‘南林895杨’遗传转化体系的优化

以‘南林895杨’为研究材料,采用正交设计方法,对以农杆菌介导法转基因过程中的几个关键因素进行了筛选比较。并利用GUS染色对转化效果进行统计分析,发现‘南林895杨’合适的遗传转化体系为:预培养3 d,菌液浓度OD600值为0.8,侵染8 min,共培养3 d。通过抗性筛选确定卡那霉素在分化阶段的筛选浓度为20 mg/L,在生根阶段的筛选浓度为10 mg/L,头孢霉素浓度为100 mg/L。优化了‘南林895杨’遗传转化体系,为利用转基因技术开展杨树的遗传改良研究奠定了基础。

盐胁迫对‘南林895’杨组培再生芽生根及抗氧化能力的影响

以‘南林895’杨经组培获得的2 cm长再生芽为试验材料,研究不同浓度NaCl处理下再生芽不定根发生能力及其耐盐能力。结果表明:‘南林895’杨再生芽在75 mmol/L以下能够正常产生不定根,100 mmol/L完全抑制不定根的形成。25～50 mmol/L盐处理能够促进‘南林895’杨再生芽不定根的伸长,增加根数,提高叶绿素a及总叶绿素的含量。25 mmol/L处理的SOD、CAT、POD、GR 4种保护酶与对照之间没有显著性差异,MDA含量和电导率也低于对照;而在高浓度盐处理下(75～100 mmol/L),SOD、CAT、GR保护酶活性下降,导致膜透性加大,MDA含量增加,POD和AsA-POD酶活性的提高有助于缓解盐胁迫对‘南林895’杨造成的氧化损伤。

转PeTLP基因‘南林895’杨对土壤微生物的影响及外源基因分子检测

转基因技术是当今林木分子育种的手段之一,但其生物安全性问题广受关注。本研究选择进入田间试验的转PeTLP(类甜蛋白)基因‘南林895’杨Populus deltoides×P. euramericana cv.‘Nanlin 895’为材料,开展转基因杨树对土壤微生物影响及外源基因分子检测等分析。结果显示,转基因杨树在进入田间试验一年后,外源基因仍稳定存在于转基因植株基因组中;转基因与非转基因植株根系周围可培养土壤微生物菌落数量无显著差异,表明外源基因对土壤微生物无显著影响;对土壤微生物总DNA进行分子检测也显示外源基因未有向周围土壤微生物扩散现象;叶片化感作用试验显示转基因植株叶片未对生菜Lactuca sativa L. var. ramose Hort.种子的生长造成显著影响。初步分析结果表明,转PeTLP基因‘南林895’杨在进入田间试验后未出现外源基因水平转移,也未对周围生态环境造成显著影响。

‘南林895’杨PdNAC1基因克隆及蛋白的亚细胞定位

以‘南林895’杨（Populus deltoides×P．euramericana cv ‘Nanlin895’）为材料，通过RACE－PCR技术，获得了NAC1基因的全长cDNA，命名为PdNAC1。该序列含有1个长906 bp的开放阅读框，编码302个氨基酸。该蛋白的分子质量为34．23 ku，等电点为7．44。分析其氨基酸序列发现，该蛋白具有典型NAC转录因子特征，NAM结构域位于11-135个氨基酸之间，含有A、B、C、D、E 5个亚结构域，该区域可以结合DNA；而C端含有一个高度变异的转录激活区。利用杨树原生质体对PdNAC1蛋白进行细胞亚定位，结果发现PdNAC1不仅明显定位于细胞核中，而且在细胞膜上也有表达。但PdNAC1是否具有相应的跨膜结构域尚不明确。

杨树PeHAM1和PeHAM2基因的克隆、表达及亚细胞定位

GRAS蛋白是一类植物特有的、古老的转录因子家族,在植物整个生长发育过程中都发挥着调控作用。以‘南林895’杨(Populus deltoides×Populus. euramericana cv.'Nanlin895')不定根为材料,通过RACE技术克隆鉴定了两个GRAS转录因子,Pe HAM1和PeHAM2。Pe HAM1基因cDNA全长为2 032 bp,包含一个1 647 bp的开放阅读框,推测编码548个氨基酸;PeHAM2基因cDNA全长为2 856 bp,包含一个2 106 bp的开放阅读框,推测编码701个氨基酸。Pe HAM1和PeHAM2蛋白C端都具有LHRI、VHIID、LHRII、PFYRE和SAW等几个典型的保守结构域;系统进化分析表明两者均属于GRAS转录因子家族中的HAM亚家族。PeHAM1基因在杨树不定根发育过程中具有动态的表达模式,在茎和叶中几乎不表达;PeHAM2基因在根、茎、叶中均有表达。原生质体瞬时表达分析表明,Pe HAM1和PeHAM2蛋白均定位于细胞核。进一步分析发现,PeHAM1和PeHAM2基因序列均存在ptc-miR171的剪切位点。本研究表明PeHAM1和PeHAM2可能参与了杨树不定根的生长和发育,这为进一步探究HAM亚家族基因在杨树不定根发育过程中的调控机理提供了坚实的基础。