毕赤酵母表达重组红林蚁AChE高密度发酵工艺研究

【目的】优化毕赤酵母高密度生产重组红林蚁乙酰胆碱酯酶(AChE)的发酵条件,为AChE在农药残留检测中应用提供酶源。【方法】采用毕赤酵母表达系统,选用高表达AChE的重组子X33/pPICZαAAChE,对毕赤酵母高密度生产重组红林蚁AChE的发酵条件进行优化,确定最佳发酵pH值、温度、溶解氧、补料流加速率等因素。【结果】毕赤酵母表达重组红林蚁AChE高密度发酵工艺的最佳参数:pH5.0、溶解氧30%、温度29℃、转速500 r/min、罐压0.06 MPa,甲醇诱导72~96 h时发酵液上清AChE活性增长最快。从发酵结果看,发酵结束菌体湿重可达280 mg/mL,发酵罐内甲醇诱导96 h酶活性最高,达6 000 U/mL,是摇瓶诱导表达的8倍。【结论】毕赤酵母表达系统最佳发酵工艺能实现红林蚁AChE的高密度发酵生产,降低AChE提取成本。

点击化学制备AChE/MAO-B双抑制剂及活性评价

通过点击化学(Click)设计、合成了22个香豆素衍生物。多数化合物在微摩尔范围内表现出良好的AChE和MAO-B双抑制活性,具有良好的生物相容性。尤其是一种名为A2B5的化合物,对AChE和MAO-B的IC_(50)分别为(0.23±0.02)、(0.31±0.03)μmol/L,是最佳的AChE/MAO-B双抑制剂。实验结果表明香豆素基团是一类有效的AChE和MAO-B双抑制活性基团,羟基取代苯环的存在能够增强抑制活性。分子对接研究发现A2B5是双位点抑制剂,苯基部分结合到AChE的CAS位点,香豆素结合到PAS位点,三氮唑环占据两个活性位点的中间峡谷。A2B5的香豆素部分结合到MAO-B的入口空腔,苯基部分结合到底物空腔,并嵌入到Tyr435、Tyr398和FAD形成的“芳香笼”。总之,香豆素C7位置取代衍生物可以被开发为AChE/MAO-B双抑制剂,为进一步开发抗阿尔茨海默病的双靶点药物提供一个新的起点。

香豆素衍生物AChE抑制剂的3D-QSAR研究

采用Topomer CoMFA方法研究了44种香豆素衍生物AChE抑制剂的三维定量构效关系D-QSAR模型。建立的Topmer CoMFA模型的交互验证相关系数q^(2)为0.606,拟合相关系r^(2)=0.996,标准估计误差SEE=0.046,Fisher检验值F=891.096,由此可见该模型是有效的。通过Topomer CoMFA模型三维等势图揭示了结构对活性的影响。并采用分子对接研究了配体和受体蛋白之间的结合。该模型为进一步探索黄酮类衍生物作为AChE抑制的构效关系,以及该类分子的结构设计奠定理论基础。

增液八珍汤对慢传输型便秘大鼠模型结肠肌5-HT、AchE、SP及VIP的影响

目的:观察增液八珍汤对慢传输型便秘大鼠结肠肌间神经丛中5-HT、AchE、VIP、SP的影响。方法:将72只SPF级大鼠随机分为空白对照组、模型组、麻仁软胶囊组、增液八珍汤低剂量组、增液八珍汤中剂量组和增液八珍汤高剂量组各12只。麻仁软胶囊组给予麻仁软胶囊内容物6.2 mL/(kg·d)灌胃,增液八珍汤低、中、高剂量组分别给予17、34、68 g/(kg·d)增液八珍汤灌胃,共给药14 d,空白对照组和模型组给等量的生理盐水。大鼠结肠组织给予HE染色及免疫组化染色,并对染色组化结果进行半定量积分分析。结果:与模型组比较,增液八珍汤各剂量组及麻仁软胶囊组结肠肌间神经丛神经元阳性表达和5-HT、AchE、VIP、SP定量分析显著增加(P<0.05);与麻仁软胶囊组比较,增液八珍汤各剂量组及麻仁软胶囊组结肠肌间神经丛神经元阳性表达和5-HT、AchE、VIP、SP定量分析显著增加(P<0.05),增液八珍汤中、高剂量组对结肠肌间神经丛5-HT、AchE、VIP、SP神经元增加的量均优于麻仁软胶囊组(P<0.05)。结论:增液八珍汤可通过增加便秘大鼠结肠中5-HT、AchE、VIP、SP表达神经细胞含量,刺激结肠收缩,增加结肠动力,加快结肠传导速度。

新型双配基AChEI美普色胺改善东莨菪碱致小鼠学习记忆功能障碍的研究

目的探究左旋美普他酚与5-羟色胺的杂合物美普色胺[(-)-Mep-S]对东莨菪碱诱发小鼠学习记忆功能障碍的改善作用。方法应用分子对接技术分析(-)-Mep-S与hAChE之间的结合;利用体内外实验观察(-)-Mep-S对AChE活性的影响;通过Morris水迷宫行为学实验分析小鼠学习记忆能力;应用旷场试验检测(-)-Mep-S对小鼠运动能力影响。结果分子对接分析显示,(-)-Mep-S与hAChE的催化位点和外周阴离子位点存在较强结合。(-)-Mep-S明显抑制小鼠前脑来源和人SH-SY5Y细胞来源的AChE活性,其IC50值均低于阳性对照药利斯的明。在水迷宫实验中,(-)-Mep-S(2.5 mg/kg)治疗的小鼠在第4天的上台潜伏期显著缩短(P<0.05),且在第5天的空间探索试验中,小鼠在靶象限的游泳距离百分比和时间百分比显著升高(P<0.05);而0.5 mg/kg剂量下(-)-Mep-S未能表现出明显作用;(-)-Mep-S能显著抑制东莨菪碱所致的小鼠前脑AChE活性增强(P<0.05)。另外,旷场试验提示(-)-Mep-S改善东莨菪碱所致小鼠学习记忆功能障碍的作用并不是由于运动能力的差异所造成的。结论(-)-Mep-S能有效抑制AChE活性,从而改善东莨菪碱诱发小鼠学习记忆功能障碍。

毒死蜱和三唑磷对斑马鱼头部AChE活性影响及在鱼体内的富集

采用半静态法，测定了在96h—Lc50的1／10、1／20、1／40及1／80作用剂量下慢性暴露，毒死蜱和三唑磷对斑马鱼头部乙酰胆碱酯酶（AChE）活性的抑制及两种农药在鱼体的富集作用，并研究解除30d后酶活性的恢复。结果表明，随暴露剂量增大、暴露时间延长，农药对AChE活性抑制越强。在96h—LC50的1／10作用剂量下连续暴露30d，毒死蜱和三唑磷处理组斑马鱼头部AChE活性分别为对照的42．25％和31．80％。毒死蜱不同剂量处理组酶活性在解除药剂后30d均可恢复到对照的90％以上，而三唑磷高剂量处理组（96h—LC50的1/10和1／20）分别只有对照的74．91％和71．46％。毒死蜱极容易在鱼体富集，慢性暴露30d富集系数达260．91～1320．03L·kg^-1，而三唑磷仅为8．23-26．84L·kg^-1。

ACh对人垂体腺瘤细胞内蛋白激酶C、胞内游离钙及cAMP/cGMP的影响

我们曾发现ACh可明显地抑制垂体腺瘤细胞的增殖代谢 ,为深入探讨ACh抑制垂体腺瘤细胞增殖作用的机制 ,观察了ACh作用后垂体腺瘤细胞内蛋白激酶C (PKC)、[Ca2 +]i及cAMP/cGMP的变化。结果发现 :( 1)与空白处理组相比 ,使用PKC的激动剂PMA处理培养的人垂体腺瘤细胞时可使胞浆、胞膜和细胞总PKC活性浓度均升高 ,但ACh ( 10 μmol/L)作用 15min后 ,胞浆、胞膜和细胞总PKC活性均下降 ,且此作用可被阿托品阻断 ;( 2 )ACh ( 10 μmol/L)作用于单个人垂体腺瘤细胞后 ,立即使垂体腺瘤细胞 [Ca2 +]i 相对水平降低 ,但此作用可被阿托品阻断 ;( 3 )ACh作用于人垂体腺瘤细胞 15min后 ,胞内cAMP水平均明显升高 ,而cGMP没有改变。该结果为探讨ACh抑制垂体腺瘤细胞增殖的分子机制提供了重要线索 ,同时提示 。

麦穗鱼脑乙酰胆碱酯酶(AChE)的纯化及其比较性研究

用 PEG2 0 0 0双水相萃取、DEAE- Sephadex A- 5 0和 Sephadex G- 2 0 0方法分离纯化麦穗鱼Pseudorasbora parva脑中的乙酰胆碱酯酶 (ACh E) ,然后比较分析纯酶液与粗酶液中鱼脑 ACh E的动力学特性和抗抑制性 ,以便更直接地了解底物与酶以及毒剂与酶的反应关系。研究结果表明 ,经过一系列步骤的纯化 ,最后所得的 ACh E是纯度较高的酶液 ;通过对 ACh E的动力学研究发现 ,纯化后的麦穗鱼脑 ACh E与底物之间的亲和力和其在粗酶状态时没有显著的差别 ,而且纯化后的鱼脑 ACh E对底物抑制作用更敏感 ;抗抑制性研究发现 ,纯化后的麦穗鱼脑 ACh E对经溴水氧化的马拉硫磷 (malathion)和三唑磷 (triazophos)的敏感性显著高于粗酶状态的 ACh E。

对有机磷农药敏感的海鱼脑AChE筛选研究

以10种海洋鱼类：鲅鱼、黄花鱼、鲈鱼、黄鱼、美国红鱼、真鲷、黑鲷、面包鱼、黑头鱼和鳗鲡为实验材料，采用半抑制浓度（IC50）和双分子速率常数（Ki）为指标，通过体外抑制作用比较了这10种海鱼脑AChE对马拉硫磷和甲基对硫磷的敏感性，并分析了海鱼脑AChE作为监测海水中有机磷农药指示酶的可行性，由此筛选出适于制备海水有机磷农药酶传感器的指示酶．实验表明：10种海鱼脑AChE的基础活性在4．62～35．65μmol／（min·g）之间，面包鱼的酶活性最高，黄花鱼的酶活性最低．对马拉硫磷，由IC50所得到的AChE敏感性为：鲅鱼、黄鱼、鲈鱼、真鲷〉黑鲷〉黑头鱼、鳗鲡〉美国红鱼、黄花鱼〉面包鱼；由Ki所得到的AChE敏感性为：鲅鱼〉黄鱼、鲈鱼、真鲷〉黑鲷、黑头鱼、鳗鲡〉美国红鱼、黄花鱼〉面包鱼．对甲基对硫磷，由IC50所得到的AChE敏感性为：鲅鱼〉鲈鱼〉黄鱼、黄花鱼、真鲷、黑鲷、黑头鱼、鳗鲡〉美国红鱼〉面包鱼；由Ki所得到的AChE敏感性为：鲅鱼〉鲈鱼、黄鱼、黄花鱼、黑鲷、黑头鱼、鳗鲡〉真鲷〉美国红鱼〉面包鱼．鲅鱼脑AChE对2种有机磷农药都较为敏感．影响鱼脑AChE对有机磷农药敏感性的主要因素为生物来源、农药种类和抑制方式，而与酶的基础活性无关．海鱼脑AChE活力抑制作用与水体中的有机磷农药具有良好的剂量-效应关系，在1～50mg／L浓度范围内，两者间呈现较好的线性相关性（r^2≥0．93）．根据AChE的敏感性及其对有机磷农药的线性响应程度，鲅鱼脑AChE适于作为监测马拉硫磷和甲基对硫磷酶传感器的指示酶．

镉对罗非鱼脑AChE及组织中代谢酶的影响

将尼罗罗非鱼分别在含0.5mg/LCd和5.0mg/LCd的水环境中染毒28d,对其脑乙酰胆碱脂酶(AChE)及鳃、肝脏和心脏中的乳酸脱氢酶(LDH)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)分别进行测定.结果表明,高浓度或长期的低浓度镉污染可抑制脑AChE的活性.高镉组中LDH在三个组织中都极显著下降,下降的程度依次为:肝脏>心脏>鳃,而在低镉组中LDH在后期显著升高;肝、心及鳃中ALT和AST在两组中匀显著下降,其中ALT下降程度依次为肝>心>鳃;AST依次为心>肝>鳃.可见,高浓度镉可引起鱼的神经机能紊乱和能量代谢障碍;使鱼的组织细胞受到不同程度的损害,其中对肝脏细胞的损害最为严重,其次是心脏和鳃.

载体预处理对蜂窝状V_2O_5/ACH低温脱硫脱硝活性的影响

经不同预处理条件制得的蜂窝状活性炭(ACH),等体积浸渍偏钒酸铵和草酸的混合溶液,经干燥、煅烧和预氧化后制得新型V2O5 ACH催化剂。实验结果表明,850℃下水蒸气活化可提高2%V2O5 ACH催化剂在200℃下的脱硫活性,但基本不改变脱硝活性;NH3再生后催化剂的脱硝活性显著提高,对SO2的吸附也有所增加。活化温度从850℃升至950℃,相应催化剂的脱硫脱硝活性略微降低;活化时水蒸气体积含量从28%增至80%,催化剂的脱硫脱硝活性也有不同程度的下降。在28%的水蒸气含量和850℃活化温度的最佳预处理条件下,经第二次再生后的2%V2O5 ACH催化剂的SO2转化率降为80%时的吸附硫容为4.9%,同时脱硝率达93%。

分子模拟和生物学效应结合研究盐酸小檗碱抗AchE与胆碱能抗炎机制相关性

目的:体外研究盐酸小檗碱抗乙酰胆碱酯酶(Ach E)活性、增加乙酰胆碱(Ach)神经递质作用与胆碱能抗炎机制的关联性,方法:利用生物信息模拟技术,模拟以盐酸小檗碱为代表的5种生物碱(配体)与Ach E(受体)相互分子对接效应与差异性;将小鼠禁食12 h后脱臼处死,开腹取出回肠制备组织匀浆,采用BCA法测定肠组织匀浆中总蛋白含量,将盐酸小檗碱与肠组织液置37℃共孵育后于30、60、90、120 min分别用酶法检测组织液中Ach E活性,另在组织液中预先加入已知量的Ach然后与盐酸小檗碱置37℃共孵育后于30、60、90、120 min分别用生物化学方法检测组织液中Ach含量,结果:分子模拟5种生物碱中只有盐酸小檗碱能与Ach E结合部位进行分子对接而抑制其活性;盐酸小檗碱对小鼠肠道Ach E活性有明显的抑制作用,在不同孵育时间内,盐酸小檗碱对Ach E的抑制效率也不一样,30、60、90、120 min抑制率分别为:(39.25±3.27)%、(70.10±4.18)%、(68.09±3.62)%、(74.57±4.25)%当Ach E被抑制的同时Ach的量也发生不同的变化,30、60、90、120 min其含量分别为:(226.49±80.75)、(86.79±46.52)、(118.44±67.72)、(89.05±64.87)μg/m L。即Ach E被抑制程度越大Ach的量增加越多,在60 min内酶受抑制率达到峰值,随后在平台期波动,Ach的量也随其而波动,结论:体外分子模拟和生物学效应研究均表明盐酸小檗碱对Ach E有明显的抑制作用,由于Ach E、Ach与炎症和胰岛素抵抗有密切联系,因此认为盐酸小檗碱治疗诸多疾病(包括改善胰岛素抵抗、降低血糖、防治阿尔茨海默氏病)可能与其抗胆碱脂酶活性、激活胆碱能抗炎通路有关。

毒死蜱对舞毒蛾食物利用和解毒酶及AChE活性的影响

采用质量法和酶活性测定法研究了毒死蜱对舞毒蛾(Lymantria dispar)3龄幼虫食物利用的影响,并测定了其毒力及解毒酶、乙酰胆碱酯酶(AChE)的活性。用亚致死浓度(1.5 mg.L-1)毒死蜱处理小黑杨叶片,饲喂舞毒蛾3龄幼虫,其幼虫生长率(RGR)、食物利用率(ECI)和食物转化率(ECD)均显著低于对照,而近似消化率(AD)显著高于对照,相对取食量(RCR)处理和对照间差异不显著。毒死蜱对舞毒蛾幼虫24 h致死中浓度(LC50)为5.86 mg.L-1,其毒力低于三氟氯氰菊酯而高于氧化乐果。毒死蜱对舞毒蛾3龄幼虫体内羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)和AChE均有抑制作用,抑制程度为CarE>AChE>GSTs。毒死蜱通过影响舞毒蛾食物利用和抑制酶活性而表现出杀虫活性,为一种有效防治舞毒蛾的有机磷杀虫剂。

通络救脑口服液对AD大鼠学习记忆能力及AChE表达的影响

目的:观察通络救脑口服液对β-淀粉样蛋白1-40诱导的AD大鼠学习记忆能力及乙酰胆碱酯酶(AChE)表达的影响。方法:140只SD大鼠随机分为空白对照组(正常组)、假手术对照组、阴性对照组(模型组)、阳性对照组(盐酸多奈哌齐组)、实验组(48、24、12mg.kg-1.d-1)共7组。采用大脑海马立体定向注射凝聚态β-淀粉样蛋白1-40诱导老年性痴呆(AD)动物模型。药物干预4周后,采用Morris水迷宫测试大鼠寻找平台所需时间和通过原平台次数。采用免疫组织化学染色和计算机图像分析技术测定海马区AChE蛋白阳性目标积分光密度。结果:Morris水迷宫实验:模型组大鼠在定位航行试验中隐匿平台平均逃避潜伏期较正常组显著延长,空间探索试验中跨越原平台位置次数明显减少(P<0.01),通络救脑口服液各剂量组平均逃避潜伏期较模型组显著缩短(P<0.05),跨越原平台位置次数明显增加(P<0.01)。免疫组化实验:模型组和正常组大鼠海马区AChE蛋白阳性目标积分光密度比较无显著性差异(P>0.05),但与通络救脑各剂量组比较差异显著(P<0.01)。结论:通络救脑口服液对Alzheimer病模型大鼠的学习记忆功能减退具有改善作用,可能与抑制海马神经元AChE表达,进而减少乙酰胆碱(ACh)的分解有关。

海鱼AChE监测海水有机磷农药的可行性研究

有机磷农药 (OPs)对乙酰胆碱酯酶 (AChEEC 3.1 .1 .7)具有专一性抑制作用 ,因此AChE常作为淡水和土壤OPs污染的特异性标识物 (biomarker)。本文在海水背景下 ,通过测定两种有机磷农药 (马拉硫磷和甲基对硫磷 )对海洋鱼类—鲈鱼 [Lateolabraxjaponicus(cuvier) ]脑组织AChE的抑制效应 ,分析了海鱼AChE监测海水OPs的可行性。结果显示 ,抑制时间为 2 0min时 ,抑制程度达到相对稳定 ;在低浓度OPs抑制下 ,纯酶液比粗酶液表现出更好的敏感性 ,对马拉硫磷和甲基对硫磷的灵敏度分别达到 0 .2 8μg·L 1和 0 .2 μg·L 1;在一定浓度范围内 ,AChE活力对OPs具有显著的线性响应。研究表明 ,利用鲈鱼AChE指示和监测海水OPs的微污染是完全可行的。

黄鱼(Hexagrammosotakii)脑组织AChE的亲和层析

采用亲和层析法对黄鱼脑组织的乙酰胆碱酯酶进行分离纯化。纯化酶最大比活力为6 3.1 36 U /mg蛋白 ,最适 p H为 8,最适反应温度为 35℃。此酶经过 SDS- PAGE呈一条带 ,表明其纯度达电泳纯。对纯化酶进行底物特异性、过量底物抑制效应和抑制剂选择性检验 ,结果证实该酶为乙酰胆碱酯酶。

淡水鱼脑AChE的动力学特性及抗抑制性

用PEG2000双水相萃取、DEAE-Sephadex A-50和SephadexG-200方法分离提纯麦穗鱼(Pseudorasbora parva)、金鱼(Carassius auratus)和虹鳟鱼(Salmo gairdneri)脑乙酰胆碱酯酶(AChE),比较这3种淡水鱼脑AChE纯酶液与粗酶液的动力学特性、抗抑制性及其种类之间的差异.结果表明,这3种鱼脑AChE的性质在种类间的差异要远远小于其在粗酶状态时酶活性的差异,由此得出AChE性质在种类间的差异并非影响这3种淡水鱼脑AChE活性差异的主要因素;由AChE抗抑制试验结果可知,这3种鱼脑AChE粗酶液对经溴水氧化后的马拉硫磷和三唑硫磷的敏感性及种间的差异都远大于纯酶液.

溴氰菊酯对草鱼鱼种脑AchE及ATP酶活性的影响

本试验研究了溴氰菊酯对草鱼鱼种的急性毒性效应以及溴氰菊酯对草鱼鱼种脑ＡｃｈＥ及ＡＴＰ酶活性的影响。结果表明，溴氰菊酯对规格Ⅰ（平均体重８．２１ｇ）、规格Ⅱ（平均体重６６．６ｇ）草鱼鱼种９６ｈ半数致死浓度（９６ｈＬＣ５０）分别为２．１６μｇ／Ｌ、４．２６μｇ／Ｌ，９５％置信区间分别为１．９３～２．４２μｇ／Ｌ、３．８２～４．７５μｇ／Ｌ，离体条件下对草鱼种脑Ｍｇ２＋－ＡＴＰ酶活性抑制显著，呈一定的浓度－效应关系，回归方程ｙ＝５．８９＋０．３２ｘ（ｒ＝０．９２）；对离体、活体脑ＡｃｈＥ、离体脑Ｎａ＋Ｋ＋－ＡＴＰ酶活性无显著影响。

石杉碱甲-AChE复合物中石杉碱甲的结构特征——量子化学研究

在运用量子化学从头计算方法(HF/4-31G)结合点电荷模型方法对AChE-HuPA复合物活性位点的410个原子和1929个点电荷进行理论计算的基础上,比较了石杉碱甲分子在形成复合物前后的结构变化特征.发现复合物中石杉碱甲分子构象并非能量最低构象,它的能量比HF/4-31G全优化得到的构象的能量高91.8kJ/mol.和单分子状态相比,形成复合物后季铵基和内酰胺基的N—H,C(?)O键的键长变长、键强减弱,其总原子净电荷也发生了明显的变化.且这些基团的空间取向都有不同程度的改变,C(8)—N(21)键的旋转达20°.这些信息将有益于设计新的AChE抑制剂.