不同倍性西瓜基因组DNA甲基化水平与模式的MSAP分析

DNA甲基化是表观遗传修饰的主要方式之一,在基因表达调控中发挥重要作用。本研究以不同倍性(2x、3x、4x)西瓜为试材,采用基于DNA甲基化敏感酶的扩增多态性分析(Methyla-tion-Sensitive Amplification Polymorphism,MSAP)方法,在全基因组水平上探究西瓜同源多倍化过程中DNA序列中CCGG位点的甲基化水平及模式变化特征。研究中选用23对选扩引物,共检测到1883个基因位点。二倍体、三倍体、四倍体中检测到的位点数分别为647、655和581;其中发生甲基化的位点数分别为181、150和159,相应的扩增总甲基化率分别为28.0%、22.9%和27.4%;全甲基化位点数分别为121、80和82,相应的全甲基化率分别为18.7%、12.2%和14.1%。进一步对不同倍性西瓜DNA甲基化模式的变化特征进行分析,结果显示:四倍体西瓜与二倍体西瓜相比有超过半数的位点(54.4%)DNA甲基化模式发生了变化,其与三倍体西瓜相比也有近一半的位点(45.4%)DNA甲基化模式发生了变化,并且变化趋势都以四倍体西瓜甲基化程度升高为主;而三倍体西瓜与二倍体西瓜相比,虽然也有41.6%的位点DNA甲基化模式发生了改变,但变化趋势以三倍体西瓜甲基化程度降低略占优势;与之相似,三倍体西瓜与四倍体相比较,甲基化的变化趋势也是以三倍体西瓜甲基化程度降低为主。以上结果表明:不同倍性西瓜中DNA甲基化事件虽均有发生,但不论是从总甲基化率还是全甲基化率来看,DNA甲基化水平与倍性高低关系不大,三倍体西瓜表现出较为显著的低甲基化水平特征。DNA甲基化模式的分析也表明,与二倍体及四倍体西瓜相比,三倍体西瓜DNA甲基化模式的调整主要以去甲基化为主。显示出三倍体西瓜基因组独特的DNA甲基化特征。本研究为进一步从表观遗传学的角度探讨西瓜的三倍体优势及西瓜同源多倍化的机制奠定了基础。

北柴胡营养器官中主要化学成分的组织化学定位及其含量比较

应用植物解剖学、组织化学定位和植物化学方法,研究了北柴胡各营养器官中柴胡皂苷和黄酮类化合物的积累分布状态及其含量变化。结果表明,柴胡皂苷在根中分布在中柱鞘和次生韧皮部中;在茎中主要分布在表皮、棱角处的厚角组织以及位于皮层和髓中的分泌道的上皮细胞中;在叶中,则分布在表皮细胞和整个叶肉组织中。而黄酮类化合物在茎中分布在表皮、棱角处的厚角组织、皮层、髓射线和髓鞘细胞中;在叶中,则主要分布在表皮和位于上下表皮内的厚角组织中。同时,北柴胡中柴胡总皂苷在根、茎、叶中的含量的变化规律为根>叶>茎;而总黄酮在根、茎、叶中的含量的变化规律为叶>茎>根;且在叶中含量相当高,从而为北柴胡的综合利用提供依据,对合理利用药材和保护北柴胡资源也有一定意义。

镉诱导HEK293细胞凋亡及其线粒体凋亡途径

本课题研究了氯化镉(CdCl_2)诱导HEK293细胞(人胚胎肾细胞系)的凋亡,初步探讨了凋亡过程中Caspase-3、Bcl-2的变化和凋亡诱导因子(AIF)的转移以及它们的意义。MTT法检测CdCl_2对HEK293细胞增殖的抑制作用;通过倒置显微镜、电镜、琼脂糖凝胶电泳、流式细胞术、激光共聚焦观察细胞凋亡;应用Western blot法和荧光免疫法测定Caspase-3酶原、Bcl-2蛋白的变化以及检测AIF蛋白在细胞中的定位。结果显示:CdCl_2对HEK293细胞具有显著的生长抑制作用,并呈明显的剂量和时间依赖性。在琼脂糖凝胶电泳中,显示有凋亡细胞特有的DNA梯状条带,其中30μmol/L作用6-9h梯状条带最为清晰,时间过长或浓度过高则梯状条带逐渐模糊,表明镉浓度过高或处理时间过长,细胞有坏死。流式细胞仪检测也印证了这一结果。形态学观察可见明显的细胞凋亡特征。同时线粒体膜电位明显下降,发现Caspase-3酶原蛋白、Bcl-2蛋白含量减少,并具有时间依赖性;另外检测到线粒体AIF向细胞核转移。而Bcl-2转染后有一定的抑制凋亡作用。实验结果提示,CdCl_2能够诱导HEK293细胞凋亡,线粒体损伤导致AIF转移与细胞色素c释放,从而引发的非Caspases与Caspases凋亡途径可能在镉引发的细胞凋亡过程中起重要作用,而Caspase-3, Bcl-2起着重要的调控作用。

同型半胱氨酸对内皮细胞一氧化氮合酶系统的损伤机制及叶酸的拮抗效应

本实验探讨同型半胱氨酸(Hcy)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)一氧化氮合酶(eNOS)的损伤机制及叶酸(FA)的拮抗效应。HUVEC原代培养,传至第3代后,将其与不同浓度Hcv(10μmol/L、30μmol/L、100μmol/L和300μmol/L)、FA(100μmol/L)或两者联合共同培养72h,用RT-PCR和免疫组织化学技术分别估测细胞eNOS mRNA水平及eNOS蛋白质量;高效液相色谱测定细胞内不对称二甲基精氨酸(ADMA)含量;并分别测定二甲基精氨酸二甲胺水解酶(DDAH)、eNOS活性及一氧化氮(NO)含量。HUVEC与不同浓度Hcy培养72h后,eNOS mRNA和蛋白质表达皆受到抑制;eNOS活性降低;NO生成减少。同时,DDAH活性降低;细胞内ADMA含量呈剂量依赖性增加。加入FA后,eNOS蛋白质水平上调;eNOS活性增强;NO生成增多。同时,DDAH活性增强,ADMA蓄积减少;但eNOS mRNA表达没有改变。Hcy对内皮细胞eNOS的损伤机制涉及eNOS酶蛋白和eNOS的基因表达两个层面,其对eNOS酶蛋白的抑制机制可能通过DDAH-ADMA通路,FA可拮抗Hcy对eNOS酶蛋白的抑制作用,显示出对HHcy有一定的保护作用。但FA对HHcy所导致的eNOS基因表达的抑制无保护效应。

应用基因表达谱芯片研究黄药子对小鼠肝脏的毒性机制(简报)

黄药子为薯蓣科植物黄独（Dioscorea bulbiferaL.）的块茎，临床常用于治疗甲状腺肿、抗肿瘤、抗炎、抗病毒等。近年来临床上关于黄药子的毒副作用，尤其是对肝、肾的不良反应屡有报道。当黄药子或其代谢物在肝细胞内累积时会直接干扰肝细胞代谢，病变肝组织在形态上表现出脂肪样变、嗜酸样变性、小灶性坏死或片状坏死，且肝损伤程度与给药剂量和时间密切相关。目前，关于黄药子的肝毒成分一般认为是其所含的薯蓣皂苷、薯蓣毒皂苷、黄药子萜ABC及鞣质等，但关于黄药子肝损伤的病理过程与分子机制还不清楚。

复合感染建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的兰花超微结构观察及病原物快速鉴定

通过负染和超薄切片观察到蝴蝶兰(Phalaenopsis amabilis)病叶中线状和杆状病毒颗粒。组织切片观察,同时发现两种病毒粒子的典型聚集体:线状粒子的带状聚集体,粒子多层排列,层间呈一定角度或螺旋相叠;杆状粒子的平行、角层状或螺旋型排列聚集体。二种病毒聚集体均出现于薄壁细胞、细胞间隙和输导组织细胞中。感病细胞中叶绿体发育不全;线粒体增生、肿胀甚至空化;细胞核膨大、空化。进一步的多重RT-PCR与病毒核酸序列分析,同时扩增到建兰花叶病毒(CymMV)和齿兰环斑病毒(ORSV)的外壳蛋白基因,与GenBank已知分离物同源性分别达到98%和99%-100%。从细胞和分子层面揭示了蝴蝶兰受CymMV和ORSV复合侵染并可能导致严重病症的事实,分析和明确了感病兰细胞超微结构的病变特征以及田间病症发生的细胞病理学依据。

NO可能作为Ca^(2+)的下游信号介导乙烯诱导的蚕豆气孔关闭

以蚕豆(Vicia fabaL.)为材料,利用药理学实验,结合激光共聚焦显微技术和分光光度法,探讨Ca2+和一氧化氮(nitric oxide,NO)在乙烯(ethylene,Eth)调控气孔运动信号转导中的作用。结果表明,光下乙烯利(0.004%,0.04%,0.4%)可诱导蚕豆叶片气孔关闭,且具有时间和剂量效应;NO清除剂cPTIO、硝酸还原酶(nitrate reductase,NR)抑制剂NaN3及胞外Ca2+螯合剂EGTA可部分逆转乙烯诱导的气孔关闭;乙烯能够明显增加气孔保卫细胞NO水平;提高蚕豆叶片NO含量和NR活性,并且NO的含量变化与NR活性的变化趋势基本一致;NR抑制剂NaN3可抑制乙烯诱导的气孔保卫细胞和叶片NO含量的增加;清除胞外Ca2+可减弱乙烯对NO含量和NR活性的诱导效应。说明Ca2+和NO均参与乙烯诱导的蚕豆气孔关闭,且NO(主要由NR途径合成)可能位于Ca2+下游参与调控这一信号转导过程。

抑郁症模型大鼠学习记忆能力变化研究

为探讨抑郁症发生发展过程中学习记忆能力的变化模式及其可能机制,分别采用21天慢性非预见性刺激法和嗅球切除法建立的抑郁症模型大鼠,运用旷场行为实验(open-field behavior)检测大鼠主动性活动能力,用Morris水迷宫法检测大鼠空间学习记忆能力,HPLC-UV法测定大鼠血清皮质醇含量,电生理法记录海马CA1区LTP与LTD,观察海马神经元的突触可塑性。结果显示:与对照组相比,两种模型的自主活动性、空间探索兴趣和学习能力都明显降低,而记忆的反馈功能没有明显的变化。同时,两种模型大鼠海马神经细胞的突触可塑性显著下降,血清皮质醇的含量则明显上升。提示两种建模方法均导致大鼠产生抑郁症状和学习能力障碍,但对记忆反馈功能无明显影响。

白芨中萜类化合物通过诱导血管内皮细胞凋亡抑制血管生成(英文)

本文研究了白芨中的萜类化合物对血管生成的抑制作用,及其抑制血管生成的可能机制。采用萃取和色谱法从白芨中分离和纯化了该萜类化合物。通过鸡胚绒毛囊膜(CAM)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)研究了白芨中萜类化合物及其粗提物对血管及血管内皮细胞的抑制作用。结果表明,含该萜类的粗提物显著抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生成;该萜类纯品能明显抑制HUVEC增殖,且可诱导HUVEC凋亡,包括细胞体积缩小,细胞膜起泡,细胞核裂解,染色质浓缩和边集,出现凋亡小体,DNA降解。因此,白芨萜类化合物的抗血管生成作用与诱导血管内皮细胞凋亡有关。

栽培太子参块根中皂苷的组织化学定位及其含量变化

应用植物解剖学、组织化学定位及植物化学技术,研究了栽培太子参块根不同发育时期的结构特征与皂苷积累的关系。结果表明:太子参不定根的初生结构和次生结构类似一般草本双子叶植物根的特征。在成熟的块根中次生木质部约占80%,其中以木薄壁组织细胞为主,导管很少,次生韧皮部中也以薄壁组织细胞居多,从而形成纺锤状块根。组织化学定位显示,在根的初生结构中,皂苷分布在中柱鞘和初生韧皮部的薄壁组织细胞中。在次生结构与成熟块根中,皂苷分布在除木栓层及导管外的周皮及次生维管组织其它细胞中,其中次生韧皮部显色较深。植物化学检测结果表明,2月与7月块根的皮部中皂苷的含量高于木部,与组织化学结果一致;根头部的皂苷含量>根尾部>根中部。在块根的发育过程中,皂苷的含量存在高-低-高的动态特点,此种变化规律与其根系的发育特点相关。

环介导恒温扩增技术快速检测溶藻弧菌

溶藻弧菌是中国南部水产养殖业中弧菌病的最主要病原菌,其快速检测具有重要意义。根据溶藻弧菌外膜蛋白OmpK基因序列,设计一套引物,通过条件优化,成功建立了针对致病性溶藻弧菌的环介导恒温扩增检测技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)。应用LAMP技术,在65℃温育1h的条件下扩增溶藻弧菌基因组DNA,琼脂糖凝胶电泳得到特异性梯度条带。该研究建立的LAMP法特异性检出致病性溶藻弧菌,其检测下限比PCR法低一个数量级,相当于n(cell)=38/mL的菌液浓度,灵敏度更高。综合分析表明,LAMP技术是快速、简易、实地诊断溶藻弧菌的理想工具。

远缘杂交形成的二倍体鱼和多倍体鱼生殖细胞染色体研究

本文采用性腺染色体制片及组织学切片方法,系统地研究了不同发育时期的鲫鲤杂交第二代(F2)(2n=100)、异源四倍体鲫鲤(4n=200)、三倍体鲫鱼(3n=150))、雌核发育二倍体鲫鲤第二代(G2)(2n=100)及鲤鱼(CyprinuscarpioL)(2n=100)(对照组)生殖细胞的染色体特征。研究结果表明,对照组中鲤鱼精原细胞染色体数与体细胞染色体数一致,为二倍体精原细胞(2n=100),而远缘杂交形成的二倍体鱼和多倍体鱼的生殖细胞中则观察到明显的染色体数加倍现象,其中,鲫鲤杂交第二代(F2)精巢生殖细胞染色体数加倍现象特别丰富,占检测的染色体分裂相的21.6%,为其产生不减半的二倍体配子提供了直接的细胞学证据,同时也说明远缘杂交是导致生殖细胞染色体数加倍的一个重要因素。该研究在探讨多倍体鱼的发生及鱼类遗传育种方面具有重要意义。

大豆类受体蛋白激酶基因(rlpk2)RNAi双元表达载体的构建及其转基因

植物类受体蛋白激酶(plant receptor-like kinases RLKs)以其特有的结构在植物的生长、发育和防御等多种生理生化过程中发挥着重要的作用。利用RNA干扰技术(RNA interference RNAi)来研究RLKs的功能已日趋成熟。本文根据植物中hpRNA(hairpin RNA)的原理,以大豆类受体蛋白激酶基因rlpk2为靶基因,在rlpk2-cDNA序列3'端选择312bp作为构建RNAi的序列,借助中间克隆载体,经过三次亚克隆,最后形成含rlpk2-RNAi表达盒的双元表达载体pART27-R2,并转入农杆菌LBA4404。采用农杆菌介导大豆子叶节转化方法,共获得了三株转基因植株。转基因植株 RT-PCR分析表明rlpk2基因已被成功敲减(knock-down),并且发现敲减大豆叶片中的rlpk2基因表达明显改善大豆叶片的光合能力,结合前期研究结果,表明rlpk2基因可能在维持叶绿体的结构及保护叶绿体膜系统的完整性方面起负调节作用。

枣合子胚和体细胞胚发育过程的观察与比较

本实验对临猗梨枣、壶瓶枣、晋矮1号等13个品种的枣胚的发育过程进行了观察,并诱导晋矮1号成熟胚的愈伤组织通过体细胞胚发生途径形成再生植株。结果表明:体细胞胚产生于愈伤组织的表层细胞或内部细胞。在鱼雷胚期已有导管的分化,子叶期的维管组织呈“Y”形。枣合子胚及体细胞胚的发育均经历了原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚五个时期。大多数品种的枣胚从球形胚期或心形胚期即开始败育,只有极少数品种可发育到成熟胚,而且合子胚形成的能力、胚败育时发育的程度等均存在着大的品种间差异,同一品种甚至同一子房内胚的发育进程也不同步。

牛膝根的结构发育与三萜皂苷积累的关系

应用植物解剖学、组织化学定位及植物化学技术,研究了不同发育时期牛膝根的结构特征与三帖皂苷积累的关系。结果表明:牛膝根的初生结构和次生结构类似于一般双子叶植物,其根的加粗主要是由于三生结构的发生和分化。第一圈额外形成层产生于次生韧皮部外侧的薄壁组织细胞和射线细胞,以后的每一圈由前一圈向外衍生的薄壁组织细胞产生。额外形成层无纺锤状原始细胞和射线原始细胞之分,在切向纵切面上呈叠生排列。三生维管束以离心方式排成整齐的同心环状,由薄壁结合组织将其彼此分开,其圈数与额外形成层的圈数是一致的,随着根的个体发育而不断增加。在根的初生结构中,三萜皂苷主要分布于中柱鞘、初生韧皮部及初生韧皮部和初生木质部之间的薄壁组织细胞内;在根的次生结构中,主要分布于次生韧皮部及栓内层的薄壁组织细胞内。当三生结构形成后,除次生韧皮部及栓内层细胞外,在额外形成层和三生维管束韧皮部细胞内均有皂苷类物质积累。三生结构在牛膝根中占主要地位,是三萜皂苷积累与分布的主要场所。在牛膝根的生长发育过程中,三萜皂苷元齐墩果酸的百分含量呈“S”型曲线增长,其根的增长、加粗、三生维管束圈数、三萜皂苷总量及根中干重的积累量都在出苗后约120天达到高峰,此时应为牛膝根的最佳采收期。

13种石斛属植物遗传多样性的AFLP分析

采用AFLP技术对13种石斛属植物的遗传多样性进行了分析。选择性扩增引物组合E+ACT/M+CAC、E+AAC/M+CAC和E+ACA/M+CAC分别对这13种材料进行扩增,得到丰富的条带。在100-300bp共得到346条带,多态性带342条,多态性百分率为98.8%。聚类分析结果表明,在相似系数0.54处,可将13种材料分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类。Ⅰ类包括:串珠石斛、铁皮石斛、广东石斛、重唇石斛、晶帽石斛、细叶石斛、滇桂石斛、报春石斛、玫瑰石斛、球花石斛;Ⅱ类包括:鼓槌石斛;Ⅲ类包括:美花石斛(花,浅红)、美花石斛(花,淡白)。AFLP分析结果与传统分类学的结果基本一致,表明该标记技术对石斛属植物的遗传多样性和分类研究是可行的。

拔节期与抽穗期玉米抗纹枯病相关QTL的初步定位

以玉米自交系R15(抗)×478(感)的F_2分离群体为作图群体,构建了包含146个SSR标记位点的遗传连锁图谱,覆盖玉米基因组1666 cM,平均图距11．4 cM。通过麦粒嵌入法对229个F_(2：4)家系进行人工接种纹枯病菌,于玉米拔节期和抽穗期进行纹枯病的抗性鉴定。应用复合区间作图法分析两个时期的抗病QTL及遗传效应。结果共检测到17个抗性QTL,其中以拔节期病情指数为指标共检测到9个QTL,分别位于第1、2、3、4、5、6、和10染色体上,可解释的表型变异为3．72%-9．26%；以抽穗期的病情指数为指标共在7条染色体上检测到10个抗玉米纹枯病的QTL,分布于第2、3、4、5、6、8和9染色体上。单个QTL可解释的表型变异为4．27%-9．27%。两个时期共检测出2个共同QTL,它们分别位于第2染色体的bnlgl662-bnlg1940区间和第6染色体的umc1006-umc1723区间。定位结果表明两个时期检测出的抗性QTL的差异表达与玉米不同发育时期基因的时空表达有密切关系,从而反映在纹枯病的抗性位点差异性上．这为玉米抗病选育提供新的信息。

辣椒细胞质雄性不育花药败育及淀粉粒分布的细胞学观察

用PAS反应对辣椒细胞质雄性不育系8214A和保持系8214B花药中的淀粉粒分布进行研究。在减数分裂前,保持系花药与不育系花药的结构和淀粉粒分布相似。保持系花药减数分裂后,药壁绒毡层细胞开始液泡化并体积增大,在药隔薄壁细胞中积累了许多较小的淀粉粒;在小孢子晚期,绒毡层细胞退化,在药隔薄壁细胞中淀粉粒体积增大;在二胞花粉时期,随着花粉大液泡的消失花粉中出现淀粉粒;花粉成熟时,其细胞质中积累了丰富的淀粉粒。不育系花药减数分裂后,由于药室腔的空间不能扩大,四分体被挤压在一起,最终四分体小孢子败育。不育花药的维管组织发育正常,但较多的淀粉粒积累在药隔薄壁细胞中。该种辣椒雄性不育系中,花粉的败育发生在四分体时期。绒毡层细胞结构异常可能影响糖类物质向药室的正常转运。该种辣椒雄性不育系的绒毡层异常与花粉败育有关。

镉诱发肝细胞毒性和胞内Ca^(2+)变化及硒的保护作用研究

本文通过研究镉诱发鼠肝细胞毒性和胞内游离Ca2+变化及硒的干预效应,探讨镉致肝细胞损伤机制及硒的保护作用。分离培养新生鼠原代肝细胞,随机分为正常对照组、4个5、25、100和250μmol/LCdCl2组、2个10和20μmol/LNa2SeO3组和8个用10和20μmol/LNa2SeO3分别与5、25、100和250μmol/LCdCl2联合作用组。在实验后第12h检测肝细胞存活及其MDA含量和培养液中LDH活性,激光共聚焦显微镜分析肝细胞内游离Ca2+水平([Ca2+]i)。结果显示,镉处理的肝细胞存活随镉浓度增加明显下降,硒处理组与对照组差异不明显;硒提高或明显提高镉染毒肝细胞存活。肝细胞培养上清液LDH活性随镉浓度增加而逐渐升高,且100和250μmol/LCdCl2组显著高于对照组,而硒处理组未见明显变化;给予硒的25、100和250μmol/LCdCl2处理组LDH活性下降或明显下降。不同浓度镉均诱发肝细胞MDA含量显著升高,而硒处理组未见类似表现;10和20μmol/LNa2SeO3抑制或显著地降低25、100和250μmol/LCdCl2诱发的MDA的生成。经镉处理的肝细胞[Ca2+]i荧光强度明显高于对照组,且随镉浓度的增加而上升,而给予硒的肝细胞[Ca2+]i荧光强度未见升高,与对照组相近;加入硒的镉染毒肝细胞[Ca2+]i均比各对应浓度的镉处理组有较大幅度地下降,其中给予硒的25μmol/LCdCl2处理组差异显著,且接近对照组的水平。结果提示,镉诱发肝细胞毒性和损伤以及肝细胞[Ca2+]i升高;硒可能通过干预肝损伤细胞脂质过氧化反应,改善和保护肝细胞[Ca2+]i稳态而减轻镉诱发的细胞毒性和损伤过程。

芦笋雌性特异性片段的克隆和分析(简报)

Sex-linked molecular markers are being obtained,which would be essential to be used in the screening of different sex of dioecious plants at the seedling stage. Furthermore,it is important in cloning the gene related to the sex. In this study the random amplified polymorphic DNA (RAPD) technique was employed with the objective to find markers linked to sex determination in Asparagus. A total of 100 primers were tested with the same PCR cycling procedure. A female-associated fragment with a length of about 867bp was generated with S12 primer. The fragment was cloned and sequenced,showing it is abundant in AT and contains 2 shorter open reading frames. In order to convert the RAPD marker into SCAR (sequence characterized amplified regions) marker,24bp specific primers were constructed and used for PCR amplifying. The female-linked dominant SCAR marker was obtained,which would be efficient to identify the different sex of Asparagus officinalis L.