乌苏里蝮蛇丝氨酸蛋白酶基因克隆和序列分析

目的:构建乌苏里蝮蛇(Gloydius ussuriensis)毒腺c DNA文库,克隆、分析丝氨酸蛋白酶基因,为进一步基因研究和操作奠定基础。方法:采用链转化法和长距离PCR技术,构建乌苏里蝮蛇毒腺c DNA文库。用TRIzol试剂盒从乌苏里蝮蛇毒腺提取总RNA,再用Oligo(d T) -生物素-链菌素-磁珠法从总RNA中分离m RNA ,反转录合成c DNA第一链,长距离PCR合成第二链c DNA。回收c DNA,用限制性内切酶消化产生粘性末端,层析去除小于5 0 0 bp片段,纯化的c DNA插入载体p Bluescript- sk,电转化E.coli DH 5α,得到乌苏里蝮蛇毒腺c DNA文库,测定丝氨酸蛋白酶上游氨基酸序列,并推导其基因序列,合成引物。从该c DNA文库克隆丝氨酸蛋白酶基因,并进行序列测定和分析。结果:该文库库容为2 .3×10 6 ,该c DNA文库为筛选新的目的基因和进一步基因操作提供了有效平台。序列测定和分析显示丝氨酸蛋白酶基因开框读码序列全长70 2个核苷酸,编码2 34个氨基酸,活性中心His4 1 、Asp86 、Ser1 80 和6对二硫键进化上高度保守。结论:该文库库容大于通用的10 5标准,符合规定可作为进一步基因操作平台,克隆的丝氨酸蛋白酶基因与Gene Bank中其他蛇毒丝氨酸蛋白酶氨基酸序列同源性在85 %以上。

蛇毒、尿激酶对大白兔Masuji肾炎抗凝纤溶治疗的研究

对大白兔的Masuji肾炎分别用蛇毒及尿激酶治疗。实验证明,蛇毒及尿激酶均有防止并溶解在肾小球内沉积的纤维素,消除新月体,防止肾小球硬化的作用。实验过程中发现随着新月体的消除,纤维蛋白(原)相关抗原(FRA)沉积减少,尿蛋白随之下降,尿素氮及肌酐也恢复到正常水平。但是沉积在肾小球内的IgG,实验组与对照组之间差别无统计学意义。

去纤剂治疗急性缺血性脑卒中的疗效:全世界随机对照试验的系统评价

目的 对去纤剂(蛇毒酶)治疗急性缺血性卒中的疗效和安全性进行客观公正的评价。方法 应用国际Cochane协作网的系统评价方法对全世界关于去纤制剂治疗急性缺血性卒中的随机对照试验(RCT)进行了系统评价。结果 至1998年底,国内外共有8个已完成的RCT,仅3个(共包括182例病人)有关Ancrod的RCT符合本研究的纳入标准。Ancrod与早期病死率的显著降低有关[5.6％ v 16％;机会比(OR)0.33;95％可信区间(CI)0.13～0.85;2P=0.02] ,提示用Ancrod每治疗100例病人可避免约10例早期死亡。Ancrod组和对照组均无严重颅内外出血的病例发生。远期病死率或残废率在Ancrod组有降低的趋势但无统计学意义。至2000年底,另2个RCT发表了结果,一个RCT待发表。结论 根据目前资料3小时内使用Ancrod显示有益。但对去纤剂尚不能作出最后结论,近期更新的Cochrane系统评价将提供更为详细的研究进展资料。

结缔组织病患者用蝮蛇清栓酶前后血液流变学及前列腺素的变化

用蝮蛇清栓酶治疗结缔组织病患者100例,并于治疗前后检测患者的血液流变学,血栓弹力图,血纤维蛋白原,TXB_2和6-k-PGF_1α。结果表明蝮蛇清栓酶治疗前结缔组织病患者均有血粘滞度增高,治疗后明显改善。临床疗效观察表明蝮蛇清栓酶对干燥综合征和硬皮病有一定的疗效,而对皮肌炎无效。

蛇毒类凝血酶安克洛在毕赤酵母中的表达

目的:利用毕赤酵母表达具有生物学活性的蛇毒类凝血酶安克洛。方法:根据已知的天然安克洛的氨基酸序列,结合酵母偏好密码子,设计并合成了安克洛基因序列,将其克隆至表达载体pPIC9中,得到表达质粒pPIC9/Ancrod,电转至毕赤酵母GS115(His-)菌株感受态中,通过表达筛选获得工程菌株。采用5L发酵罐对工程菌进行发酵,表达安克洛。在诱导表达阶段,补加甲醇-山梨醇混合碳源。经疏水柱、肝素亲和柱和阳离子柱三步分离纯化得到重组安克洛,并鉴定其体外生物学活性。结果:重组安克洛表观相对分子质量为43000～48000,其糖基化不均匀,去糖基后蛋白肽链的相对分子质量约29000。重组安克洛被证明具有降解并凝固牛纤维蛋白原的活性,其比活力与天然安克洛相近。结论:采用毕赤酵母表达系统表达并获得有生物学活性的重组安克洛,为大规模生产打下了基础。

精氨酸酯酶的分离和纯化

蝮蛇蛇毒中活性的组合是激肽释放酶,类凝血酶及类活血纤维酶。其中类凝血酶的精氨酸酯酶的活力最高。分析表明含有较多的酸性氨基酸及辅氨酸。蝮蛇中的类凝血酶属胰蛋白酶家族,通过切除血纤维蛋白原的凝聚,起凝血作用,但在体内因它不会激活凝血因子XⅢ,所以由其水解产生的纤维蛋白凝块的侧链不能交联,易被纤维蛋白溶酯降解,导致体内纤维蛋白浓度下降而表现出抗凝效应。

腹蛇抗栓酶对糖尿病大鼠肾脏功能和形态的影响

本文对链脲佐菌素诱导的糖尿病Wistar大鼠作了为期7个月的蝮蛇抗栓酶(蛇毒)注射洽疗,观察其对肾小球功能和形态的影响。结果显示:蛇毒可显著改善糖尿病血液流变学紊乱,但未能改善糖尿病状态的肾小球高滤过及可能由此而引起的轻度蛋白尿。电镜显示,未经治疗的糖尿病大鼠肾/J、球系膜明显增大,而蛇毒治疗组改变较轻,提示蛇毒治疗可能直接或间接抑制系膜细胞生长。

蝮蛇抗栓酶与门冬氨酸钾镁治疗急性和慢性病毒性肝炎108例的比较

用蝮蛇抗栓酶治疗急、慢性病毒性肝炎病人１０８例（男性６３例，女性４５例；平均年龄３９±ｓ１０ａ），与门冬氨酸钾镁治疗１０８例作对照。蝮蛇抗栓酶０．５Ｕ加５％葡萄糖液５００ｍＬ静脉滴注，ｑｄ，共６０ｄ；门冬氨酸钾镁２０ｍＬ加５％葡萄糖液５００ｍＬ静脉滴注，ｑｄ，共６０ｄ。结果前药总有效率为９１．７％，后药总有效率为８３．３％（Ｐ＞０．０５），在退黄、降酶和改善症状等均优于后药。

去纤酶治疗缺血性脑血管病62例

缺血性脑血管病患者即例(男42例,女20例;年龄50±8yr),均用去纤酶2U稀释于生理盐水250mL,静滴,每周2次,5-6次为一个疗程(部分患者曾用2-3个疗程)治疗。结果表明该药临床有效率为92％,并可显著改善患者的血液流变学及甲皱微循环异常;副作用轻微。