为主的西北高原地区的菌株涉及Ⅰ、Ⅱ两个谱系;以闽、浙、赣和台湾为主的东部沿海地区的菌株涉及Ⅰ、Ⅲ两个谱系;而以云、贵、川为主的西南地区的菌株则覆盖到了所有的3个谱系。这三个地区的香菇遗传多样性最丰富,西南地区尤为突出,是香菇种质资源保护与利用的重点区域。

红托竹荪菌托多糖的提取及抗肿瘤活性的初步研究

红托竹荪菌托经热水提取、酒精沉淀、脱蛋白后的粗多糖,其得率远大于其菌丝体和子实体的其他部位及香菇子实体。菌托粗多糖进一步用DEAE纤维素柱和Sephadex G-75分离纯化,得到两个组分DRVP1与DRVP2,对分离得到的主要多糖通过高效液相色谱(HPLC)、红外光谱(IR)等进行结构分析。DRVP1的相对分子质量(Mr)为1.47×104,红外光谱数据显示为β-型甘露糖苷。体外试验表明,红托竹荪菌托多糖的组分DRVP1对小鼠S180肉瘤有一定的抑制作用。

用ISSR分子标记鉴别东北地区黑木耳生产菌株的研究

利用ISSR分子标记对东北地区黑木耳生产菌株进行了分子鉴别,结果表明在选用的20个UBC-ISSR引物中,有10个引物能对供试的27个黑木耳菌株基因组DNA进行扩增,获得的指纹图谱清晰稳定、多态性强。用NTSYS软件进行聚类分析,相似水平在0.75时,可将27个供试黑木耳菌株分为3个组群。研究结果说明ISSR分子标记,可以有效地用于黑木耳生产菌株快速准确鉴别,是黑木耳指纹图谱分析的理想手段。

固态混合发酵提高木聚糖酶和纤维素酶活力的研究

研究了接种比例、接种时间、碳源、氮源等因素对木霉和黑曲霉混合发酵产木聚糖酶和纤维素酶的影响。试验结果表明,当木霉和黑曲霉按4:6同时接种,以玉米芯3．75g、麸皮3．75g、葡萄糖37．5mg为混合碳源,Mandels营养盐11．5mL、添加NH_4NO_37．5mg为氮源,在84h产纤维素酶活力达到230IU/g干物质,木聚糖酶活力达到1308IU/g干物质,与两菌纯培养相比,纤维素酶活力提高163％,木聚糖酶活力提高79．5％。

氨基寡糖素对黄瓜白粉病菌侵染的抑制作用

用透射电子显微镜,研究了寡聚糖类药剂中科6号(2%氨基寡糖素)处理黄瓜Cucumis sativus 植株叶片后对白粉病菌Sphaerotheca fuliginea侵染的抑制作用。超微结构观察表明,病菌发育受到明显抑制,表现为白粉菌菌丝细胞质凝聚,细胞器解体和细胞组织崩解;吸器内的原生质电子致密度加深,吸器畸形,吸器壁增厚,细胞器解体,最终吸器坏死。

铁皮石斛疫病及其病原菌

铁皮石斛疫病2001年发现在浙江义乌栽培田间,是由疫霉菌引起的。在田间,疫霉菌侵染茎基部,引起当年移植苗根腐、植株枯萎和死亡,但侵染2-3年植株幼嫩顶部仅引起顶枯症状。通过对病原菌形态学、交配型的观察,以及核糖体DNAITS序列分析,侵染铁皮石斛的5个分离菌株被鉴定为烟草疫霉菌Phytophthora nicotianae。致病性试验表明,铁皮石斛是烟草疫霉菌的寄主。

利用PEG法建立药用真菌灵芝的转化系统

本文首次建立了一种通过PEG转化缓冲液将外源基因转入灵芝的方法,转化频率约为5～6个/μg(抗性转化子/质粒+107个原生质体).转化子在不含HmB的培养基上经5代以上的继代培养后仍可以稳定表达HmB抗性.Southern blot检测证明外源基因已经整合到了灵芝的基因组DNA中.本研究为通过基因工程手段定向、快速改良灵芝药用品质以及利用灵芝发酵方法生产一些具有重大经济价值的外源蛋白等应用奠定基础,并且也有助于我们进一步了解灵芝这一大型真菌中的基因的表达调控机制.

大别山地区虫生真菌群落结构与生态分布

本文对安徽大别山地区虫生真菌的群落结构和生态分布规律进行了研究。在天堂寨和鹞落坪2个自然保护区共设样方278个,先后采集罹病标本1986个,共计50种,隶属于4目、4科、16属。优势种依次为粉拟青霉、细脚拟青霉、下垂虫草、球孢白僵菌和金龟子绿僵菌。在垂直分布上,种的丰度、多度和物种多样性指数都以海拔1100-1150m最高,随着海拔升高或降低,各多样性指标基本上表现递减的趋势。季节分布上,夏季是虫生真菌物种分布最丰富的季节,随着温度下降和雨量的减少,种的丰度和多度也明显下降。另外,该区虫生真菌群落呈现出明显的水平地带性分布规律。

茯苓基本生物学特性研究

以11个不同来源的茯苓菌株为材料,研究了茯苓菌丝体、子实体和担孢子的形态特征及适宜的生长、发育条件。结果表明,茯苓菌丝体为少分枝、有隔膜、无锁状联合的多核菌丝,茯苓担孢子核相以双核为主,双核孢子,单核孢子和无核孢子分别占87.2%,4.7%和8.1%。配对试验结果表明,同一菌株及不同菌株原生质体分离株间的配对均能融洽生长,同一菌株担孢子间的配对均产生拮抗线,但其中有少数配对在交接区形成扇形区域,拮抗线随后消失,而不同菌株担孢子间的配对则全部形成稳定的栅栏型菌落,暗示茯苓担孢子中的两个细胞核是具遗传互补性,能形成独立个体的异双核,茯苓可能是一种次级同宗结合菌。