CML病人TCR Vβ21寡克隆T细胞及其CDR3序列特点

目的分析慢性粒细胞白血病 ( CML)病人的克隆性增殖 T细胞及其 CDR3序列的特点。方法利用 RT- PCR扩增 3例 CML 外周血单个核细胞中 2 4个 TCR Vβ基因的 CDR3,了解 TCR VβT细胞的分布。阳性产物进一步经基因扫描分析 ,了解其克隆性。寡克隆的 PCR产物再进行序列分析。结果 3例病人仅存在 3～ 9个 TCR Vβ亚家族 T细胞 ,部分 Vβ亚家族T细胞呈寡克隆性增殖 ,Vβ2 1的寡克隆 T细胞见于全部的 3例病人中。结论 CML 病人外周血 TCR Vβ亚家族 T细胞出现倾斜性分布和克隆性增殖 ,这可能是 CML 中机体对恶性细胞所引起的特异性免疫反应 ,但对不同病人的 Vβ2 1寡克隆 T细胞序列分析并未能发现完全同源的

利用基因扫描分析TCR Vβ亚家族的CDR3长度方法检测T细胞克隆性

分析了健康人、Ｔ－ＡＬＬ外周血及Ｔ细胞株Ｍｏｌｔ－４和Ｊｕｒｋａｔ中ＴＣＲＶβＴ细胞的表达和克隆性。应用ＲＴ－ＰＣＲ扩增ＴＣＲＶβ２４个亚家族的ＣＤＲ３，并经基因扫描和序列分析确定Ｔ细胞克隆性。结果表明健康人表达除Ｖβ２０外的多克隆Ｔ细胞；Ｔ－ＡＬＬ仅表达３～４个Ｖβ亚家族Ｔ细胞；部分呈寡克隆性；Ｍｏｌｔ－４和Ｊｕｒｋａｔ分别表达Ｖβ２和Ｖβ８单克隆Ｔ细胞。Ｔ－ＡＬＬ中存在克隆性生长Ｔ细胞。该方法是检测Ｔ细胞克隆性的敏感和精确的方法。

活动性肺结核患者α/βTCR基因重排及CDR3谱型分析

目的:建立多重PCR方法扩增α/βTCR全长序列,分析活动性肺结核患者病变局部T淋巴细胞α/βTCR基因重排特点及CDR3谱型。方法:分离结核患者肺泡灌洗液中的淋巴细胞,提取RNA后用SMART方法逆转录,运用根据现有文献设计的α和βTCR扩增引物,进行多重PCR扩增以获得其全长序列,构建重组质粒并测序,利用DNAstar及网上TCR资源分析序列。结果:3例患者共获得24个α链序列,13个β链序列。α链以AV1S2(54%)、AV12S3(41%)、AV12S2(5%)为主;β链以BV2(38%)、BV29S1(46%)、BV14(3%)、BV4S2(3%)为主。同一病例及不同病例之间CDR3区呈现多样性,但是标本1、标本3各有一条β链的CDR3氨基酸序列相同:SVGTGTLHQETQY;标本2和标本3的各有2条α链CDR3序列相同:AVRDWAGNMLT;标本2的一个α链和标本3的一个α链的CDR3均有:AV…DNN…RLM序列。结论:建立了TCRα和β链全长序列的多重PCR扩增方法。结核患者病变局部克隆性增殖的TCRα和β链谱型呈限制性取用,克隆增生的T淋巴细胞来自不同的亚群,但是相同的CDR3序列对于识别MTB多肽可能具有特异性。

CDR3突变提高抗TNF-αFab段的亲和力

目的通过抗体库技术在CDR3区引入限定性突变以提高抗TNF-α抗体Fab的亲和力.方法首先合成含CDR3区突变的寡核苷酸,限定突变率以保持50%～70%的亲本序列,通过重叠延伸PCR的方法引入突变,构建突变库,再以硫氰酸铵溶液作洗涤液,筛选亲和力得到提高的特异性克隆,用非竞争性ELISA法测定亲和常数.结果从轻链突变库中筛选得到1个活性提高的特异性克隆K8,在第93位发生N→R突变,其亲和常数为2.8×108 L/mol,较亲本抗体(0.1×108 L/mol)提高了近28倍;从重链突变库中筛选得到多个活性增高的克隆,部分克隆测序显示96、97和100 d位置发生R→K、Y→Q、M→L突变的几率最高,且对亲和力提高贡献大.测定了10个变种的亲和常数,分别为0.2×108、0.22×108、1.8×108、3.2×108、3.3×108、3.5×108、3.7×108、4.0×108、 6.3×108和6.5×108 L/mol,最大的提高了近65倍.结论 CDR3区的限定性突变可显著提高抗体亲和力.

CML细胞抗原相关TCR Vα13/Vβ21和Vα18/Vβ21寡克隆T细胞及其CDR3序列特点

目的:分析慢性粒细胞白血病(CML)病人的克隆性增殖T细胞及其CDR3序列的特点。方法:利用RT-PCR和基因扫描分析1例CML患者外周血单个核细胞中的TCR Vα和Vβ基因的互补决定区(CDR3),了解各Vα和Vβ亚家族的限制性表达情况和T细胞克隆性增殖特点,寡克隆的PCR产物再进行序列分析。结果:该病人外周血T细胞表达18个TCR Vα和12个TCR Vβ亚家族,其中Vα13、Vα18、Vβ1和Vβ21亚家族呈寡克隆性。CDR3序列分析获得3个TCR克隆基因序列,分别为Vα13NJα49、Vα18NJα50和Vβ21NDβNJβ2.7。结论:获得1例CML病人外周血克隆性增殖αβ+T细胞的3个TCR基因CDR3序列,提示病人可能存在与CML细胞抗原相关的Vα13/Vβ21或Vα18/Vβ21T细胞克隆。

银屑病T细胞应答及TCRCDR3谱系研究进展

银屑病是一种与免疫应答异常有关的慢性复发性炎症性疾病,其发病机制至今未完全阐明。目前普遍认为T细胞介导的细胞免疫功能紊乱在银屑病发生及持续发展中发挥了重要作用。本文将从T细胞应答及TCR CDR3谱型分布特征入手,对TCR偏向及CDR3组库特征和银屑病发病的关系进行综述,为银屑病的发病机制研究和个体化治疗提供新思路。

采用荧光定量PCR溶解曲线法监测人TCR alpha链CDR3谱系漂移技术的初步探讨

目的:初步探讨荧光定量PCR溶解曲线分析技术监测人外周血T细胞TCRalpha链CDR3谱系漂移(单/寡/多克隆增生)。方法:提取4例正常人、2例淋巴瘤型白血病患者PBMC中的总RNA,逆转录成cDNA,以32个人TCRalpha链胚系可变区基因家族(TRAV)设计上游引物,共同的TCRalpha胚系链恒定区基因家族(TRAC)设计下游引物,荧光定量PCR(FQ-PCR)扩增32个TRAV基因各家族CDR3谱系,溶解曲线法分析各家族CDR3谱系的单/寡/多克隆增生。结果:正常人外周血T细胞TCRalpha链32个家族CDR3表达频率不一致,各家族PCR产物的溶解曲线谱型图(melting curve spectratyping)呈现熔点不同的CDR3多态性,为多克隆增生的高斯分布,2例淋巴瘤型白血病患者外周血T细胞TCRalpha链32个家族CDR3表达频率不一致,部分家族呈缺失状态,患者各家族PCR产物的溶解曲线谱型图上,多数家族为多克隆增生的高斯分布,但每个患者均出现数量不等的单克隆和寡克隆增生家族。结论:荧光定量PCR溶解曲线分析TCRalpha链CDR3谱系漂移技术方法稳定简便,能较好地监测正常人和临床样本外周血T细胞TCRalpha链CDR3谱系漂移(单/寡/多克隆增生)。

特异性CDR3区取代型γδTCR转染细胞的构建及生物学功能鉴定

目的:建立特异性CDR3区取代型γδTCR转染细胞平台。方法:利用搭桥PCR的方法将已知的γδT细胞克隆DBS4.3特异性CDR3编码序列嵌入到γ9和δ2cDNA序列中,取代原有的CDR3区序列,获得的全长γ9和δ2链分别插入真核表达载体pREP7和pREP9中,共转染J.RT3-T3.5细胞,双压力抗生素筛选获得表达特异性γδTCR的转染细胞,通过ELISA和Re-altime PCR检测该转染细胞在接受抗原刺激后IL-2的分泌情况。结果:ELISA和Realtime PCR结果显示表达DBS4.3特异性γδTCR的转染细胞在DBS4.3特异性抗原仲丁胺和抗γδTCR抗体刺激作用下,活化分泌IL-2。结论:构建了特异性CDR3区取代型γδTCR转染细胞平台,为研究γδTCR识别抗原的机制奠定了基础。

APL相关TCR Vα6、Vα10和Vβ23寡克隆T细胞CDR3序列分析

目的:分析急性早幼粒细胞白血病(APL)患者外周血TCRVα和Vβ克隆性增殖T细胞及CDR3序列特点。方法:利用RT-PCR法扩增1例APL患者外周血单个核细胞中29个TCRVα基因和24个Vβ基因CDR3,阳性PCR产物进一步经荧光标记和基因扫描分析确定其CDR3长度,了解其克隆性;寡克隆的PCR产物再进行CDR3区序列分析。结果:该例APL患者外周血T细胞分别在TCRVα6、Vα10和Vβ23亚家族中出现寡克隆性增殖T细胞,经序列分析显示TCRVα6、Vα10和Vβ23亚家族基因序列分别为Vα6NJα17、Vα10NJα35和Vβ23NDβ1NJβ2.7,其CDR3区氨基酸序列分别为CAMRENSAGNK,YLCAGDELLWECA,CASSSKWAG-GTYEQY,该3个TCR基因已被GenBank收录(登陆号:EU544946、EU544947和EU647219)。结论:APL患者外周血T细胞出现的TCRVα6、Vα10和Vβ23克隆性增殖T细胞可能是机体对抗白血病细胞所引起的抗原特异性免疫反应;这3个独特TCR重排序列将进一步作为开展APL特异性免疫治疗研究提供资料。

日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30重链(CDR3)_6基因的构建表达及初步鉴定

目的设计、构建日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30重链(H链)CDR3区6倍重复表位基因(CDR3)6,并对表达产物进行初步鉴定。方法克隆NP30H链(CDR3)6基因,导入PET-28(a)载体并在E.coliBL21中表达;表达产物经纯化后用ELISA方法测定活性。结果(CDR3)6基因被成功构建、表达,表达产物经ELISA检测证实其可与抗NP30抗体NP48及日本血吸虫病人血清反应。结论(CDR3)6部分保留了抗独特型抗体表位的亲和性和特异性。

强的松治疗重症肌无力对TCR V β亚家族表达及CDR3谱型的影响

目的 探讨重症肌无力(MG)患者T细胞受体(TCR)β链(V β)亚家族优势表达及β链3号互补决定区(CDR3)的长度谱型特点;研究强的松治疗MG患者前后TCR V β优势表达及β链CDR3长度谱型特点的变化。方法 通过逆转录聚合酶链式反应扩增MG患者外周血循环T细胞中不同亚家族含CDR3的大片段,分析亚家族的表达,并经基因扫描(长度谱型分析)分析CDR3谱型。结果 MG患者外周血TCR Vβ 6、8、12、15亚家族呈倾斜性分布,且部分亚家族T细胞呈现单克隆或寡克隆增殖;强的松治疗后症状明显改善,倾斜性分布现象在缓解期逐渐恢复正常。结论 TCR V β 6、8、12、15亚家族可能与MG症状有关;强的松类肾上腺皮质激素药治疗MG的机制可能是通过改变TCR V β亚家族表达以及抑制病理性T细胞克隆增殖而发挥作用。

基于荧光定量PCRDNA熔解曲线技术分析浸润性导管乳腺癌患者外周血和肿瘤组织TCR beta链CDR3谱系（英文）

目的采用TCR beta链CDR3谱系荧光定量PCR的DNA熔解曲线技术,探讨浸润性导管乳腺癌患者外周血T细胞和肿瘤组织T细胞之间TRBV基因表达情况。方法从遵义医学院附属医院甲乳外科采集乳腺癌志愿患者的乳腺肿瘤组织和外周血样本,选取病理诊断为浸润性导管癌的志愿患者23例,免疫组织化学检测ER、PR、PS2、C-erb B-2、nm23、P53和Ki-67的表达。分离每位志愿患者外周血单个核细胞(PBMCs),提取PBMCs和肿瘤部位组织总RNA,逆转录为c DNA,荧光定量PCR技术扩增各c DNA样本的TCR beta链CDR3区,DNA熔解曲线法对比分析各样本TRBV基因家族的表达情况。结果 23例浸润性导管乳腺癌志愿患者,外周血样本中TRBV6、TRBV8、TRBV12、TRBV14和TRBV24表达超过50%,肿瘤组织样本中TRBV6、TRBV12、TRBV14和TRBV24表达超过50%。选取的23例样本中的20例,其外周血和肿瘤组织均过表达相同的TRBV基因家族,但总TRBV基因家族的表达与ER、PR、PS2、C-erb B-2、nm2、P53和Ki-67的阳性或阴性没有明显的相关性。结论浸润性导管乳腺癌患者的外周血和肿瘤组织之间TRBV基因表达出现一致性,但表现出复杂多样性,与乳腺肿瘤相关抗原无明显相关,其机制可能与乳腺癌个体化的全身和局部免疫应答相关,对乳腺癌外周血和肿瘤组织部位特异T细胞TRBV基因表达探讨可为乳腺癌的免疫机制和个体化治疗提供理论基础。

人B细胞淋巴瘤细胞系Namalwa CDR3基因片段的克隆及其DNA疫苗制备

目的 :为探讨B细胞淋巴瘤细胞膜表面免疫球蛋白可变区的互补决定区 3能否在动物体内激发特异性抗独特型抗体 ,以人B细胞淋巴瘤细胞系Namalwa为模型 ,克隆其膜表面免疫球蛋白重链可变区互补决定区 3(CDR3)基因片段作为抗原基因 ,构建DNA疫苗质粒。方法 :以RT PCR的方法获得互补决定区 3(CDR3)基因片段 ,进而克隆了小鼠单核细胞趋化因子 (MCP 3)基因作为佐剂分子 ,以重组PCR的方法获得CDR3和MCP 3基因的融合基因片段 ,克隆在真核表达载体pcDNA3 1中构建DNA疫苗质粒 ,然后通过脂质体转染的方法验证该质粒在真核细胞中的表达情况。结果 :应用分子生物学的方法获得了以Namalwa细胞mIgCDR3作为抗原基因的DNA疫苗质粒。结论 :人B细胞淋巴瘤细胞系NamalwaCDR3基因的DNA疫苗构建正确 ,体外瞬时转染实验证明该质粒能够在真核细胞中正确表达。

结直肠癌T细胞克隆TCRβ基因CDR3区氨基酸序列的初步分析

目的 通过建立结直肠癌肿瘤浸润性淋巴细胞 (tumorinfiltratinglymphocytes ,TIL)和术前外周血 (peripheralbloodlymphocytes ,PBL)中抗肿瘤T细胞克隆的TCRβ基因谱型 ,确定抗肿瘤T细胞克隆的分子特征。方法 采用RT PCR方法扩增结直肠癌TIL和PBL的TCRβ基因的 2 4个不同V家族基因片段 ,经过测序凝胶分离和特殊银染色 ,结合测序结果确定TCRβ基因谱型。 结果 结直肠癌患者具有TIL和 /或PBL中T淋巴细胞的克隆性增殖。有些T细胞克隆表达相同的CDR3区氨基酸基序。CDR3区不同位点具有特征性的疏水性和极性氨基酸以及甘氨酸的分布。结论 通过分析结直肠癌抗肿瘤T细胞克隆特征性的CDR3区氨基酸序列 ,将有益于发现新的抗肿瘤免疫治疗方法。

内毒素耐受状态下胸腺细胞TCRβ链CDR3区多态性和长度的变化

目的研究内毒素耐受状态下小鼠胸腺T细胞TCRβ链CDR3多态性和长度的变化,并探讨其意义。方法以5mg/kg浓度LPS腹腔注射C57BL/6小鼠建立内毒素耐受模型,5 mg/kg浓度生理盐水腹腔注射72 h后为对照组,提取对照组、模型后72 h实验组和8 d实验组的小鼠胸腺组织RNA,并逆转录为c DNA;以22条TRBV基因家族序列设计上游引物,TRBJ1-1基因家族序列设计下游引物,PCR扩增出完整的TCRβ链CDR3区;毛细管电泳技术分析TCRβ链CDR3区的多态性和长度。结果正常小鼠胸腺样本多数呈现中间高两边低的正态性分布的TCRβ链CDR3谱型峰图,少数呈现偏峰、寡峰或低峰;LPS注射后72 h胸腺样本TCRβ链CDR3区呈现数量不等的偏峰、寡峰和低峰;模型8 d胸腺样本大多呈现多峰。此外,与正常组相比,模型72 h和8 d胸腺样本TCRβ链CDR3区产物长度均发生了不同程度的变化。结论内毒素耐受状态下,小鼠胸腺细胞TCRβ链CDR3区的多态性和长度均发生了明显改变,为后续进一步研究该状态下胸腺细胞发育及功能变化提供前期实验基础。

MSM HIV感染者特异性T细胞TCR α CDR3谱序初探

目的监测HIV感染者的外周血样本TCRα链CDR3谱系变化,发现HIV特异性TCR TRAV家族。方法用本实验室已建立的"荧光定量PCR溶解曲线法监测HIV感染者TCR CDR3谱系漂移技术",对22名健康男性、19名MSM HIV感染者的外周血样本TCRα链CDR3变化进行监测。结果MSM HIV感染者的TRAV4.2,TARV10和TRAV23的单(寡)性表达频率要高于健康男性人群(P<0.05),MSM HIV感染者的TRAV亚家族的缺失率(1.70%)虽然高于对照男性健康人群的TRAV亚家族的缺失率(0.80%),但二者没有统计学差异。结论在国内首次利用"荧光定量PCR溶解曲线法"监测HIV感染者TCRα链CDR3漂移变化,发现MSM HIV感染者的TCR AV家族存在单(寡)性增生和缺失现象,非正态分布现象增加,多样性减少。

妊娠对孕妇外周血IGH-CDR3免疫组库的影响

目的:探讨妊娠期女性外周血中IGH-CDR3序列的多样性与免疫学特性。方法:分离9例正常妊娠末期和7例非妊娠期女性外周血淋巴细胞,逆转录为cDNA ARM-PCR扩增H链CDR3区序列,高通量测序后通过与IMGT数据库对比,揭示妊娠期IGH-CDR3免疫组库的多样性及免疫学特征。结果:妊娠期女性外周血IGH-CDR3的数目和种类均小于非妊娠女性;妊娠期女性有独特的免疫学特性,包括IGH-CDR3长度、N末端碱基的添加数、V区域使用偏好基因及末端去除的碱基数;一些CDR3肽段在妊娠期女性中特有表达。结论:妊娠会降低孕妇外周血循环中B细胞的数量和种类并使IGH-CDR3区的免疫学特性发生变化。

子痫前期患者外周血IGH-CDR3免疫组库的变化

目的:探讨子痫前期患者外周血中IGH-CDR3序列的多样性与免疫学特性。方法:分离子痫前期患者外周血中的B淋巴细胞,逆转录为cDNA后用ARM-PCR扩增H链CDR3区序列,利用高通量测序并与IMGT数据库对比揭示子痫前期患者IGH-CDR3受体库的多样性及免疫学特征。结果:5例子痫前期患者外周血IGH-CDR3的数目和种类差别较大,从1127条read到47385read;子痫前期患者有独有的免疫学特性,包括IGH-CDR3长度、N末端碱基的添加数、V、J区域使用偏好基因及末端去除的碱基数;子痫前期患者外周血中存在某些寡克隆异常增殖的情况。结论:子痫前期患者外周血IGH-CDR3免疫组库有其独有的特点。

HBsAb滴度高于10000mU/ml外周血BCR CDR3受体库的组成及特征分析

目的:分析HBs Ab滴度>10 000 m U/ml外周血BCR CDR3受体库的组成及特征,寻找可能的HBs Ab序列,为维持后续研究提供数据基础。方法:提取HBs Ab滴度高于10 000 m U/ml样本的PBMC总DNA,外送美国Adaptive Biotechnologies Immuno SEQ平台行Illumina Solexa高通量测序,用IMGT数据库中的High V-QUEST软件初步分析BCR CDR3受体库IGHV、IGHJ和IGHD基因亚群的分布情况、IGHV-J配对取用情况、CDR3区氨基酸长度分布及氨基酸取用情况,并与NCBI数据库中HBs Ab序列进行比对。结果:实验样本均高频取用基因亚群IGHV3、IGHV4,IGHJ4、IGHJ6,IGHD3、IGHD6;高频取用配对IGHV3-J4、IGHV3-J6。CDR3区氨基酸长度均以14及15个氨基酸长度为中线呈正态分布,高频取用的氨基酸依次为Y、G、D、A、R、S,在107、108、109、113、114位点呈现氨基酸多样性取用,在105、106、115、116、117位点上取用氨基酸保守。与NCBI数据库中HBs Ab序列比对,得到IGHV、IGHJ、CDR3氨基酸长度完全一致的独特序列共48条。结论:HBs Ab滴度高于10 000m IU/ml样本BCR CDR3受体库的组成具备基本一致的特征,获得的48条独特序列为维持后续研究提供了坚实的数据基础。

麻风T细胞应答及TCR CDR3谱序研究进展

麻风的发生、发展及转归与机体免疫系统密切相关,其中T细胞介导的免疫应答发挥了关键性作用。T细胞通过T细胞受体(TCR)互补决定区CDR3与麻风分枝杆菌抗原结合,产生特异性T细胞免疫效应。测定TCR CDR3谱型分布特征能够反映麻风分枝杆菌感染状态下特定T细胞的扩增程度。本文就麻风T细胞应答及TCR CDR3谱序研究进展作一综述。