牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法,根据GenBank收录的牛冠状病毒AKS-01株N基因序列(KU886219)保守区设计特异性引物和探针,构建重组质粒并进行反应条件优化、特异性试验、重复性试验以及敏感性试验,建立一种检测BCoV的TaqMan荧光定量PCR方法。结果显示,建立的牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法特异性、敏感性和重复性均良好。该方法BCoV重组质粒标准品在5.75×10^(7)~5.75×10^(3)copies/μL时与Ct值呈现良好线性关系,该方法对牛轮状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛副流感病毒3型均无交叉反应,特异性良好;该方法对BCoV重组质粒标准品最低检测限为5.75×10^(1)copies/μL;批内和批间重复性试验结果稳定,变异系数均小于2%。利用所建立的TaqMan荧光定量PCR方法对收集的132份样品进行检测,与常规PCR相比,两者符合率为96.21%,可为BCoV的临床检测和流行病学调查提供技术支持。

Reading man皮瓣修复术治疗皮肤缺损的疗效观察

目的:探讨Reading man皮瓣修复术在全身不同部位皮肤缺损及其预防瘢痕增生的临床疗效。方法:回顾性分析2021年1月—2023年10月该科应用Reading man皮瓣修复术治疗全身不同部位皮肤软组织缺损的20例患者临床资料。结果:所有患者皮瓣均成活。术后随访时间为3~24个月,所有皮瓣血运良好,色泽红润,质地柔软,外观适宜,局部皮肤张力较低,手术切口瘢痕增生不明显,切口周围软组织无明显形变,周围关节活动度正常。所有患者均恢复良好,疗效满意。结论:Reading man皮瓣特有的设计可以很好地解决全身多部位较大的皮肤软组织缺损,尤其在术中可以最大限度地减少正常皮肤的切除,术后外观、功能及皮肤瘢痕增生均有较满意的表现,且不存在自体皮移植带来的供皮区损伤。

牛支原体和丝状支原体丝状亚种双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用

牛传染性胸膜肺炎和牛支原体病均为重要的牛传染病,两者均可致牛出现呼吸系统症状,临床上难以区分。为建立鉴别诊断牛传染性胸膜肺炎和牛支原体病的双重Taq Man荧光定量PCR检测方法,本研究根据这两种病的病原丝状支原体丝状亚种和牛支原体的基因组保守区域(丝状支原体丝状亚种nt826-nt1742,牛支原体nt189-nt618)分别设计引物与探针,通过优化反应体系与反应条件,建立同时检测这两种病原的Taq Man荧光定量PCR检测方法。特异性试验结果显示,该方法仅对丝状支原体丝状亚种模拟样品和牛支原体检测结果为阳性,而巴氏杆菌、牛传染性鼻气管炎病毒、无乳支原体、山羊支原体山羊肺炎亚种、丝状支原体山羊亚种、关节炎支原体Leachii株检测结果均为阴性,特异性较强。分别以1.0×10~7拷贝/μL~1.0×10~1拷贝/μL的p EASY-Mmm和p EASY-Mb质粒标准品为模板,进行敏感性试验,结果显示,该方法对丝状支原体丝状亚种和牛支原体重组质粒标准品的检测限均为1.0×10~1拷贝/μL,敏感性较高。对不同浓度质粒标准品混合物的重复性试验结果显示,组内与组间重复性试验变异系数均小于2.5%,重复性较好。利用该方法对112份临床样品(104份鼻拭子、8份肺组织样品)检测,结果显示,丝状支原体丝状亚种检测结果和已发表PCR方法检测结果一致,均为阴性,而本实验建立的方法检测出4份牛支原体阳性样品,且经测序证实检出样品为真实阳性样品,而已发表的多重PCR方法检测该病原结果均为阴性。本研究建立了能够同时检测丝状支原体丝状亚种和牛支原体的双重Taq Man荧光定量PCR方法,其特异性强、敏感性高、重复性好,可用于各种临床样品的检测,为这两种病原的快速检测和流行病学调查提供了技术手段。

猪肺炎支原体和猪鼻支原体TaqMan双重荧光PCR检测方法的建立及应用

为建立一种可快捷鉴别检测猪肺炎支原体(Mhp)和猪鼻支原体(Mhr)的方法,针对Mhp的183基因和Mhr的p37基因保守片段,分别设计合成引物及TaqMan探针,优化反应条件,建立一种可同时检测Mhp和Mhr的TaqMan双重荧光PCR方法,并评价其特异性、敏感性和重复性。结果表明,该方法特异性强,检测其他常见猪呼吸系统病原不发生交叉反应;对标准品pMD18-T-Mhp-183、pMD18-T-Mhr-P37的最低检测限分别达45.2 copies/μL和29.7 copies/μL,比普通PCR检测灵敏度提高10^(3)~10^(4)倍;该方法检测结果的批内与批间变异系数均小于2%。用该方法检测145份广西自治区内临床样品,从中检出82份Mhp和9份Mhr阳性样品。该方法可用于临床样品快速检测及实验室Mhp和Mhr的鉴定,可为Mhp和Mhr在猪群中的早期监测提供技术支持。

猪细小病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

旨在建立一种猪细小病毒(PPV)快速准确PCR检测方法,根据PPV VP2基因的保守序列设计并合成1对特异性引物和1条特异性探针,建立了可检测PPV的TaqMan荧光定量PCR检测方法。建立的检测方法敏感性高,最低可检测8.76×10^(1)copies/μL的PPV VP2基因标准品;特异性试验结果显示,该方法检测猪流行性腹泻病毒、猪圆环病毒2型、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒均无交叉反应;重复性试验组内与组间变异系数均低于2%,重复性良好。用该方法检测102份临床样本,检出阳性样本16份,阳性检出率为15.69%,将检测出的阳性样本进行PCR扩增并测序,证实检测样品中确实存在PPV。该方法敏感性高、特异性强,适用于PPV的定量检测及猪细小病毒病的流行病学调查。

TaqMan探针双重实时荧光定量PCR法同步检测兰花中的建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒

为建立一种同步定量检测建兰花叶病毒(cymbidium mosaic virus,CymMV)和齿兰环斑病毒(odontoglossum ringspot virus,ORSV)的高效检测方法,本研究根据CymMV和ORSV CP基因高度保守区分别设计引物和探针并筛选,获得156 bp和148 bp的靶标序列及对应的最优特异性引物探针组合,建立了基于TaqMan探针的双重实时荧光定量PCR方法。该方法最低检出限为1拷贝或6.2×10^(-3)fg,最低稳定检出限为10拷贝或6.2×10^(-2)fg,是RT-PCR的10~100倍;构建的标准曲线线性关系良好,扩增效率分别为97.7%和100.2%,相关系数R2分别为1.000和0.999;对其他5种常见病毒均无扩增曲线,检测特异性强;批组内与批组间重复性试验Ct值变异系数≤0.60%,重复性和稳定性好。利用该方法和基因芯片法分别对4个种属的66个兰花样品进行方法验证,该方法相较于基因芯片法检出率提高了53.85%(CymMV)和162.5%(ORSV)。综上所述,本方法可同时高通量检测CymMV和ORSV 2种病毒靶基因,结果可靠,应用前景广阔,可为开展病毒精准鉴定、科学防控以及从源头遏制病毒传播提供技术支撑。

鸡毒支原体 Taq Man实时荧光定量PCR检测方法的建立

为快速检测鸡毒支原体,根据鸡毒支原体的保守基因设计特异性引物和Taq Man探针,建立鸡毒支原体Taq Man实时荧光定量PCR方法并分析鸡毒支原体培养过程中颜色单位改变法(color change unit,CCU)和荧光定量PCR检测的相关性。结果显示,标准曲线y=-3.646x+44.208,相关系数R^(2)=0.998,最低检测限度为1 copy/μL;与其他菌株等均无交叉反应;组内和组间变异系数均小于3%,表明该方法具有良好的稳定性和可重复性。用建立的实时荧光定量PCR检测方法对26份临床样品进行检测,该方法较普通PCR方法检出率更高。建立的荧光定量PCR与CCU显示鸡毒支原体在对数生长期时,两者具有一定的对应关系。表明建立了鸡毒支原体Taq Man探针实时荧光定量PCR检测方法,可实现对鸡毒支原体的快速检测,为鸡毒支原体感染的防控提供技术基础。

羊贝氏柯克斯体TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立检测贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii)实时荧光定量PCR方法,根据GenBank上收录的C.burnetii RSA439株com1基因序列(CP040059.1)保守区设计特异性引物和探针,并构建重组质粒及优化反应条件,以期建立一种检测贝氏柯克斯体的Taq Man荧光定量PCR方法。结果显示,该方法所建立标准曲线线性关系良好;敏感性试验结果显示,最低检出限为2.45×10^(2) copies/μL,与PCR最低检出限为2.45×10^(4) copies/μL相比较,灵敏度提高了100倍;对羊支原体、羊流产衣原体、羊布鲁氏菌等均无交叉反应,批内和批间重复性试验结果稳定,变异系数均小于3%,说明特异性、重复性好;利用该方法对收集的126份样品进行检测,结果显示样品阳性率为9.52%,常规PCR检测阳性率为7.14%,符合率为90.47%。该方法可为贝氏柯克斯体临床上快速检测及防控提供技术支持。

基于Taq-Man探针的多重qPCR检测DuCV·DEV·NGPV方法的建立与应用

[目的]建立一种快速、特异的鸭圆环病毒(DuCV)、鸭肠炎病毒(DEV)、新型鹅细小病毒(NGPV)的多重荧光定量PCR方法。[方法]针对DuCV、DEV、NGPV的基因保守区域序列,设计合成3对特异性引物及3种荧光基团标记的Taq-Man探针。构建重组质粒标准品,优化反应条件。建立针对DuCV、DEV、NGPV的多重荧光定量PCR检测方法。[结果]该方法能同时鉴别检测DuCV、DEV、NGPV,并且与其他常见鸭病毒病不发生交叉反应。对DuCV、DEV、NGPV最低检出限均为2.5×10^(1)copies/μL。该方法重复性好,组间和组内试验变异系数低于1.0%。用该方法检测150份临床样本,结果显示,DuCV、DEV、NGPV的阳性率分别为32.0%(48份)、23.3%(35份)和18.7%(28份),DuCV和DEV混合感染率为4.6%(7份),DuCV和NGPV混合感染率为8.6%(13份),总阳性率为87.3%(131份),未检出DEV和NGPV混合感染的结果。与常规PCR检测方法比较,阳性符合率为100%。[结论]该研究建立的基于Taq-Man探针的多重荧光定量PCR方法能够同时、快速、定量检测DuCV、DEV、NGPV。较普通PCR更敏感,实用性更强,有效避免了多次检测耗时长、费用高的问题,为DuCV、DEV、NGPV的监测和防控提供了有效可靠的检测技术。

DOPO-MAN改性大豆油基水性聚氨酯丙烯酸酯的制备

本文以9,10-二氢-9-氧杂-10-磷杂菲-10-氧化物(DOPO)、马来酸酐(MA)和二乙醇胺(DEA)为原料制备出DOPO-MAN,以其为改性剂制备出可UV-LED固化的DOPO-MAN改性大豆油基水性聚氨酯丙烯酸酯乳液。将乳液与光引发剂(TPO)混合均匀后经UV-LED光固化,制成固化膜。实验结果表明,当DOPO-MAN的含量为20%时,固化膜的极限氧指数为24.3,UL-94测试也达到了V-1级别。

诺如病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的设计与优化

为设计一种快速、高灵敏度检测诺如病毒(Norovirus,NV)的方法.本文通过检索参考NCBI数据库中收录的国内典型流行的NV毒株BJSMQ的基因序列NC_039476.1,合成了NV的标准重组质粒,根据NV的ORF1基因保守序列设计一组特异性引物和荧光探针;通过正交试验进行程序及试剂反应体系的优化,设计TaqMan荧光定量PCR检测方法.结果表明该检测方法具有高灵敏度,最低检测限可达1.2 copies/μL,且在标准重组质粒浓度1.2×10^(5)~1.2×10^(0) copies/μL范围内具有较好的线性关系,其R^(2)=0.9907;该方法特异性强,在病毒的混合重组质粒样液中仅与NV病毒反应;组内和组间的重复性良好,变异系数(CV)值均小于2%;在数字PCR试验中进一步验证了该方法的可行性.本文设计的TaqMan荧光定量PCR检测方法可用于NV毒株的快速准确检测,有望成为NV诊断的有效工具.

基于TaqMan MGB探针的大豆北方茎溃疡病菌快速检测

为准确快速检测检疫性真菌大豆北方茎溃疡病菌,根据大豆北方茎溃疡病菌及其近似种的模式分离物ITS序列差异,设计并合成1对特异性引物和1条MGB探针,建立大豆北方茎溃疡病菌的实时荧光PCR检测方法。特异性试验结果表明:该检测方法能特异性检测大豆北方茎溃疡病菌。灵敏度试验结果表明:最低检测限量为10μL反应体系中总DNA含量1.0 pg;实时荧光PCR优化反应条件为引物终浓度0.5μmol·L^(-1),探针终浓度0.6μmol·L^(-1)。实际样品检测结果表明:该方法可用于疑似受大豆北方茎溃疡病菌侵染的进境大豆样品的检测与初筛。此方法准确、快速、灵敏,整个反应过程约1 h,检测过程完全闭管,无需PCR后续处理,可作为大豆北方茎溃疡病菌检测防控方法。

基于电子商务环境的农机管理系统设计

介绍了电子商务环境的背景和现状,详细描述了农机管理系统的实际需求和业务流程,并根据系统设计原则设计了系统总体架构,最后从人机管理、作业管理及综合信息等3个方面实现了农机管理系统。系统在测试过程中取得了较好的应用效果,是一种具有广泛应用前景的高效农机管理系统。

鸡贫血病毒Taq Man探针荧光定量PCR检测方法的建立

根据鸡贫血病毒(CAV)的基因序列,选取一段高度保守的基因序列作为目的片段设计引物与探针,将该目的片段克隆到pMD18-T载体中,作为阳性标准品。通过优化荧光定量PCR反应条件,建立了CAV的荧光定量PCR检测方法。结果表明,该检测方法的敏感性达到10个病毒拷贝/μL,与其他禽病病毒无交叉反应,批间与批内重复试验相关系数都小于5%。实验数据证明该检测方法敏感性高,特异性好,重复性佳。

基于VOKEL-MAN平台的危险穴位可视化研究

目的将临床常用18个危险穴位融入汉堡VOXEL-MAN可视人体中,建立针灸学三维影像浏览器。方法采用标准化二维描述的腧穴三维定位法进行腧穴定位,球体模型表达腧穴,双色度椭球的三维分割法进行肌肉分割,图形建模法构建血管神经,语义网络法和构建智能物体模型法建立相关医学知识库。结果实现了危险穴位在可视人体中的定位与表达,完成了相关解剖结构的分割与可视化显示,建立了相关医学知识库,生成了QTVR格式的智能动画。结论能多层次、多角度、立体显示腧穴的解剖结构和针刺全过程,为提高临床针刺疗效和避免针刺意外事故服务,为针灸腧穴解剖学提供一种理想直观的教学手段和方法。

Taq Man实时荧光定量PCR检测猪伪狂犬病病毒方法的建立与初步应用

根据猪伪狂犬病病毒gE基因保守序列,设计合成引物和探针,优化反应条件,建立实时定量荧光PCR方法。实验结果表明,当50pmol/L的引物0.3μL和5pmol/L的探针0.5μL时,反应体系获得的CT值较小,而荧光强度增加值最大;制作的标准曲线显示各浓度范围内具有良好的线性关系;可检测到相当于20拷贝/μL的病毒DNA;与猪细小病毒、圆环病毒和猪瘟病毒等不发生交叉反应;敏感性比常规PCR电泳检测高约100倍。该方法具有快速、特异、敏感、可定量,并可同时检测大量样品等优点。

猪细小病毒4型Taq Man荧光定量PCR方法的建立与应用

根据GenBank中发表的猪细小病毒4型(PPV4)全基因组序列,针对其结构蛋白VP2基因的保守序列,设计合成特异性引物及Taq Man探针,以VP2克隆质粒为标准品,通过对探针浓度、引物浓度、dNTP浓度、镁离子浓度以及退火温度进行调整,建立了PPV4的Taq Man荧光定量PCR。反应条件优化后,该方法在6.73×109copies/μL^6.73×101copies/μL范围内线性关系良好,相关系数为0.998;对PPV4的最低检测限为6.73×101copies/μL。特异性试验结果显示,用该方法检测其他基因型猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒及猪圆环病毒2型等临床常见病毒,结果均为阴性。批内及批间变异系数均低于2%。用建立的荧光定量PCR方法和普通PCR方法对672份临床病料感染情况进行检测,阳性率为1.93%,而普通PCR检出率仅为1.63%。本研究首次报告在我国猪群中存在PPV4,同时建立的荧光定量方法为PPV4的检测、体外敏感细胞的筛选以及病毒器官嗜性的研究等提供了快速而敏感的分子检测技术。

基于VOXEL-MAN针灸学三维影像浏览器的研究

以腧穴解剖研究成果为基础,将临床常用的18个危险穴位的解剖结构数据融入汉堡大学VOXEL-MAN三维数字化虚拟人体中,开发一套VOXEL-MAN 3D Navigator:Acupuncture运行软件(针灸学三维影像浏览器),动态、三维显示腧穴的层次解剖结构和不同角度针刺所经过的断面解剖结构,并建立相关的知识库体系,能够加深对图像内容的理解,有利于提高临床针刺疗效和避免针刺意外事故的发生,并为针灸提供一种理想直观的多媒体教学手段和方法。

新型Taq Man-MGB探针实时荧光定量PCR检测人类mdr1基因

目的建立一种比现有方法敏感、准确性高、重复性好的人类mdr1基因的新型实时荧光定量PCR检测新方法。方法用Primer Express 2．0引物设计软件设计引物和MGB探针,以Taq Man-MGB探针技术为基础,运用Taq Man-MGB探针,以含有目的基因mdr1cDNA的质粒pHaMDR1／A为阳性模板,建立实时荧光定量PCR检测方法。结果所建立方法的最低检测限度为15个基因拷贝／反应,在待扩增DNA浓度为3．061×103 cps／ml-3．061×109cps／ml范围时,模板浓度与循环阈值(Ct)之间的相关性良好,决定系数r2为0．988243。结论应用Taq Man-MGB探针的实时荧光定量PCR方法检测人类mdr1基因,具有灵敏度高、特异性高和精确性高等优点。

鸭坦布苏病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据鸭坦布苏病毒(DTMUV)BYD-1株基因序列设计特异性引物和TaqMan探针,建立了快速检测DTMUV的实时荧光定量RT-PCR方法。特异性结果显示,DTMUV显示阳性,而3株非鸭坦布苏病毒均显示阴性,说明该方法具有高度特异性。其表达式为Ct=-3.32×lg Copy number+41.151,R2=0.998,R循环效率Eff%=100.072,DNA拷贝数在101～108范围内检测曲线有良好的线性关系,对质粒标准品最低检测限为1.0×101拷贝/μL,变异系数低于5%。利用该方法分别对攻毒感染具有典型鸭新型黄病毒病临床症状和病理变化的蛋鸭的脾脏和肝脏组织进行检测,阳性率均为100%,而用本实验室建立的普通RT-PCR方法检测的阳性检测率为85%(17/20)和75%(15/20)。建立的方法具有敏感性高、特异性好、稳定性强的特点,可用DTMUV早期感染的快速诊断和流行病学调查。