BrdU,CFSE和GFP标记大鼠间充质干细胞的比较

目的:研究BrdU,CFSE和GFP作为大鼠间充质干细胞标记物的可行性.方法:分别用上述三种标记物标记大鼠间充质干细胞,检测即时、15和30d的标记率,通过检测细胞周期、凋亡率和描绘生长曲线,来明确标记物对体外培养大鼠间充质干细胞生长特性的影响;通过流式细胞仪检测标记物对细胞表面标志(CD29,CD34,CD44,CD45)表达的影响.结果:BrdU,CFSE,GFP的即时标记率为77.0%,99.4%,89.7%,1mo后分别下降至51.9%,77.5%,82.9%.三者对体外培养的大鼠间充质干细胞的生长特性和表面标志的表达均无明显影响.结论:GFP,BrdU和CFSE均可以作为大鼠间充质干细胞的标记物.

利用BrdU在CEF(TK^+)细胞中筛选TK^-重组鸡痘病毒

将新城疫病毒 (NDV)四平株 HN基因 ,插入不含报告基因、以 TK为侧翼的鸡痘病毒表达载体 p UTA- 2中的复合启动子下游 ,获得重组表达质粒 p UTA- 2 HN。将重组表达质粒转染鸡痘病毒 (FPV)感染的鸡胚成纤维细胞 (CEF) ,培养、收获病毒后 ,用含 40 m g/ L 5 -溴 - 2 -脱氧尿嘧啶 (Brd U )的培养液 ,在 CEF(TK+)细胞中筛选培养 2代 ,然后用不含 Brd U的培养液进行病毒蚀斑纯化 ,成功筛选出表达 NDV HN蛋白的

BrdU标记检测大鼠垂体前叶细胞的增殖功能

目的:为了观察大鼠垂体前叶细胞中各类激素细胞的增殖水平,建立一种快速、准确、灵敏、无同位素污染的检测垂体前叶细胞增殖的方法。方法:应用原代培养大鼠垂体前叶细胞,加入5-溴-2-脱氧尿嘧啶(BrdU)标记细胞增殖,用抗BrdU抗体进行免疫细胞化学染色,观察大鼠垂体前叶细胞中各类激素细胞增殖能力。结果:大鼠垂体前叶细胞可见Br-dU阳性标记内分泌细胞,其细胞核内可见棕褐色阳性颗粒,核浆比例增大,呈颗粒状,提示处于细胞增殖期。免疫细胞双重染色表明,体外培养垂体前叶的生长激素细胞、催乳素细胞、促肾上腺皮质激素细胞均具有一定的增殖能力。结论:BrdU标记是一种有效的标记垂体前叶细胞增殖的方法,为探究大鼠垂体前叶细胞中各类激素细胞增殖能力提供了理论基础。

用BrdU法研究γ射线外照射诱发外周血淋巴细胞HPRT基因突变

用 5 -溴脱氧尿嘧啶 (BrdU)法检测 ,不同剂量γ射线外照射诱发正常人外周血淋巴细胞HPRT基因突变频率 (MFs) ,并研究其剂量效应关系。抽取正常成年人静脉血 ,分成 5组 ,分别用 0 .0— 4 .0Gy的不同剂量γ射线照射 ,全血培养后用BrdU法检测淋巴细胞HPRT基因MFs。结果表明 ,正常人外周血淋巴细胞的MFs随外照射剂量的增加而上升 ,且剂量效应关系符合线性平方模型。研究证明了BrdU法是一种快速、简便、较敏感的检测外照射诱发HPRT基因突变的方法 ,HPRT基因辐射突变可作为生物剂量计。

应用BrdU-ELISA法检测化学物皮肤致敏性研究

目的研究应用BrdU-ELISA法检测化学物皮肤致敏性。方法将受试物2,4-二硝基氯苯(DNCB)、三氯乙烯(TCE)、三氯乙酸、抗菌冻胶对小鼠双耳背皮肤进行涂抹,25μl/耳,连续染毒3 d,第4天每只小鼠腹腔注射BrdU标记液(0.3ml/只)。第5天取小鼠耳部淋巴结称重,然后制成单细胞悬液,应用BrdU-ELISA法检测淋巴细胞增殖。同时应用豚鼠局部封闭涂皮法检测受试物的致敏性。结果DNCB、TCE各浓度组与AOO溶剂对照组BrdU标记值比较,差异均存在统计学意义(P<0.01),DNCB各浓度组与AOO溶剂对照组淋巴结重量比较,差异均存在统计学意义(P<0.01),而TCE各浓度组与AOO溶剂对照组淋巴结重量比较,差异无统计学意义(P>0.05)。抗菌凝胶组与三氯乙酸分别与空白对照组比较,其中抗菌凝胶组、1%、5%三氯乙酸BrdU标记值差异均无统计学意义,10%三氯乙酸差异则存在统计学意义(P<0.05)。结论BrdU-ELISA法具有检测化学物皮肤致敏性的能力,但其灵敏性比标准LLNA和传统豚鼠局部封闭涂皮法差,需要进一步优化实验方法。

头针对急性脑缺血再灌注大鼠BrdU/nestin表达的实验研究

目的观察头针对局灶性脑缺血再灌注模型大鼠BrdU/nestin表达的影响,探讨头针治疗脑缺血的可能机制。方法将90只健康雌性Wistar大鼠随机分为假手术组、模型组和头针组,各组再根据缺血再灌注时间的不同,随机分为7d、14d、28d共9个亚组。采用大脑中动脉线栓法制备大脑中动脉闭塞(MCAO)再灌注模型,选取顶颞后斜线、顶颞前斜线,进针后接韩氏穴位神经刺激仪,每天治疗1次。对大鼠应用神经功能缺损评分(NSS),免疫荧光检测法观察脑缺血再灌注各时间点大鼠海马齿状回BrdU及BrdU/nestin含量。结果头针组与模型组各时相NSS组间比较,头针组显著低于模型组(P<0.05,P<0.01)。脑缺血再灌注侧海马齿状回BrdU的表达:模型组与假手术组比较均有显著性差异(P<0.01),头针组在各时间点上与模型组比较,均显著性升高(P<0.01),7 d达到峰值,14 d开始下降。脑缺血再灌注侧海马齿状回BrdU/nestin的表达:模型组与假手术组比较均有显著性差异(P<0.01),头针组在各时间点上与模型组比较,均显著性升高(P<0.05),以7 d最为明显(P<0.01)。结论头针可明显改善大鼠神经功能缺损状态,促进神经干细胞得再生,通过增加nestin的含量来促进急性脑缺血再灌注损伤过程中神经干细胞的修复,实现对缺血脑组织保护的目的。

BrdU掺入与T细胞的活化和细胞因子表达的关系

目的:探讨利用流式细胞术(FCM)检测细胞增殖(BrdU掺入)与T细胞的活化及细胞因子表达的关系。方法:正常人PBMC经PMA+Ionomycin刺激不同时间,在培养结束前1 h加入BrdU,利用抗BrdU以及多种抗细胞表面和抗细胞因子抗体标记,FCM检测。结果:体外刺激PBMC 48 h后,可见T细胞有BrdU掺入,但随着时间的延长,掺入率没有明显增加。对比分析BrdU掺入与活化分子表达的关系表明,CD69在刺激后8 h达高峰,而CD25则需要24 h后达到高峰。另外,BrdU掺入与细胞因子表达没有明显关系,当PBMC刺激后8 h,即有大量IFN-γ的表达,而当培养时间延长到24、48和72 h后,IFN-γ的表达没有明显改变。OKT3+antiCD28刺激T细胞后BrdU的阳性率高于PMA+Ionomycin刺激的T细胞,CD8+T细胞掺入率高于CD4+T细胞。结论:利用FCM检测BrdU+细胞可以用于评价T细胞的增殖反应,但在多克隆刺激的条件下,只有少数细胞发生增殖,并且BrdU掺入率受刺激剂种类和时间的影响,BrdU掺入与活化分子和细胞因子的表达均没有明显关系。

差速贴壁联合应用5-BrdU对心肌细胞纯度及活力的影响

目的研究多次差速贴壁并联合应用5-溴脱氧尿苷（5-BrdU）对分离的心肌细胞纯度及活性的影响。方法以酶消化法分离乳鼠心肌细胞，分别进行1—3次差速贴壁并联用或不联用5-BrdU以纯化心肌细胞。正常培养3d后，观察细胞的形态特征。用流式细胞技术分析各实验组心肌细胞的纯度。以台盼蓝染色、MTT比色法及细胞线粒体内膜功能检测（流式细胞术）来反映各实验组心肌细胞的活性。结果随着差速贴壁次数的增加，心肌细胞得以纯化，但细胞的活性有所下降。联用5-BrdU后细胞纯度进一步提高，且对细胞的活性无明显影响；其中两次差速贴壁并联合应用5-BrdU后，可获得纯度高、活性好的心肌细胞。结论两次差速贴壁并联合应用5-BrdU为纯化心肌细胞的有效方法。

静脉移植5-BrdU标记骨髓间充质干细胞参与创面愈合的作用研究

目的:探讨经尾静脉移植入体内的骨髓间充质干细胞(BMSCs)参与皮肤创面愈合的情况。方法:以SD大鼠为研究对象,分离、培养并鉴定大鼠BMSCs。制作大鼠全层皮肤缺损动物模型;经尾静脉注入经5-BrdU标记的骨髓间充质干细胞,于不同时间点(3、7、14、21、28天)观察移植细胞参与创面愈合的情况。结果:经流式细胞仪鉴定细胞表达CD29、CD90表达阳性;CD45表达呈阴性;经体外标记的5-溴脱氧尿嘧啶标记率>90%;标记后的干细胞进行移植4周后,实验组大鼠创面局部及边缘可见BrdU标记的阳性细胞聚集,对照组中未发现明显的聚集现象。结论:5-BrdU完全能够满足移植细胞的标记需要。经尾静脉注射移植入体内的BMSCs可能参与皮肤创面愈合。

Brdu标记的rBMSCs在大鼠体内的迁移

目的 5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,Brdu)体外标记大鼠骨髓间充质干细胞(r BMSCs),通过尾静脉回植于大鼠体内,观察其是否在大鼠体内能向损伤部位迁移。方法采用贴壁筛选法培养r BMSCs,对r BMSCs进行鉴定,用Brdu标记细胞并计算标记率;大鼠颅骨骨缺损模型的建立;Brdu标记的r BMSCs体内回植;分别于7、14、21d后处死大鼠取出损伤部位的颅骨,并对其脱钙、制作切片;做荧光免疫组化染色;用荧光倒置相差显微镜来观察标本处是否有Brdu标记的r BMSCs。结果筛选纯化的骨髓间充质干细胞呈均一的成纤维细胞样,贴壁生长,以长梭形为主,漩涡状盘旋排列,CD45阴性表达,CD44、CD90表达阳性,r BMSCs经诱导后可向成脂、成骨分化。Brdu标记率为86.2%,在标本处检测到Brdu标记的r BMSCs,14d迁移效果最佳。结论 Brdu标记的r BMSCs可以进行大鼠体内的迁移研究。

BrdU标记在大鼠生精细胞体外培养中的应用

目的探讨应用5-溴-2-脱氧尿苷(5-bromo-2-deoxy-uridine,BrdU)标记检测大鼠生精细胞体外的分化、发育情况。方法采用BrdU体内标记生精细胞的DNA,免疫细胞化学法跟踪观察大鼠生精细胞在体外培养中的分化、发育情况。结果培养前在体内标记BrdU的细胞为初级精母细胞,经培养后在BrdU标记的细胞中出现早期精子细胞。结论大鼠生精细胞体外培养过程中,应用BrdU标记能检测生精细胞的分化、发育情况。

侧脑室注射NMDA受体激动剂后精神分裂症小鼠海马齿状回内NR1和BrdU的改变

目的:探讨精神分裂症(schizophrenia,SP)小鼠侧脑室注射N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体激动剂后,海马齿状回(dentate gyrus,DG)颗粒细胞层NR1和5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)阳性细胞数量的改变。方法:选择健康6周龄雄性C57小鼠,地卓西平马来酸盐(MK-801)慢性给药制备精神分裂症动物模型,实验分为NMDA组、生理盐水组、SP组和空白对照组共四组,NMDA组侧脑室注射NMDA受体激动剂。BrdU标记后行免疫荧光染色,激光共聚焦显微镜下观察和计数DG颗粒细胞层NR1和BrdU阳性细胞的表达和数量变化。结果:(1)NR1阳性细胞数在NMDA组、空白对照组、SP组和生理盐水组分别为16.1±2.08,14.5±2.17,19.4±4.65,19.5±4.33,经比较,NMDA组和空白对照组NR1阳性细胞的数量明显少于SP组(P<0.05),但NMDA组与空白对照组相比无明显差异(P>0.05),SP组与生理盐水组相比也无明显差异(P>0.05)。(2)BrdU阳性细胞数在NMDA组、空白对照组、SP组和生理盐水组分别为5.2±2.53、5.3±0.82、3.4±1.58、3.5±1.35,经比较,NMDA组和空白对照组分别多于SP组(P<0.05),和生理盐水组(P<0.05);但NMDA组较空白对照组无明显差异(P>0.05),SP组较生理盐水组亦无明显差异(P>0.05)。结论:SP小鼠侧脑室注射NMDA受体激动剂后,可引起DG颗粒层NR1阳性细胞数减少和BrdU阳性神经细胞数的增多。

用猪AMI模型研究荧光染料CFSE和Brdu作为移植细胞标记物的实用性

目的研究荧光染料CFSE和Brdu作为体内细胞移植标记物的实用性。方法构建猪急性心肌梗死(AMI)模型。用CFSE和Brdu对骨髓单个核细胞进行双标记,经冠状动脉回输至MI区。4周后,利用激光共聚焦显微镜和免疫组织化学法分别观察CFSE和Brdu的定位和标记情况。结果细胞移植4周后,发现Brdu阳性细胞多位于心肌疤痕形成区且MI区的新生血管内壁也出现阳性染色。在MI区可见CFSE标记的带绿色荧光的细胞,但背景色较高。结论在动物实验中,CFSE和Br-du均可作为移植细胞标记物,Brdu的标记效果优于CFSE,适于同时进行形态学和组织学研究。

BrdU免疫组织化学染色方法的改进(漂片法)

目的改进用漂片法进行BrdU免疫组织化学染色时的封闭液,以减少组织切片破损。方法用5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU)标记大鼠踏转轮运动中所引起增殖细胞,通过ABC免疫组织化学方法染色。在染色过程中,比较不同的封闭液(羊血清、牛血清白蛋白、胰酶抑制剂)减少脑片破损的效果。结果踏转轮运动可使大鼠海马齿状回BrdU阳性细胞数明显多于对照组。加入不同的封闭液后,组织片破损率明显下降,尤其是加入牛血清白蛋白和胰酶抑制剂组,但胰酶抑制剂组有非特异性染色。结论牛血清白蛋白是较理想的封闭液。

兔骨髓间充质干细胞的分离培养鉴定及BrdU标记的体外研究

目的:拟在体外建立一种分离纯化、培养扩增、标记兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)的方法。方法:密度梯度离心和贴壁培养相结合,台盼蓝染色观察离心后细胞活性,绘制BMSCs生长曲线,流式细胞仪检测BMSCs表面标记。诱导传代细胞向成软骨细胞分化,2周后免疫组化检测Ⅱ型胶原的表达和阿尔新蓝染色检测蛋白多糖的表达。BrdU标记BMSCs,观察最佳标记率及标记时间,并予四甲基偶氮唑盐方法测定标记后细胞活性。结果:密度梯度离心结合贴壁法能分离培养出纯度较高的BMSCs,分离后细胞活性均大于99%,BMSCs表面标记CD90、CD45、CD34阳性细胞表达分别为99.24%、0.03%、1.37%,BMSCs的生长曲线呈S形。成软骨诱导2周后Ⅱ型胶原免疫组化阳性,阿尔新蓝染色细胞基质被蓝染。BrdU标记后,MSCs标记率>95%,BrdU细胞标记最佳时间为48 h,最佳浓度为10 mg/L,标记后细胞活性高。结论:采用密度梯度离心和贴壁培养相结合,可获得纯度较高BMSCs;BrdU是一种简单、有效的标记BMSCs的方法,BrdU对细胞标记率高。

浅表扩散型胃癌的增殖特征与扩散转移的关系——胃癌增殖细胞Brdu体外标记研究之Ⅱ

应用胃大体标本Brdu体外循环灌流标记和抗Brdu单抗免疫组化检测,对1例浅表扩散型胃癌的细胞增殖特征进行了研究。结果表明;浅表扩散型胃癌的浸润扩散方式与癌组织内增殖细胞的数量和分布特征密切相关。

BrdU和EGFP标记大鼠骨髓间充质干细胞的对比研究

目的:研究5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-21-deoxyuridine,BrdU)和腺病毒介导的增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)标记骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的最佳标记时间与剂量,并进行比较。方法:密度梯度离心分离大鼠骨髓MSCs并体外扩增。AdCMV-EGFP分为100、200、400及800 particles/cell四组进行转染;BrdU以终浓度5、10、15μmol/L进行标记。分别于实验第1、3、5、7 d检测两种方法对MSCs的标记率。通过MTT检测两种标记方法对细胞增殖活性的影响。结果:AdCMV-EGFP以100 par-ticles/cell转染未引起MSCs凋亡,转染3d时效率最高(44.4±3.5%);BrdU以10μmol/L、标记3 d的标记率为(75.1±3.1)%。两种方法均不影响细胞增殖。结论:AdCMV-EGFP和BrdU均可高效标记MSCs,根据研究需要不同均可作为高效的MSCs标记方法。

BrdU标记冷冻胚胎雪旺细胞构建人工神经的研究

目的寻求人工神经较为理想的种子细胞。方法将体外扩增的胚胎兔雪旺细胞两步冷冻法处理后运用组织工程学的原理,5-溴脱氧尿嘧啶(5-bromodeoxyuridine,BrdU)标记后种植到去细胞基膜管中制备2 cm长人工神经桥接体,经培养后,桥接修复兔正中神经缺损。结果16周后移植体再生神经中仍可见到大量BrdU阳性标记的雪旺细胞。冷冻雪旺细胞为种子细胞组,取得了与自体移植组相似的效果。结论冷冻保存胚胎雪旺细胞有可能成为人工神经较好的种子细胞来源。

5-BrdU标记的骨髓间充质干细胞对大鼠创面愈合的作用研究

目的:探讨经5-溴脱氧尿嘧啶(5-BrdU)标记的骨髓间充质干细胞(BMSCs)在大鼠创面愈合中的作用。方法:分离培养大鼠BMSCs并用流式细胞仪技术鉴定。将大鼠背部脊柱一侧作为实验组并制作一全层皮肤缺损模型,其对侧为对照组,经尾静脉注入经5-BrdU标记的BMSCs,移植细胞数为2×107个。术后3天、7天、14天、21天、28天分批处死动物,观察移植细胞参与创面愈合的情况。结果:流式细胞仪鉴定细胞表达CD29、CD90表达阳性;CD45表达呈阴性。实验组:经5-BrdU体外标记的BMSCs进行细胞移植14天后大鼠创面局部及边缘可见5-BrdU标记的阳性细胞聚集,免疫组化染色可见基底层、真皮层、新生血管周围有散在红棕色标记细胞;对照组中未发现明显的聚集现象;抗5-BrdU/FⅧ、5-BrdU/波形蛋白免疫双标技术检测结果显示:在创伤部位有部分BMSCs分化为血管内皮细胞和成纤维细胞参与创面愈合。大鼠对侧正常皮肤中未见明显的BMSCs聚集和增殖分化情况。结论:5-BrdU标记的BMSCs参与皮肤创面愈合。