cry基因保守序列克隆及其在大肠杆菌Rosetta(DE3)中的表达

[目的]对cry基因保守序列进行克隆,并使其在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行表达。[方法]根据NCBI数据库信息设计引物序列,采用PCR技术从抗虫棉基因组DNA中扩增出抗虫基因cry的保守序列,构建重组载体并转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株中,利用pGEX原核表达系统诱导蛋白表达。同时,分析了不同IPTG浓度及不同诱导时间对蛋白表达量的影响。[结果]扩增出抗虫基因cry的两段保守序列,长度分别为304和853 bp;SDS-PAGE检测结果显示,经IPTG诱导后重组质粒pGEX-4t-1-304和pGEX-4t-1-853成功地表达了大量GST融合蛋白,分子量分别为39和62.4 kDa,与预期结果一致;确定了IPTG最佳诱导浓度为0.15 mmol/L,最佳诱导时间为7h。[结论]为今后检测转Bt基因农作物奠定了基础。

西藏牦牛ADD1基因第2外显子的PCR-SSCP检测及序列分析

利用PCR-SSCP和DNA测序方法对帕里牦牛、工布江达牦牛、类乌齐牦牛、康布牦牛、桑日牦牛、巴青牦牛、江达牦牛、斯布牦牛、嘉黎牦牛、桑桑牦牛、丁青牦牛等西藏11个牦牛类群共483头牦牛的ADD1基因(被认为是极可能影响肉质的候选基因)第2外显子序列进行遗传多态性分析。结果表明,66 bp处碱基T缺失和256 bp处A→G突变,共有AA、AB、BB 3种基因型;其中帕里牦牛只有AA基因型,江达牦牛只有AB基因型,康布牦牛、嘉黎牦牛、巴青牦牛、桑日牦牛、斯布牦牛均缺少BB基因型,丁青牦牛、类乌齐牦牛缺少AB型,均存在严重偏态;桑桑牦牛、工布江达牦牛中存在AA、AB、BB 3种基因型。除江达牦牛外,其它10个牦牛类群中AA为优势基因型,A基因为优势等位基因,分布较高。除帕里牦牛、巴青牦牛外,其它9个牦牛类群均处于中度多态(0.25<PIC<0.50),遗传变异较大。

三种烟草品种基因组DNA傅里叶红外光谱研究

利用傅里叶红外光谱(FTIR)研究三种烟草品种DNA的差异,旨在对烟草品种进行亲缘关系分析和品种鉴定。研究结果显示,三种烟草品种DNA红外光谱较为相似,均有四个明显的特征峰,1 103 cm^(-1)是DNA磷酸二酯键的对称伸缩振动,1 236 cm^(-1)是DNA磷酸二酯键的非对称伸缩振动,1 400 cm^(-1)是DNA糖苷键的伸缩振动,I 622 cm^(-1)是DNA中是胞嘧啶C4—C5=C6的环伸缩振动。通过平滑、标准化处理、二阶求导、提取主成分和系统聚类分析建立了DNA FTIR光谱数据聚类分析模型。使用该模型对三个烟草品种进行鉴定,鉴定正确率为100%。使用该模型对三个烟草品种进行亲缘关系分析,云烟87与K326聚为一类,距离系数为0.003,DNA相似度为99.7%,红大单独聚为一类。聚类正确率达100%。该项研究为烟草品种鉴定及遗传育种提供了参考。

不同日粮类型对绵羊瘤胃微生物木聚糖酶基因多样性的影响

选取安装有永久性瘤胃瘘管的中国美利奴绵羊4只,先后饲喂全粗料日粮和精料型日粮(精粗比3∶2),提取微生物宏基因组DNA。通过PCR产物克隆文库构建、DNA测序和序列分析以研究在不同日粮条件下,绵羊瘤胃微生物糖苷水解酶第10家族(GH10)和第11家族(GH11)木聚糖酶基因的多样性。结果表明,全粗料日粮时分别获得108和137条GH10和GH11家族木聚糖酶基因片段,精料型时分别获得145和235条GH10和GH11家族木聚糖酶基因片段,这些序列分别归属于19、20、53和26个操作分类单元(OUT)。DNA序列分析表明,GH10家族木聚糖酶基因片段与梭菌和拟杆菌来源的木聚糖酶基因有较高的相似性,GH11家族木聚糖酶基因片段与放线菌、麦角真菌来源的木聚糖酶基因有较高的相似性。饲喂全粗料日粮时,有57.9%的GH10家族序列与已知木聚糖酶基因的相似性小于90%;饲喂精料型日粮时,有65.4%的GH11家族序列与已知木聚糖酶基因的相似性小于90%。由此可见,绵羊瘤胃微生物GH10和GH11家族木聚糖酶基因序列具有丰富的多样性,并且大部分为新发现的序列。饲喂全粗料日粮时,更有利于发现瘤胃微生物GH10家族木聚糖酶新序列;饲喂精料型日粮时,更有利于发现GH11家族木聚糖酶新序列。

大鳍鳠IgL2型基因cDNA的克隆及表达分析

应用RT和RACE-PCR方法获得大鳍鳠(Mystus macropterus Bleeker)免疫球蛋白轻链(IgL)2型基因cDNA序列,分析了该基因在组织中的表达。该基因cDNA全长为929 bp,包含5'非编码区43 bp,3'非编码区159 bp,开放阅读框720 bp,编码239个氨基酸。编码的氨基酸序列分为可变区(VL)和恒定区(CL)。系统进化树分析显示,大鳍鳠IgL蛋白质序列与斑点叉尾IgL 2型(G型)合为一支,与其它硬骨鱼类IgL2型聚为一簇。组织分布研究表明,大鳍鳠IgL2基因表达量在脾脏最高,其次是鳃和头肾,这明显与大鳍鳠IgL3型基因表达方式不同。注射嗜水气单胞菌后,大鳍鳠IgL2基因转录表达量在脾脏、鳃和头肾都随时间发生变化。IgL2基因转录表达量在脾脏4 d就到达高峰,在鳃1 d就达到峰值。这些应答规律与IgL3基因差异显著,推测,IgL2的表达主要参与鳃、肠和皮肤主导的粘膜免疫。

藏系绵羊BMP4基因克隆及组织表达分析

本试验旨在获得藏系绵羊BMP4基因序列,并分析其生物学特征,同时阐明该基因在不同组织中的表达情况。利用RT-PCR技术克隆藏系绵羊BMP4基因序列,利用实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qPCR)检测其在藏系绵羊各个组织中的表达丰度。结果表明,获得藏系绵羊BMP4基因CDS序列1230bp,共编码409个氨基酸,为不稳定亲水碱性蛋白;与绵羊、牛、山羊、小鼠和人的氨基酸序列具有98%以上的相似性;潜在的磷酸化位点共33个。qPCR结果显示BMP4基因在藏系绵羊的各个组织中均存在广泛表达,且在肺组织中表达水平最高,极显著高于其他组织(P<0.01)。本研究为进一步阐明BMP4基因在藏系绵羊脂质代谢中的功能奠定了基础。

依博素生物合成基因ste22的异源置换研究

目的依博素是由链霉菌产生的一种新型胞外多糖,具有显著抗类风湿性关节炎的作用,我们研究已确定了该多糖的生物合成基因簇(ste)。为了对依博素结构进行改造以提高其生物活性,对其生物合成基因ste22进行了异源置换研究。方法采用PCR扩增方法从乳酸菌获得了编码葡萄糖糖基转移酶的基因gtf,通过基因同源重组双交换,从链霉菌中置换了ste22基因。采用白细胞介素-1合成酶活性测定方法及小鼠巴豆油急性炎症模型,初步确定了基因置换株的依博素衍生物生物活性。结果获得了葡萄糖糖基转移酶基因置换株Streptomyces sp.139(gtf-22),产生了依博素新衍生物EPS-22g。研究表明该衍生物与依博素相比,葡萄糖比例从2.14%显著上升到48.64%,体外活性实验显示,其对炎症细胞因子白细胞介素-1合成关键酶ICE抑制率高于依博素,小鼠巴豆油急性炎症体内活性分析结果证明,该衍生物抑制活性亦高于依博素。结论采用异源基因置换生物合成基因的方法改造依博素产生菌,可能是获得生物活性较好新多糖衍生物的一种有效手段。

共词分析及网络分析法探测乳腺癌转移相关基因

目的:探测乳腺癌转移相关的基因,为乳腺癌转移的早期诊断和个性治疗提供参考。方法:检索Pub Med数据库获取文献,利用Meta Map进行概念匹配,下载匹配结果,并导入到数据分析软件,得到乳腺癌转移相关基因和基因-基因矩阵;使用Ucinet6建立乳腺癌转移相关基因的相互作用网络,分析网络的相关指标。结果:tp53、thra、erbb2、esr1、cdh1、egfr、nr4a1、cd69等是乳腺癌转移核心基因。结论:基于共词分析法能获得乳腺癌转移相关基因,但cd69对于乳腺癌转移的具体过程尚不明确,需要进一步验证。

溶杆菌SNNU513基因gfp标记及在玉米根部定殖

溶杆菌属细菌在植物病害生物防治中有着广阔的应用潜力。本文以本实验室从中药材远志分离筛选的溶杆菌属新菌株Lysobacter sp.SNNU513为材料,筛选出高效制备该菌株感受态细胞Inoue法,电击转化条件为场强20 kV/cm、电脉冲时间5 ms时可将含绿色荧光蛋白基因gfp的质粒pGLO导入该菌株感受态细胞中,重组菌SNNU513-pGLO能高效、稳定表达绿色荧光蛋白基因,与出发菌株的生长特性、抑菌活性等生物学特性差异不显著。将成功构建的重组菌SNNU513-pGLO用于检测该菌株在玉米根部的定殖规律,结果表明,定殖量从表皮到韧皮部有明显减少趋势。

细胞分裂周期蛋白2启动子报告基因载体的构建与鉴定

目的构建细胞分裂周期蛋白2(Cdc2)基因启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-Cdc2-promoter,并检测其转录活性。方法根据UCSC软件查找的人基因组DNA的Cdc2启动子序列并设计两端引物,扩增人基因组DNA中的Cdc2启动子。用限制性内切酶SacⅠ和XhoⅠ双酶切质粒pGL3-Basic和Cdc2启动子后,将Cdc2基因启动子插入到pGL3-Basic报告基因载体上。重组质粒命名为pGL3-Cdc2-promoter。将其与内参质粒pRL-SV40瞬时共转染骨肉瘤细胞U2OS,检测双荧光素酶活性。结果成功构建Cdc2基因启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-Cdc2-promoter,质粒酶切及测序结果完全正确。瞬时共转染pGL3-Cdc2-promoter/pRL-SV40组荧光素酶活性为1.591 5±0.199 8,高于转染pGL3-Basic/pRL-SV40组的荧光素酶活性值0.049 9±0.010 4。结论 pGL3-Cdc2-promoter在骨髓瘤细胞U2OS细胞中能被转录激活,为进一步将其用于抗肿瘤药物的筛选与评价奠定了基础。

人类口腔黏膜上皮细胞提取基因组DNA方法的初步研究

目的探索从人类口腔黏膜上皮细胞中提取基因组DNA方法的可行性。方法分别采用煮沸法和碱裂解法从人口腔黏膜上皮细胞提取基因组DNA,然后与临床常用的碘化钠(NaI)法提取的人全血基因组DNA进行比较。结果煮沸法和碱裂解法2种方法均能从口腔黏膜上皮细胞抽提到DNA,提取的DNA浓度虽低于NaI法,但用2种方法提取到的DNA样品进行聚合酶链反应,均能获得满意效果,与常规NaI法无明显差异。结论从人口腔黏膜上皮细胞提取基因组DNA简便、快捷、无损,在临床上具有潜在的应用价值。

先天性厚甲症一家系的KRT基因突变分析

目的检测一先天性厚甲症(PC)家系的致病基因KRT6a、KRT6b、KRT16、KRT17,以期找到其可能的致病突变。方法常规收集该家系成员外周静脉血,同时采集同地区100名健康自愿者外周血作为正常对照。分别提取DNA,运用聚合酶链反应(PCR)扩增基因KRT6a、KRT6b、KRT16、KRT17的全部外显子及其侧翼内含子序列,产物纯化后直接行DNA测序,比对分析其基因突变位点和类型。结果 PC患者KRT6a基因第1号外显子存在错义突变c.521T>C(p.Phe174Ser),而正常家系成员和正常对照组均无此突变,KRT6b、KRT16和KRT17基因也未发现致病突变。结论该PC家系的患者存在一个错义突变——KRT6a基因第1号外显子c.521T>C(p.Phe174Ser)。该突变是导致PC发病的分子基础。

我国大豆生产波动动因分析——基于省际面板模型的实证研究

在我国大豆生产波动频繁的情况下,找出影响大豆单产、种植面积的影响因素是实现“提单产、稳面积”的首要举措。研究采用1999~2020年21个省份面板数据,在分析大豆单产、种植面积的变化趋势基础上,根据大豆单产增减趋势,把大豆产区划分成增产区、减产区和波动区,采用改进的面板数据模型分别对三个产区的大豆单产和种植面积的影响因素进行实证分析。结果表明,机械化收割、产研结合、农药投入、小型拖拉机的投入是影响不同区域大豆单产的显著因素;机械化耕作是提升所有区域种植面积的显著因素,玉米种植面积、化肥投入、农药投入、灌溉条件、科研资金与人员投入、产研结合、机械化收割是影响不同区域大豆种植面积显著因素。根据分析,提出了相应政策建议。

近代遗传单位概念在中国的传播与“gene”的中译

20世纪初,随着遗传学的进步,经典遗传学知识开始传入中国,“gene”一词在出现不久后也进入国人的视野,并产生了若干译名。经过四十余年的积淀,中文“基因”一词最终得到普遍使用。作为一个全新的概念,“基因”一词的中译和演变,是反映近代遗传学知识在中国的建构与本土化过程的典型案例。中国近代遗传学共同体对译名学术性和普及性等要素的反复衡量,也体现了多种因素在科学传播中对概念形成的共同作用。

胃癌耐药细胞株SGC7901/阿霉素中miR-185的表达及对细胞多药耐药性的影响

目的检测miR-185在胃癌组织及细胞株中的表达,探讨miR-185在胃癌多药耐药性(MDR)发生机制中的作用。方法选取2014年3—5月于河北医科大学第四医院行胃癌切除术的20例患者胃癌及癌旁组织标本,荧光定量PCR技术检测胃癌及癌旁组织和人胃腺癌细胞株SGC7901、正常胃上皮细胞株GES-1、耐阿霉素(ADR)的胃癌MDR细胞株SGC7901/ADR的miR-185表达水平。采用miR-185模拟物或无关对照序列转染细胞株SGC7901/ADR,检测其对化疗药物ADR、5-氟尿嘧啶(5-FU)、草酸铂(L-OHP)的敏感性,荧光定量PCR和Western blotting技术检测多药耐药基因MDR1/P-gp、MRP-1、GST-π、LRP的mRNA及蛋白表达水平。结果癌旁组织和胃癌组织miR-185相对表达水平分别为(0.910±0.142)、(0.243±0.045),差异有统计学意义(t=20.025,P<0.001)。细胞株GES-1、SGC7901、SGC7901/ADR miR-185相对表达水平分别为(0.903±0.117)、(0.630±0.101)和(0.191±0.030),差异有统计学意义(F=46.850,P<0.001)。其中,细胞株SGC7901、SGC7901/ADR miR-185相对表达水平低于GES-1,细胞株SGC7901/ADR miR-185相对表达水平低于SGC7901(P<0.05)。ADR、5-FU和L-OHP对不同转染处理后的细胞株SGC7901/ADR抑制率比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。其中,ADR、5-FU和L-OHP对miR-185模拟物转染的细胞株SGC7901/ADR抑制率高于未转染和无关对照序列转染(P<0.05)。经不同转染处理后,细胞株SGC7901/ADR多药耐药基因MDR1/P-gp、MRP-1和GST-πmRNA和蛋白相对表达水平比较,差异有统计学意义(P<0.05)。其中,miR-185模拟物转染的细胞株SGC7901/ADR多药耐药基因MDR1/P-gp、MRP-1和GST-πmRNA和蛋白相对表达水平低于未转染和无关对照序列转染(P<0.05)。结论胃癌细胞miR-185表达下调,通过上调miR-185的表达可提高胃癌细胞对化疗药物的敏感性,其机制可能是miR-185调控部分多药耐药基因的表达。

主动外排机制在鲍曼不动杆菌耐药性中的作用

目的探讨细菌主动外排机制在临床分离的鲍曼不动杆菌耐药性中的作用。方法琼脂稀释法检测临床分离的鲍曼不动杆菌对常用抗生素的耐药性,测定经外排泵抑制剂碳酰氰基-对-氯苯腙(CCCP)处理前后鲍曼不动杆菌对抗生素最小抑菌浓度(MIC)的变化,以聚合酶链反应(PCR)、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测多重耐药主动外排基因adeB及其表达水平。结果临床分离的鲍曼不动杆菌对常用抗生素耐药率高且具有多重耐药性,并存在药物的主动外排。所有临床分离的菌株均能检测到adeB基因,但多重耐药株表达水平明显高于敏感株(P<0.01)。结论临床分离的鲍曼不动杆菌的耐药性尤其是多重耐药性与外排泵介导的耐药机制密切相关。

NIK和IKKβ连接蛋白、C-myc和细胞周期蛋白D1在结肠癌组织中的表达及意义

目的检测结肠癌组织中NIK和IKKβ连接蛋白(NIBP)、磷酸化p65(p-p65)和C-myc、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)的表达,并探讨其意义。方法收集广西医科大学第一附属医院结直肠外科2013年2月—2014年2月经外科手术切除及消化内科肠镜活检的部分标本151例,其中正常结肠黏膜16例、结肠腺瘤21例、结肠癌114例。采用SP免疫组化法分别检测正常结肠黏膜组织、结肠腺瘤组织及结肠癌组织NIBP、p-p65、C-myc和cyclin D1阳性细胞表达率;分析结肠癌组织中NIBP、C-myc和cyclin D1阳性细胞表达率与p-p65阳性细胞表达率的相关性。结果正常结肠黏膜组织、结肠腺瘤组织、结肠癌组织的NIBP、p-p65、C-myc和cyclin D1阳性细胞表达率比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结肠癌组织NIBP、p-p65、C-myc和cyclin D1阳性细胞表达率高于正常结肠黏膜组织和结肠腺瘤组织(P<0.017);正常结肠黏膜组织、结肠腺瘤组织中NIBP、p-p65、C-myc和cyclin D1阳性细胞表达率比较,差异无统计学意义(P>0.017)。不同组织学类型、浸润深度及有无淋巴结转移、远处转移患者结肠癌组织NIBP、p-p65、C-myc和cyclin D1阳性细胞表达率比较,差异有统计学意义(P<0.05)。分化程度越低、TNM分期越高、Duke's分期越高患者结肠癌组织NIBP、p-p65、C-myc和cyclin D1阳性细胞表达率越高(P<0.05)。NIBP、C-myc、cyclin D1阳性细胞表达率与p-p65阳性细胞表达率均呈正相关(P<0.05)。结论 NIBP可能通过激活核因子κB(NF-κB)信号转导通路上调C-myc和cyclin D1等的表达而影响结肠癌的治疗发生、发展、侵袭和转移,为临床发现结肠癌的治疗新靶点提供了参考依据。

γ-tubulin、HER-2和k-ras在乳腺癌组织中的表达及临床意义

目的观察γ-tubulin、HER-2、k-ras在乳腺癌组织中的表达情况,探讨其临床意义。方法选择2010年1月—2014年12月手术切除的乳腺原位导管癌(DCIS)、浸润导管癌(IDC)及正常乳腺组织各60例,观察各组织中γ-tubulin、HER-2和k-ras的表达情况。结果光镜下可见γ-tubulin阳性表达于上皮细胞质中,HER-2和k-ras阳性位于细胞膜。乳腺癌组织中γ-tubulin、HER-2和k-ras阳性表达率均高于正常乳腺组织,且IDC组织中HER-2和k-ras阳性表达率高于DCIS组织(P<0.05)。结论γ-tubulin、HER-2和k-ras在乳腺组织中高表达,提示其共同参与了乳腺癌的发生发展过程。

GDNF、GFRα1和RET在先天性直肠肛门畸形中的表达及意义

目的探讨神经胶质细胞源性的神经营养因子(GDNF)、其受体GFRα1和原癌基因RET在先天性直肠肛门畸形肠壁组织中的表达及意义。方法收集经手术治疗的直肠肛门畸形患者12例,男8例,女4例,年龄3 d^2岁,高位无肛2例,中位无肛4例,低位无肛6例。采用免疫组织化学和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测12例患儿肠壁盲端组织和距离盲端3 cm处的组织标本中RET、GDNF和GFRα1的表达。结果高、中、低位无肛患儿盲端标本中均缺乏神经节细胞,且RET、GDNF和GFRα1在盲端中均未见表达;距离盲端3 cm处,高、中、低位无肛组织中有神经节细胞,存在RET、GDNF和GFRα1的表达,中、低位无肛组织中呈棕褐色为强阳性,而高位无肛呈淡黄色和棕黄色为弱阳性或者阳性;术后功能随访,高位无肛中1例出现污粪,1例出现稀便不能控制,无肛门失禁情况。中、低位无肛中有1例出现直肠黏膜脱出,经坐浴肛门护理好转,1例出现排气时偶有污便,其余8例术后排便功能未见异常。结论先天性直肠肛门畸形患儿的直肠末端中神经营养因子GDNF、GFRα1和RET的低表达可能与直肠肛门畸形术后排便功能不良关系密切。

持续封闭负压引流材料在会阴部创面治疗中的应用及机制研究

观察和研究持续封闭负压引流材料（VSD）在外科会阴部创面治疗中的应用和机制。采用随机对照研究的方法，我科室2007～2013年间对336例会阴部手术患者（肛周脓肿、骶尾部褥疮等）为研究对象，分别分为干预组168例和对照组168例。干预组采用 VSD 治疗，对照组采用传统换药方法。同时应用免疫组化方法对治疗1周后两组的局部组织 C －ski 表达情况进行比较。应用 VSD 的患者的手术部位或创面取得较理想的治疗效果。创面愈合时间明显缩短，干预组平均为14±1．2 d，而对照组平均为27±1．4 d。而 C －ski 表达在 VSD 组有明显升高，有统计学差异。将 VSD 应用在会阴部创面中，可促进 C －ski 基因表达。该引流材料的应用明显缩短患者住院天数，减少了患者痛苦。