广西H9N2亚型禽流感病毒疫苗候选株的筛选

【目的】筛选出免疫原性更优的H9N2亚型禽流感病毒(AIV)疫苗候选株用于新型疫苗研发,为加强对H9N2亚型AIV的防控提供技术支持。【方法】以2000—2020年广西地区分离获得的36株H9N2亚型AIV分离株为试验材料,依据HA基因遗传进化分析选择12株不同年份、不同地域及不同宿主来源的H9N2亚型AIV代表株,与目前使用的商品化H9亚型AIV疫苗株(SS株)进行交叉血凝抑制试验(HI)及抗原性分析,根据抗原分析结果选择其中具有不同抗原差异的代表株制备油乳剂灭活疫苗,并分别与商品化H9亚型AIV疫苗(SS株)进行交叉免疫保护试验。【结果】在36株H9N2亚型AIV广西分离株中有31株属于Y280-Like(9.4.1),其中26株属于分支I、5株属于分支II,另外5株属于G1-Like(h9.4.1),与我国常用疫苗株分属于不同进化分支。12株H9N2亚型AIV广西代表性分离株灭活后的HA效价≥7 log2,病毒灭活效果良好,可用于制备油乳剂灭活疫苗,且制备的油乳剂灭活疫苗稳定性和安全性良好。根据交互HI抗体滴度计算出各毒株间的抗原相关值(R),结果发现A/chicken/Guangxi/C227/2015(H9N2)株(简称C227株)与其他毒株的抗原性无明显差异,对应的R在0.72~0.93间波动;疫苗交叉保护试验结果也表明,C227株制备的油乳剂灭活疫苗对不同毒株的免疫保护率均高于80%,且免疫保护效果优于A/chicken/Guangxi/CX/2013(H9N2)株(简称CX13株),说明C227株更适合作为H9N2亚型AIV灭活疫苗的候选株。【结论】基于抗原性分析和免疫原性测定筛选出的A/chicken/Guangxi/C227/2015(H9N2)株对广西地区绝大部分H9N2亚型AIV流行株的免疫保护效果良好,可作为疫苗候选株用于研制新型H9N2亚型AIV疫苗。

影响H9N2亚型禽流感病毒生物学特性的关键氨基酸位点分析

H9N2亚型禽流感病毒是在我国家禽中流行最为广泛的亚型,严重影响养禽业健康发展,具有感染哺乳动物的能力。可感染人类的H5N1、H7N9、H10N8和H3N8等新型流感病毒中多次发现H9N2亚型禽流感病毒的内部基因,而这些感染人类的新型流感病毒对公共卫生安全造成了巨大威胁。文章围绕H9N2亚型禽流感病毒,总结了影响该亚型病毒致病性、受体结合、复制能力以及在家禽或哺乳动物中与传播有关的关键功能氨基酸位点突变的研究进展,以期进一步解析H9N2亚型禽流感病毒及其内部基因在新型流感病毒产生过程中的机制和作用。

间接ELISA、HI及AGP检测鸡血清中抗AIV抗体的敏感性比较

用鸭源Ａ型流感病毒Ｈ９Ｎ？滴鼻、点眼辅以腹腔注射，人工感染３周龄ＳＰＦ来航鸡，分别用ＡＧＰ、ＨＩ试验及间接ＥＬＩＳＡ定期测定其抗ＡＩＶ血清效价。结果，ＨＩ试验及间接ＥＬＩＳＡ于攻毒后第７～７９天显示阳性；ＡＧＰ试验从第１３～７９天呈阳性。根据首次检出血清中抗ＡＩＶ抗体的时间，间接ＥＬＩＳＡ比ＡＧＰ、ＨＩ更灵敏、快速。

ChIL-2对H_5亚型AIV疫苗免疫增强作用研究

鸡白细胞介素2真核表达质粒pCI-IL-2及原核表达重组鸡白细胞介素2(rChIL-2)分别与H5亚型禽流感油乳剂灭活苗联合使用,25日龄首免,40日龄时加强免疫.MTT法检测各组鸡外周血淋巴T细胞增殖,HI试验监测H5亚型禽流感抗体水平的消长规律,结果表明:pCI-IL-2及rChIL-2均能显著增强AIV疫苗的免疫效果(P<0.05),pCI-IL-2和rChIL-2两组间差异不显著(P>0.05);证实鸡白细胞介素2对H5亚型禽流感疫苗有免疫增强作用.rChIL-2协同免疫组MTT及HI试验均在第四周达到峰值,pCI-IL-2协同免役组峰值出现时间稍晚,但随后质粒免疫组可维持在更高的水平值.提示IL-2蛋白的作用更迅速,IL-2质粒作用更持久.

转化型桔梗皂甙抗IBDV、AIV和NDV的研究

为探索中药桔梗的主要活性成分桔梗总皂甙及其转化型桔梗皂甙的生物学活性和抗IBDV、A IV(H9)、NDV的作用,采用M TT法和间接免疫荧光检测试验,分别研究桔梗总皂甙与转化型桔梗皂甙的细胞毒性、对CEF生长和活性的影响以及抗病毒活性。结果表明:桔梗总皂甙和转化型桔梗皂甙对细胞毒性作用的IC50分别为128.74和53.48μg.mL-1,对CEF细胞生长和活性具有最大促进作用的浓度分别为80和25μg.mL-1。桔梗总皂甙阻断IBDV、A IV(H9)、NDV感染CEF细胞的作用分别为66.3%、55.4%和36.9%,抑制三者增殖的作用分别为69.4%、60.8%和26.2%;转化型桔梗皂甙阻断三者感染CEF细胞的作用分别为84.7%、63.5%和45.5%,抑制三者增殖的作用分别为77.8%、63.5%和41.9%,表明桔梗总皂甙经化学处理转变成转化型桔梗皂甙,可明显提高其生物学活性和抗病毒用。

MDCK单细胞悬浮生长的驯化筛选及其在AIV增殖上的初步应用

采用逐步降低培养基中血清含量的方法获得可悬浮生长的MDCK-Sus细胞株,对其生长代谢情况、细胞膜表面病毒受体丰度,以及在生物反应器中悬浮培养该细胞对禽流感H9亚型病毒增殖进行了初步应用研究。结果表明,MDCK-Sus细胞株可完全适应无血清营养条件并呈单细胞悬浮生长状态,细胞生长旺盛,平均比生长速率达到0.556 d-1,最大活细胞密度达到2.42×106cells·m L-1,并可检测出其细胞膜表面具有正常丰度的唾液酸-α-2,3-半乳糖糖链受体。在MOI为0.05,TPCK处理的胰蛋白酶作用浓度为1μg·m L-1的条件下,AIV-H9亚型病毒JS03株可在MDCK-Sus细胞中获得较好的增殖HA效价,达到8log2·25μL-1。

靶向PB2基因的特异性siRNA抑制禽流感病毒(AIV)复制

根据siRNA设计原则,设计并合成5对靶向禽流感病毒(AIV)PB2基因的siRNA(PB2374,PB2665,PB2936,PB21031和PB21233),将其转染MDCK细胞,分别于转染前和转染后感染H5N1禽流感病毒A/Goose/Guang dong1/96株;在转染后24h、48h和72h分别收集上清液;通过血凝试验(HA)和Real-time PCR检测siRNA抑制AIV增殖的效果。血凝试验结果表明:所设计的5对siRNA中,PB2374抑制AIV增殖的效率为68%～71%,PB2963抑制AIV增殖效率为78%～81%;Real-time PCR检测到PB2374转染组PB2基因的转录水平与对照组比较降低3～3.3倍,PB2963转染组PB2基因的转录水平降低3.9～4.2倍。无论siRNA是先于还是迟于AIV感染,这两对siRNA都能明显地抑制AIV的增殖;本研究结果为开发抗AIV治疗制剂和动物机体抗AIV研究奠定了基础。

鸡白细胞介素2真核表达质粒的构建、表达及对AIV疫苗免疫增强作用研究

将鸡白细胞介素2(ChIL-2)基因亚克隆入pCI载体中,pEGFP-N1载体中的EGFP基因酶切后连入质粒pCI-ChIL-2中,构建真核表达质粒pCI-ChIL-2-EGFP,该载体表达ChIL-2-EGFP融合蛋白。重组质粒在脂质体作用下转染Vero细胞、鸡胚成纤维细胞(CEF)和外周血淋巴细胞(PBLC),荧光显微镜观察到融合蛋白在体外能稳定表达。HI试验显示,pCI-ChIL-2-EGFP与AIV疫苗共注射可明显提高AIV疫苗的免疫原性。

AIV感染雏鸡免疫器官淋巴细胞增殖功能变化

应用细胞培养技术及MTT法,对感染鹅源H5N1型AIV雏鸡胸腺和脾脏T细胞,法氏囊和脾脏B细胞增殖功能进行检测,结果发现,AIV感染雏鸡免疫器官T、B细胞增殖功能在感染初期比对照雏鸡明显降低,后期有所恢复,表明感染AIV后,雏鸡全身免疫功能受抑制。7日龄和21日龄AIV感染雏鸡均发病,但21日龄感染雏鸡免疫器官T、B细胞增殖功能下降时间比7日龄感染雏鸡短,而且相对滞后,死亡率也较低,表明21日龄雏鸡对AIV感染具有一定的抵抗力。

多重PCR同时检测鸡AIV、NDV、IBV、ILTV和MG方法的建立和临床应用

通过建立针对鸡AIV、NDV、IBV、ILTV和MG的多重PCR鉴别诊断技术,并进行了特异性、敏感性试验和临床应用。结果表明:设计的5对引物对同一样品中的RNA(AIV、NDV、IBV)和DNA(ILTV、MG)进行多重PCR扩增,均同时得到5条片段大小与设计相符的特异性片段,即268bp(AIV)、321bp(NDV)、457bp(IBV)、662bp(ILTV)和732bp(MG)。说明该多重PCR技术具有较强特异性和较高敏感性,能检测出1pg AIV、1pg NDV、10pg IBV的RNA和1pg ILTV、10pgMG的DNA。对自然感染鸡临床样品检测的结果则证明,该技术在临床诊断方面具有广阔的应用前景。

一例肉鸡传染性支气管炎与H9亚型禽流感混合感染的病例分析

2023年山东某鸡场部分肉鸡发生不同程度的呼吸困难,并伴有零星死亡,死鸡剖检可见气管出血、支气管栓塞、部分鸡有尿酸盐沉积。为探究其发病原因,采集病料进行了常见呼吸道病原的PCR检测。结果显示,此鸡场呼吸道传染病是由禽传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis virus,IBV)与H9亚型禽流感病毒(Avian Influenza virus,AIV)混合感染引起。病料经分离纯化后分别获得一株IBV分离株(SDDZ/202301简称DZ01)和一株H9亚型AIV分离株(SDDZ/202302简称DZ02)。分别对DZ01的S1基因和DZ02的HA基因扩增,测序结果发现,DZ01与参考株核苷酸和氨基酸同源性分别为60.2%~96.7%和50.3%~95.6%,确定为GI-19基因型,与同型参考株相比有13个氨基酸发生点突变,裂解位点为HRRRR,并发现15个N-糖基化位点。AIV H9同源性分析显示DZ02与参考株核苷酸和氨基酸同源性为78.1%~95.1%和79.4%~94.2%,为H9.4.2.5分支,属于山东省内优势毒株。本研究明确了该养殖场中出现了IBV和H9亚型AIV的混合感染,这表明该养殖场仍需加强生物安全管理等方面的工作。

NDV La Sota株与H_9N_2亚型AIV血凝谱的比较研究

为进一步研究NDV与AIV的生物学特性,为二者的鉴别诊断提供科学的依据,应用微量血凝(HA)试验比较观察NDV(La Sota)与AIV(H9N2)对鸡等17种动物红细胞的血凝谱。结果显示:NDV(La Sota)与AIV(H9N2)均可凝集鸡、鸭、鸽、鹌鹑、麻雀、喜鹊、赤颈鸫、三趾鹬、鹰鸮、长耳鸮、羊、小白鼠和人(O型)的红细胞,均不凝集兔的红细胞,但对牛、犬、猪红细胞的血凝特性有明显的差异。NDV(La Sota)可凝集这3种动物的红细胞且凝集效价均较高,而AIV(H9N2)对其则不具有凝集作用。表明NDV(La Sota)与AIV(H9N2)对不同动物红细胞血凝谱具有一定的差异性,特别是对不同哺乳动物红细胞的血凝性差异明显。

10株不同年代H9N2 AIV NA基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR技术克隆了10株涵盖不同分离年代和不同毒力的H9N2亚型AIV的NA基因,序列分析表明,10株AIV的NA基因的核苷酸和推导的氨基酸同源性高,进化稳定。系统进化树分析表明,其NA基因都属欧亚大陆禽分支,H9N2流感病毒的分布与地域有相关性。其NA蛋白氨基酸序列潜在的糖基化位点以及氨基酸红细胞吸附位点出现的变化尚不能解释这些毒株生物学特性上的差别。但这些研究结果从理论上丰富了H9N2亚型禽流感的分子流行病学,也为进一步研究该类毒株的进化提供了依据。

共表达H5N1、H7N1亚型AIV HA与鸡IL-18多价重组鸡痘病毒免疫保护性研究

用本实验室构建的重组鸡痘病毒rFPV-H5HA-IL18、rFPV-H5HA-H7HA-IL18和rFPV-H5HA,经翼蹼免 疫1日龄SPF鸡和7日龄商品Leghorn蛋鸡,同时以H5亚型AIV全病毒灭活疫苗作为对照。免疫后测定HI抗 体效价、淋巴细胞转化指标、重组疫苗对增重的影响、免疫后的攻毒保护效力、免疫后的抑制排毒情况。免疫后不 同时间分别测定特异性抗体和淋巴细胞刺激指数。试验结果表明,3株重组鸡痘病毒株均能诱导鸡体产生血凝抑 制抗体(HI);共表达鸡IL-18的rFPV-H5HA-IL18和rFPV-H5HA-H7HA-IL18诱导商品蛋鸡的细胞免疫水 平明显高于非共表达鸡IL-18的rFPV-H5HA。重组鸡痘疫苗免疫SPF和商品蛋鸡后第21d进行攻毒实验,rFPV- H5HA-IL18和rFPV-H5HA-H7HA-IL18免疫攻毒保护率达10／10,rFPV-H5HA免疫攻毒保护率达9／10,与常 规疫苗相当。免疫的商品蛋鸡于攻毒后7d采集泄殖腔棉试子样品,检测排毒情况。结果表明,rFPV-H5HA- IL18、rFPV-H5HA-H7HA-IL18免疫组在攻毒后第7d无排毒,其抑制免疫鸡排毒效果优于常规疫苗和单独表达 HA的rFPV-H5HA重组鸡痘病毒。rFPV-H5HA-IL18和rFPV-H5HA-H7HA-IL18免疫组鸡,在14日龄时的体 重明显高于rFPV-H5HA免疫组和常规疫苗对照免疫组,表明共表达的鸡IL-18能降低鸡痘病毒载体对雏鸡增重 的影响。

3株表达H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒的免疫效力比较

作者旨在探讨鸡痘病毒ORF073或ORF214基因缺失后,在母源抗体存在情况下对重组病毒免疫效力的影响。将构建好的在ORF073或ORF214基因插入H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒(rFPVLP-△73LRH5A、rFPVLP-△214LRH5A)及单表达H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒(rFPVLP-12LSH5A)分别免疫SPF鸡和商品鸡,检测重组疫苗诱导的免疫效力。结果:3种重组鸡痘病毒在SPF鸡产生较高的HI抗体效价及100%的免疫保护;在HI母源抗体效价为2.45的商品鸡体内基因缺失株重组病毒比rFPVLP-12LSH5A易于清除,抗体上升缓慢而且免疫28 d后HI抗体效价较低,免疫保护率低,分别为16.7%和23.3%;在母源HI抗体效价为0的商品鸡体内基因缺失株重组病毒免疫后产生的抗体效价高,免疫28 d后分别达到3.50和3.17。结果表明在商品鸡体内母源抗体影响下,缺失ORF073或ORF214基因的重组鸡痘病毒的免疫效力降低。

中国人载脂蛋白AIV基因多态性分布及其与缺血性脑血管病的关系

目的 了解载脂蛋白AIV(ApoAIV)基因 347Thr/Ser和 360Gln/His多态性在中国人群中的分布 ,并探讨它们与缺血性脑血管病的关系。方法 应用病例对照研究 ,在 1 2 4 9例缺血性脑血管病和 1 2 4 9例非脑血管病人群中采用PCR和分子杂交技术检测基因型 ,将病例组和对照组各基因型和等位基因频率进行 χ2 检验。结果 中国人ApoAIV347Ser和His360等位基因频率明显低于白种人 ,347Thr/Ser和 360Gln/His多态性基因型及等位基因频率在缺血性脑血管病组和对照组中无明显区别。结论 ApoAIV基因 347Thr/Ser和 360Gln/His多态性与中国人缺血性脑血管病的关系不明显 ,可能与中国人

中国鸭源H5N6 AIV血凝素和神经氨酸酶基因特征及遗传进化分析

为明确中国鸭源H5N6 AIV的HA和NA基因特征及其遗传变异情况,研究选取了NCBI流感病毒资源库里的32株具有完整ORF编码区的中国鸭源H5N6 AIV的HA和NA基因序列,利用分子生物学软件分析其HA和NA基因特征及其遗传进化情况。结果显示,中国鸭源H5N6 AIV的HA裂解位点有REKRRKR↓G、RERRRKR↓G和KEKRRKR↓G三种类型,HA有6个潜在的N-糖基化位点,其中第182、222、224位氨基酸依次为N、Q、G,具有与禽源唾液酸α-2,3受体结合的特性,然而HA发生了S123P/T、T156A、S223R氨基酸位点突变,部分毒株发生了I151T氨基酸位点突变;HA基因核苷酸遗传进化分析显示,中国鸭源H5N6 AIV遗传进化上均处于clade2.3.4.4分支,并进一步进化出Ⅰ和Ⅱ两个亚分支。部分中国鸭源H5N6 AIV NA第59~69位缺失11个氨基酸,中国鸭源H5N6 AIV NA基因遗传进化上分为两个大的分支,分别对应NA基因颈部缺失型和完整型两种类型;NA颈部完整型的NA有6个潜在的N-糖基化位点,NA颈部缺失型的NA由于第59~69位氨基酸的缺失,导致其第67位丢失了一个N-糖基化位点。研究为中国鸭源H5N6 AIV的生物学特性和遗传进化特征研究奠定基础。

H_9N_2亚型AIV HA基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

根据GenBank公开发表的禽流感病毒(AvianInfluenzaVirus,AIV)H9N2亚型血凝素基因(HA)序列设计引物,用PCR方法从重组质粒pUCHA中扩增H9N2亚型禽流感病毒去除信号肽的血凝素基因,将该片段定向插入到原核表达载体pET32a(+)中,构建原核表达载体pETHA。阳性质粒转化宿主菌BL21(DE3),经IPTG诱导,HA基因获得表达,经定位分析,目的蛋白以包涵体的形式存在于大肠杆菌中。通过改变IPTG的浓度和诱导时间,确定了表达HA基因的最佳诱导条件:IPTG终浓度为0.7mmol/L,诱导时间为3h。Westernblot分析表明,重组蛋白能与H9N2亚型AIV阳性血清发生特异性反应。以纯化后表达产物作为诊断抗原包被酶标板建立了检测H9亚型AIV抗体的间接ELISA方法。结果表明,抗原的最佳包被浓度为25μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶80,阳性标准初步定为:OD待检血清>0.5且OD标准阳性血清>1.0;OD标准阴性血清<0.1。

共表达H5、H7亚型AIV HA基因与鸡IL-18基因的重组鸡痘病毒构建

以鸡痘病毒（FPV）疫苗株为载体,将H5和H7亚型禽流感病毒血凝素（AIV HA）基因串联后（拥有同一个阅读框）和鸡白细胞介素-18（IL-18）基因分别插入到鸡痘病毒表达载体pUTA-16-LacZ复合启动子（ATI-P7.5×20）和单一启动子1（P7.5）下游,构建了携带AIV HA基因和鸡白细胞介素-18基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL-H5-H7-IL18;用相同的方法构建重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL-H5-IL18;将H5亚型AIV HA基因插入到鸡痘病毒表达载体pUTA2复合启动子（ATI-P7.5×20）下游,构建了携带H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTA2-H5.应用脂质体转染法,将重组鸡痘病毒转移载体质粒与282E4株鸡痘病毒共转染鸡胚成纤维细胞（CEF）,经BrdU进行三次加压蚀斑筛选后,以不同代次的细胞mRNA为模板,利用H5亚型AIV HA基因、H7亚型AIV HA基因和鸡IL-18基因特异引物进行RT-PCR和蛋白印迹检测,筛选出H5HA-H7HA融合蛋白基因和鸡IL-18基因共表达的重组鸡痘病毒rFPV-H5HA-H7HA-IL18,H5亚型AIV HA基因和鸡IL-18基因共表达的重组鸡痘病毒rFPV-H5HA-IL18以及单独表达H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒rFPV-H5HA.这些重组鸡痘病毒的构建为AIV活载体疫苗的研制奠定了基础.

一种抗AIV共有独特型抗体具有AIV血凝素分子的内影象

用纯化的鸡抗禽流感病毒(AIV) IgG 作免疫原,通过单克隆抗体技术制备出 1 株分泌针对鸡抗 AIV 和兔抗 AIV 共有独特型抗体的杂交瘤细胞。竞争抑制试验、特异性检验和诱导产生血凝抑制抗体的功能实验证明,此抗体具有 AIV 血凝素分子的内影象。