反相液相色谱法测定(反)-4-环已基-L-脯氨酸和(反)-4-苯基-L-脯氨酸

采用反相高效液相色谱法分离和测定（反）-4-环已基-L-脯氨酸和（反）-4-苯基-L-脯氨酸．在选定的色谱条件下，（反）-4-环已基-L-脯氨酸、（反）-4-苯基-L-脯氨酸和杂质之间具有较好的分离效果．该方法具有操作简单、快速、准确度和精密度较好，对同一（反）-4-环已基-L-脯氨酸试样多次测定，（反）-4-环已基-L-脯氨酸的日内、日间相对标准偏差（RSD）分别1．55％和0．09％；（反）-4-苯基-L-脯氨酸的日内、日间相对标准偏差（RSD）分别1．94％和1．79％.（反）-4-环已基-L-脯氨酸和（反）-4-苯基-L-脯氨酸的回收率分别为99．80％～100．40％和97．28％～100．00％．

生物转化L-脯氨酸生成反式-4-羟基-L-脯氨酸的定量分析方法

以芴甲氧羰酰氯（FMOC-Cl）为柱前衍生剂，四硼酸钠为缓冲溶液，建立了一种柱前衍生反相高效液相色谱（RP-HPLC）测定微生物转化L-脯氨酸生成反式-4-羟基-L-脯氨酸的定量分析方法。优化了衍生反应条件，当衍生反应体系中水和乙腈的比例为66∶34，pH值为9.9时衍生效果最佳。采用Agilent Extend C-18柱进行分离，以0.1%三氟乙酸水溶液和乙腈作为流动相，梯度洗脱，检测波长263 nm。L-脯氨酸和反式-4-羟基-L-脯氨酸均在0.01~500 mg/mL范围内线性关系良好，相关系数均大于0.999，检出限为5.00~7.00 ng/L，不同浓度下的平均回收率分别为98.9%~102%和97.9%~100%。该方法重现性好，精密度高，为定量分析微生物发酵液中的L-脯氨酸和反式-4-羟基-L-脯氨酸提供了有效方法。

putA与vgb基因对反式-4-羟基-L-脯氨酸产量的影响

反式-4-羟基-L-脯氨酸是在自然界中分布最广泛的一种羟脯氨酸,在医药、化工、食品和美容业等领域有广泛应用。为了在生物转化法生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的过程中减少菌体对底物脯氨酸的降解,利用Red/ET同源重组系统敲除putA基因,并比较野生型菌株与缺失型菌株在不同培养基中的反式-4-羟基-L-脯氨酸产量,再引入vgb基因,考察该基因对反式-4-羟基-L-脯氨酸产量的影响。结果表明:putA基因的缺失能阻止菌体降解脯氨酸;碳源充足的情况下,GC培养基更有利于反式-4-羟基-L-脯氨酸的生产;putA基因缺失型菌株能将被消耗的脯氨酸全部转化为反式-4-羟基-L-脯氨酸;vgb基因的存在能显著提高反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量。

L-脯氨酸-4-羟化酶的异源表达和合成反式-4-羟基-L-脯氨酸的条件优化

L-脯氨酸-4-羟化酶(L-Proline-4-hydroxylase,P4H)是依赖α-酮戊二酸(α-KG)和Fe2+的双加氧酶成员之一,在反式-4-羟基-L-脯氨酸(trans-4-hydroxy-L-proline,t-4Hyp)等重要手性化合物的生物合成中发挥关键作用。本研究构建了来源于Bradyrhizobium japonicum USDA 6的P4H重组大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)/p ET-28b-p4h BJ,SDS-PAGE和酶活检测结果表明,该菌株具有表达可溶性P4H和催化合成t-4Hyp的能力。通过优化,确定了该重组菌全细胞催化合成t-4Hyp较优的反应体系和条件:10 m L p H 6.5 80 mmol/LMES缓冲液、9 mmol/L L-Pro,6 mmol/L L-抗坏血酸,6 mmol/Lα-KG,0.8 mmol/L Fe SO4·7H2O,反应温度为35℃;在20 g/L湿细胞的催化反应中,t-4Hyp的合成量达到34.86 mg/L,比优化前(17.53 mg/L)提高了98.86%。该工作为进一步利用P4H生物催化法合成t-4Hyp奠定了一定的技术基础。

反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶基因密码子优化及表达

L-羟脯氨酸用途非常广泛,具有较好的应用价值,利用反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶能将L-脯氨酸通过生物转化法生成反式-4-羟基-L-脯氨酸.对指孢囊菌(Dactylosporangiumsp.)RH1的反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶基因密码子优化及蛋白可溶性表达条件进行了探索.基因p4hy的GC摩尔百分含量由73.63降至61.45;在23℃下,加入1mmol/L IPTG及分子伴侣pG-KJE8后可溶性蛋白的含量明显增多;密码子优化后的酶蛋白P4HY具有较好的催化生产羟脯氨酸的能力,反应40h后转化率达到72.8%.

代谢工程改造大肠杆菌合成反式-4-羟基-L-脯氨酸

通过比对筛选,从Micromonospora sp.CNB394中获得高活性的L-脯氨酸-4-羟基化酶,随后利用规律成簇的间隔短回文重复-associated protein 9基因编辑方法,通过强化L-脯氨酸合成途径和引入高活性的L-脯氨酸-4-羟基化酶,构建1株以葡萄糖为碳源合成反式-4-羟基-L-脯氨酸的大肠杆菌基因工程菌HYP15。摇瓶发酵30 h,工程菌的反式-4-羟基-L-脯氨酸产量达到13.6 g/L。5 L发酵罐分批补料发酵40 h,反式-4-羟基-L-脯氨酸产量达到48.6 g/L,糖酸转化率和平均生产强度分别达到21.6%和1.22 g/(L h),具有良好的工业应用前景。

基于表达和反应耦联的羟基化酶催化合成反式-4-羟基-L-脯氨酸

反式-4-羟基-L-脯氨酸(trans-4-Hpro)是药物合成中一种重要的中间体,可以用来合成碳青霉烯类抗生素类高附加值药物。目前,已有许多通过生物催化转化trans-4-Hpro的研究,但如何利用有限的酶资源实现其高效转化是难点。本文中,笔者基于已知脯氨酸4羟基化酶(GenBank No.BAA20094.1)的基因序列,利用基因挖掘工具获得Kutzneria albida来源的新型羟基化酶Ka PH1,以L-脯氨酸为底物,构建羟基化酶表达和反应过程耦联催化合成trans-4-Hpro的耦联反应体系。结果表明,Escherichia coli pET-28a-Ka PH1(E.coli Ka PH1)菌株具有高效催化合成反式-4-羟基-L-脯氨酸的能力,通过对E.coli Ka PH1催化体系的优化,以20 mmol/L L-脯氨酸作为底物,外源添加等摩尔浓度的2酮戊二酸,产量最高达到1246 mg/L,比优化前(1051 mg/L)提高了18.5%。进一步对表达和反应的耦联过程进行调控,反应体系中不添加2酮戊二酸,在底物浓度为20 mmol/L时,产量最高达到2223 mg/L,转化率为84.8%;在底物浓度为100 mmol/L时,产量最高达到7860 mg/L,转化率为59.9%。

(4S)-1-芴甲氧羰基-4-叠氮基-L-脯氨酸的合成

目的合成用于caspofungin类似物全合成的关键中间体——— (4S) 1 芴甲氧羰基 4 叠氮基 L 脯氨酸。方法以 (4R) 1 叔丁氧羰基 4 羟基 L 脯氨酸乙酯 (2 )为原料 ,经羟基甲磺酰化、叠氮基取代、酯水解、氨基脱叔丁氧羰基保护及 9 芴甲氧羰基再保护合成了关键氨基酸中间体 (4S) 1 芴甲氧羰基 4 叠氮基 L 脯氨酸 ,通过质谱 (MS)和氢谱 (1H NMR)确证其结构。结果该工艺反应条件温和、操作简便、收率高 ,总收率达 6 2 3%。

HPLC-ELSD法测定花丹安神合剂中N-甲基-反式-4-羟基-L-脯氨酸的含量

文章建立花丹安神合剂中N-甲基-反式-4-羟基-L-脯氨酸的含量测定方法。方法:应用高效液相色谱法测定,色谱柱为YMC-Pack Polyamine II色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm);流动相为75%乙腈;流速为1.0 mL/min;柱温为30℃;检测器为ELSD检测器(漂移管温度48℃,气体流量1.8 L/min,增益1)。结果:N-甲基-反式-4-羟基-L-脯氨酸在5~20μg范围内峰面积与浓度呈良好的线性;加样回收率为96.76%,RSD为1.53%。结论:该方法简便易行、准确、重复性好,可用于花丹安神合剂的含量测定及质量控制。

反式-4-羟基-L-脯氨酸发酵菌株的筛选

为选育出反式-4-羟基-L-脯氨酸发酵生产的优良菌株,以8株产反式-4-羟基-L-脯氨酸的大肠杆菌(Escherichia coli)为出发菌株,对其生长特性、发酵效率进行了比较分析,筛选出2株遗传稳定性好、生产效率高的菌株Hyp-Y1801、Hyp-Y1808,其发酵效价分别为50.4、47.5 g/L,对实现反式-4-羟基-L-脯氨酸的工业化生产具有重要意义。

N-(顺式-4-异丙基环己基-1-甲酰基)-D-苯丙氨酸和N-(反式-4-异丙基环己基-1-甲酰基)-L-苯丙氨酸的合成

目的合成N-(顺式-4-异丙基环己基-1-甲酰基)-D-苯丙氨酸和N-(反式-4-异丙基环己基-1-甲酰基)-L-苯丙氨酸。方法以(4-异丙基)环己基甲酸为原料,在二环己基碳二亚胺(DCC)作用下,与N-羟基琥珀酰亚胺反应得到(4-异丙基)环己基甲酸琥珀酰亚胺酯(3),柱色谱分离化合物3得到顺式和反式异构体。顺式体与D-苯丙氨酸甲酯发生酰化反应,碱水解后即得到N-(顺式-4-异丙基环己基-1-甲酰)-D-苯丙氨酸;而反式体与L-苯丙氨酸甲酯发生酰化反应,水解后得到N-(反式-4-异丙基环己基-1-甲酰)-L-苯丙氨酸。结果与讨论成功合成了目标化合物,反应总收率分别为39%和31%。

反式-4-羟基-L-脯氨酸作为手性选择剂在薄层色谱中的应用研究

制备了以反式-4-羟基-L-脯氨酸为手性选择剂的手性薄层硅胶板,研究了其对手性物质的分离能力,取得了一定的效果,并探讨了多方面因素(如展开剂pH、温度等)对分离效果的影响。

螺[1-溴-4-(1R,2S,5R)-l-孟氧基-5-氧杂-6-氧代双环[3.1.0]己烷-2,2'-(3'-α-膦酸二乙酯基-(S)-苯甲氧基-4'-l-(1R,2S,5R)-孟氧基丁内酯)]的晶体结构

报道了标题化合物合成和晶体结构。X-射线结构分析表明,该化合物的分子式为C39H58BrO10P,Mr = 797.74,晶体属于单斜晶系,空间群为P21,晶胞参数a = 12.858(3), b = 25.130(5), c = 14.125(3) ? = 105.15(3), V = 4405(2) ?, Z = 4, Dc = 1.203 g/cm3, ?= 1.019 mm-1, F(000) = 1688,R = 0.0726, wR = 0.1201,共收集到9691个独立衍射点,其中可观测点5638个(I≥2s(I))。每个分子中有6个环,13个手性中心,2个五员环呈信封式构象,并分别与三员环组合成[2.4]螺环和[3.1.0]桥环化合物,4个新生成的手性中心的绝对构型为C(6)(S), C(7)(S), C(3)(R), C(2)(R),新引入的磷酸酯官能团C(9)为S构型。

(S)-4-叔丁基二甲基硅氧基-L-脯氨酰胺的合成

以光学活性反式-4-羟基-L-脯氨酸为原料,用苯甲氧羰酰基保护氨基,叔丁基二甲基,硅基保护羟基,然后与1,2-二苯基-2-氨基乙醇反应得到(S)-4-叔丁基二甲基硅氧基-N-苯甲氧羰酰-L-脯氨酰胺3,催化氢解得到(S)-4-叔丁基二甲基硅氧基-L-脯氨酰胺4.

定点饱和突变提高L-脯氨酸-4-羟化酶的酶活

为了提高L-脯氨酸-4-羟化酶(P4H)合成反式-4-羟基-L-脯氨酸(4-Hyp)的能力,首先对实验室前期构建的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-28b-p4h的P4H进行三维结构模拟和"热点"氨基酸分析,选择了7个位于"疏水口袋"附近的氨基酸残基(Y205,K207I241,F137,T142,V53和R45)进行定点饱和突变,得到P4H酶活力明显提高的突变型酶F137R和Y205K。采用F137R和Y205K催化转化0.35g/L L-脯氨酸产物4(Hyp质量浓度分别为55.09mg/L和52.29mg/L),比野生型酶分别提高了58%和50%。经过分子对接比较发现,突变型P4H的活性中心没有发生显著变化,酶活的提高可能是由于突变作用使蛋白构型发生了轻微改变,增加了该酶与底物或辅底物的亲和力引起的。该结果为进一步利用P4H生物合成4-Hyp提供了重要的理论基础。

(S)-脱氢脯氨酸衍生物的合成

以反-4-羟基-L-脯氨酸为原料,经过羧基的酯化、氨基的酰化、羟基的磺酰化、碘取代和消除五步反应合成了两种手性(S)-脱氢脯氨酸衍生物5和6,与以往的合成方法不同,此方法避免使用毒性较大的试剂,减轻对环境的污染,操作方便,而且产率较高.

(2S,4R)-1-叔丁氧羰基-4-甲烷磺酰氧基吡咯烷-2-羧酸的合成研究

以反式-4-羟基-L-脯氨酸为原料,先经Boc保护,再与甲烷磺酰氯反应,2步合成了药物中间体(2S,4R)-1-叔丁氧羰基-4-甲烷磺酰氧基吡咯烷-2-羧酸,总收率为80.4%。考察了温度、溶剂等反应条件对收率的影响,产物结构经MS,1H-NMR确证。

反式-4-羟基-L-脯氨酸手性固定相的制备及性能评价

合成并表征了反式-4-羟基-L-脯氨酸硅胶键合手性配体交换色谱固定相,研究了其在高效液相色谱中的分离能力,取得了较为满意的效果—拆分了7种手性化合物、氯酚及二硝基苯两种位置异构体,并探讨了多方面因素(如流动相p H、柱温、流速等)对分离效果的影响,得到了更佳的色谱分离条件。

新型2-硫杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚-3-酮衍生物的合成

以反式-4-羟基-L-脯氨酸为原料,经氮烷基化、酯化、磺酰化、硫代乙酸钾反应构型转换、水解酯基、缩合和成盐反应合成了5个新型的(2S,4S)-5-烷基-2-硫杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚-3-酮衍生物,其结构经1H NMR和MS表征。

重组大肠杆菌多基因串联表达合成反式-4-羟基-L-脯氨酸

[目的]得到表达多个基因的重组大肠杆菌,以期实现葡萄糖为碳源生产反式-4-羟基-L-脯氨酸。[方法]以菌液为模板,PCR得到不同来源的proB、proA、proC、p4h基因,重叠PCR串联相邻基因,所得片段通过无缝组装与p ET-28a载体连接,并在大肠杆菌BL21中表达,筛选阳性表达菌株,电泳及测序验证,重组菌在30 ml MCG培养基摇瓶中发酵,分光光度法和HPLC检测产量。[结果]0.5 mmol/L IPTG诱导24 h,5组串联基因成功在大肠杆菌中表达,并以葡萄糖为碳源,获得产物反式-4-羟基-L-脯氨酸,培养基不添加L-脯氨酸时E.coli BL21/p ET-28a-BAHHbs、E.coli BL21/p ET-28a-HBACkp和E.coli BL21/p ET-28a-HBAmg产量达到0.28 g/L、0.16 g/L和0.29 g/L,添加4 mmol/L的L-脯氨酸时,分别为0.64 g/L、0.55 g/L和0.74 g/L。[结论]proB、proA、proC及p4h基因成功在大肠杆菌中表达,5株重组菌在30℃摇瓶中诱导表达24 h得到产物反式-4-羟基-L-脯氨酸,其中E.coli BL21/p ET-28a-HBAmg产量达到0.74 g/L,为今后在发酵罐中生产奠定基础。