接合物蛋白Crk和CrkL在上皮性卵巢癌中的表达及意义

目的探讨接合物蛋白Crk和CrkL在上皮性卵巢癌中的表达及意义。方法采用免疫组化SP法,观察Crk和CrkL蛋白在上皮性卵巢癌不同临床病理指标内的表达,并与卵巢良性上皮性肿瘤及正常卵巢组织进行比较。结果上皮性卵巢癌中Crk和CrkL蛋白的表达与卵巢良性上皮性肿瘤及正常卵巢组织比较差异有统计学意义(P<0.05)。不同分化程度、临床分期的上皮性卵巢癌Crk蛋白的表达间差异有统计学意义(P<0.05)。不同分化程度、临床分期的上皮性卵巢癌CrkL蛋白的表达情况间差异无统计学意义(P>0.05)。不同组织病理类型的上皮性卵巢癌Crk和CrkL蛋白的表达间差异无统计学意义(P>0.05)。结论Crk和CrkL蛋白可能在上皮性卵巢癌的发生、发展中发挥某种作用,与CrkL蛋白相比,Crk蛋白的过度表达可能更直接影响着卵巢癌浸润、转移等恶性生物学行为。

miR-126在胃癌中的表达及其靶基因Crk的鉴定

目的:分析miR-126在胃癌中的表达水平并鉴定miR-126的靶基因,以阐明miR-126在胃癌发生机制中的功能。方法:采用qRT-PCR分别检测miR-126在胃癌细胞株、正常胃黏膜组织、永生化胃黏膜上皮细胞、胃癌及配对癌旁组织的表达水平,并与胃癌组织的临床病理指标进行相关性分析。采用生物信息学方法预测出miR-126的靶基因,并通过荧光素酶报告系统加以验证;采用qRT-PCR及Western印迹法检测miR-126对靶基因mRNA及蛋白质表达水平的影响。结果:qRT-PCR检测结果显示,miR-126在胃癌细胞株中的表达水平明显低于其在正常胃黏膜组织及永生化胃黏膜上皮细胞株的表达水平。miR-126在60例病人的胃癌组织中表达的水平显著低于其在配对癌旁组织中表达的水平;且胃癌组织miR-126表达水平低者,肿瘤组织体积较大,胃壁浸润较深,易发生淋巴结转移,病理分期也较晚。生物信息学分析提示Crk mRNA的3′UTR含有miR-126直接作用的靶序列,荧光素酶报告系统检测进一步验证了该靶序列,qRT-PCR及Western印迹法证实miR-126对Crk蛋白表达的调控发生在转录后水平。结论:miR-126有望成为研究胃癌的新型标志物;miR-126通过对其靶基因Crk的调控参与了胃癌的发生、发展过程。

接合物蛋白CrkⅠ在卵巢癌恶性潜能中的作用

目的证实接合物蛋白CrkⅠ在卵巢癌恶性潜能中的作用。方法采用Western blot法检测卵巢癌组织、卵巢良性肿瘤组织、正常卵巢组织中Crk和Dock180蛋白的表达;用免疫沉淀法检测3种卵巢癌细胞株中Crk与Dock180蛋白的内源性结合;用小干扰RNA敲低SKOV3细胞中内源性的Crk,检测Crk表达缺失性细胞Crk蛋白表达水平、Rac1酶活性和侵袭力的变化。结果 Dock180与CrkⅠ的表达强度呈现明显的一致性,卵巢癌组织中二者的表达均显著高于卵巢良性肿瘤组织和正常卵巢组织(P<0.05);而在卵巢良性肿瘤组织与正常卵巢组织之间未发现明显差异(P>0.05)。3个卵巢癌细胞株中Dock180主要表现出与CrkⅠ的内源性结合。和对照相比,敲低Crk基因的细胞表现出侵袭能力和Rac1酶活性明显下降(P<0.05),而敲低CrkⅠ的细胞和同时敲低CrkⅠ和CrkⅡ的细胞相比无明显差异(P>0.05)。结论卵巢癌的恶性生物学行为与Crk/Dock180/Rac1信号通路相关,其中CrkⅠ在卵巢癌中扮演着主要角色。

乳腺癌组织中Crk蛋白的表达及其临床意义

目的探讨Crk在乳腺癌中的表达及其临床意义。方法应用免疫组化方法检测Crk在125例乳腺癌和20例乳腺良性肿瘤组织中的表达,分析其与乳腺癌临床病理特征及预后的关系。结果Crk在乳腺癌组织中的阳性表达率为39.2%,明显高于在乳腺良性肿瘤中的表达(χ2=6.447,P=0.011),Crk表达与乳腺癌组织学分级(χ2=4.965,P=0.026)有关,与TNM分期(r=0.258,P=0.004)、淋巴结转移(r=0.261,P=0.004)和HER-2(r=0.287,P=0.021)呈正相关;Crk表达阳性组和阴性组的5年特异生存率分别为38.4%和63.4%,差异有统计学意义(P=0.018)。结论Crk蛋白在乳腺癌组织中表达上调,其高表达提示乳腺癌生物学恶性度较高,预后不良。对乳腺癌患者组织标本进行Crk检测,有助于指导乳腺癌患者的个体化治疗。

接合物蛋白Crk与CrkL在卵巢癌细胞株MCAS细胞增殖中的不同作用

目的探讨接合物蛋白Crk和CrkL在卵巢癌细胞株MCAS细胞增殖中的不同作用。方法采用免疫共沉淀法检测上皮性卵巢癌细胞株MACS中Crk和CrkL蛋白与已知的与肿瘤增殖相关的上下游结合蛋白的内源性结合;用可调节性siRNA敲低MACS细胞中内源性的Crk及CrkL,观察二者对细胞生长及存活能力的影响。结果免疫共沉淀显示卵巢癌细胞株MACS中,Crk与影响细胞生长增殖的上游蛋白p130Cas及下游蛋白Sos的结合明显强于CrkL,尽管Crk与CrkL表现出部分相同的免疫原性。免疫印迹显示在加入Dox后即Crk或CrkL表达沉默被启动。Crki/CrkLi细胞中加入Dox后Crk与CrkL表达明显降低[Dox+:Crk(0.021±0.001),CrkL(0.676±0.005);Dox-:Crk(0.544±0.003),CrkL(1.282±0.007),P<0.05]。对可调节性siRNA构建之可控性Crki/CrkLi细胞的连续动态观察发现,Crki细胞表现出细胞增殖力受限仍保存生存活力,而CrkLi细胞则表现出逐渐脱壁至死亡。结论 Crk及CrkL在卵巢癌细胞MCAS的恶性增殖中扮演着不同的作用,Crk蛋白的过度表达可能直接影响着卵巢癌细胞恶性增殖,而CrkL则可能更多地参与了细胞基本生存相关的生物行为。

Crk在胃癌中的表达及其临床意义

目的:探讨接头蛋白Crk在胃癌组织中的表达及其与胃癌临床病理因素及预后的关系。方法 :采用免疫组织化学方法检测368例胃癌病人肿瘤组织和配对癌旁组织Crk蛋白表达水平,分析其表达与临床病理因素及预后之间的关系。结果:与癌旁组织相比,胃癌组织中Crk蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。其表达水平与肿瘤大小(P<0.05)、浸润深度(P<0.05)、淋巴结转移(P<0.05)、TNM分期(P<0.05)密切相关。Crk蛋白表达水平越高,病人预后越差(P<0.05)。多因素分析表明,Crk蛋白是影响胃癌病人预后的独立危险因素。结论:Crk蛋白在胃癌的发生、发展中起重要作用,可作为预测胃癌预后的分子标志物。

Crk基因shRNA质粒的构建及其在肝纤维化中的作用

目的:构建靶向信号接头蛋白Crk的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)的真核表达载体质粒,研究其对肝星状细胞株LX-2功能的影响.方法:根据Crk mRNA序列进行设计并合成shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并连接入plko载体.包装Crk慢病毒,感染人肝星状细胞株LX-2.研究其对LX-2细胞增殖、迁移和活化功能的影响.结果:定量PCR和Western blot检测结果提示成功构建了针对Crk特异性shRNA真核表达质粒,shCrk组的Crk表达明显低于对照组.干扰Crk基因后,LX-2细胞的活化、迁移能力减弱;而细胞增殖没有受到影响.结论:LX-2中成功构建Crk基因的shRNA真核表达载体;下调Crk基因后能够抑制LX-2细胞的活化和迁移.

超声微泡介导miR-126通过调节CRK抑制乳腺癌细胞生长

目的:探究超声-微泡介导的miR-126通过调节CRK对乳腺癌细胞活力的影响。方法:qPCR检测miR-126在乳腺癌组织和乳腺癌细胞系中的表达,并分析其表达与乳腺癌临床特征的相关性。利用超声技术制备脂质微泡以探究超声-微泡介导的miR-126对乳腺癌细胞增殖、侵袭和凋亡的影响。EdU染色、Transwell和流式细胞术分别用于检测MDA-MB-231细胞增殖、侵袭和凋亡情况。qPCR和Western blot检测CRK的mRNA和蛋白水平。此外,Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、c-Caspase-3和pro-Caspase-3的蛋白水平。结果:miR-126在乳腺癌组织和细胞中表达下调。过表达miR-126抑制乳腺癌细胞活力和侵袭能力,促进细胞凋亡。超声-微泡介导的miR-126进一步增强了miR-126对乳腺癌细胞活力的抑制作用。另外,miR-126通过调节CRK从而抑制乳腺癌细胞的活力。结论:miR-126过表达可抑制乳腺癌细胞的活力,超声-微泡介导的miR-126进一步增强了miR-126对乳腺癌细胞活力的抑制作用。本研究为乳腺癌的治疗提供了新的分子靶标和治疗途径。

拟南芥CRKs家族自抑域序列的预测

目的:以拟南芥CDPKs激酶家族为摹本,推测类结构激酶家族CRKs的自抑域。方法:以生物信息学工具phylip3.65和clustalx1.83对CDPK家族和CRK家族进行进化树构建和多重序列比对分析。结果:结果显示CDPK亚家族Ⅳ与CRK家族的相似程度很高,且自抑域序列区域非常保守。以此为依据预测了CRK家族各成员的自抑域序列。

DLC-1、FAK及p130Crk相关底物在卵巢上皮性癌中的表达及意义

目的:研究肝癌缺失基因-1(DLC-1)、粘着斑激酶(FAK)及p130Crk相关底物(p130Cas)在卵巢上皮性癌组织中的表达及其临床意义。方法:采用免疫组化法检测正常卵巢和卵巢癌组织中DLC-1、FAK和p130Cas蛋白的表达。结果:卵巢癌组织中DLC-1蛋白表达低于正常卵巢组织(P<0.05);FAK和p130Cas蛋白的表达均高于正常卵巢组织(P<0.05)。DLC-1蛋白的低表达与卵巢癌的临床分期、腹水和淋巴结转移相关。FAK蛋白的高表达与卵巢癌的分化程度、腹水和淋巴结转移相关。p130Cas蛋白的高表达与卵巢癌的临床分期和淋巴结转移有关。卵巢癌中DLC-1与FAK和p130Cas的蛋白表达之间均呈负相关。结论:DLC-1低表达或表达缺失和FAK及p130Cas的高表达可能与卵巢癌的发生、发展有关。DLC-1和FAK及p130Cas的联合检测有助于判断卵巢癌的恶性程度。

龙眼类受体蛋白激酶CRK家族全基因组鉴定及表达调控分析

为了解龙眼富含半胱氨酸的类受体蛋白激酶(cysteine-rich receptor-like kinase,CRK)家族的基本特征与功能,本研究采用生物信息学分析方法对筛选出的98个龙眼CRK基因家族的成员进行分析鉴定,包括分子进化树的构建和对蛋白结构域及其特性、启动子及其顺式作用元件、体胚发生的过程以及组织器官特异性表达的分析。结果显示:通过对龙眼和拟南芥CRK基因做进化树分析,可根据亲缘关系的远近将其分为7个亚家族;不同亚家族成员的蛋白质特性(氨基酸数量、相对分子质量、等电点、信号肽及糖基化位点)有所不同;各成员基因结构特性,启动子顺式作用元件,蛋白结构域特性等与进化树中家族成员亲缘关系的远近相关;98个CRK家族成员在体胚发生过程(NEC、EC、ICpEC、GE)以及生长发育过程中组织器官特异性表达情况有所不同,其中在非胚性愈伤组织以及幼果中表达量较高,在种子和果实中几乎未表达。此外,富含半胱氨酸的类受体蛋白激酶在生物胁迫、非生物胁迫(抗病虫害、抗旱、抗寒、抗盐胁迫等)以及在植物生长发育过程中起着重要作用。

信号接头蛋白Crk在子宫颈癌组织中的表达和意义

目的:研究信号接头蛋白Crk在宫颈癌及其癌前病变组织中的表达,探讨Crk在宫颈癌发生发展中的作用。方法:采用免疫组化SP法检测20例正常宫颈组织、27例宫颈上皮内瘤样病变(Cervial intraepithelial neoplasias,CINs)和50例宫颈癌切片中Crk蛋白的表达水平。结果:Crk蛋白在宫颈癌组织中的阳性表达率为68%,高于CINs的40.7%和正常宫颈组织的10%,差异有统计学意义(P﹤0.05)。结论:Crk可能在宫颈癌的生长、侵润及转移过程中起重要作用,有望作为反映宫颈癌恶性潜能的新指标。

小麦富含半胱氨酸的类受体激酶TaCRK2与翻译控制肿瘤蛋白TaTCTP的相互作用

TaCRK2在叶锈菌侵染小麦诱发的过敏性反应中起正调控作用,为深入了解TaCRK2在小麦抵抗叶锈菌侵染中的作用机制,本试验采用串联亲和纯化与质谱联用(TAP-MS)技术,鉴定出翻译控制肿瘤蛋白(Translationally controlled tumor protein,TCTP)为TaCRK2的潜在互作蛋白。但TaCRK2与TaTCTP的相互作用还缺乏试验证据,本研究利用DUALmembrane系统酵母双杂交(DUALmembrane system yeast-twohybrid)和双分子荧光互补(Bimolecular fluorescence complementation,BiFC)技术验证TaCRK2和TaTCTP之间的相互作用。DUALmembrane系统酵母双杂交结果显示,同时携带TaCRK2和TaTCTP的酵母NMY51可以在缺陷型培养基上生长;BiFC试验结果显示,TaCRK2和TaTCTP发生相互作用,并且定位在烟草表皮细胞的内质网膜上。本研究为深入了解TaCRK2在叶锈菌侵染小麦诱发的过敏性反应中的作用机制奠定了基础。

联合检测血清和胸腔积液Crk样蛋白、CEA在恶性胸腔积液诊断中的价值

目的评价联合检测血清和胸腔积液中Crk样蛋白(CRKL)、癌胚抗原(CEA)对恶性胸腔积液的诊断价值。方法采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测47例恶性胸腔积液和46例良性胸腔积液患者的血清和胸腔积液CRKL、CEA水平。结果恶性胸腔积液组血清CRKL显著高于良性胸腔积液组(P<0.001),恶性胸腔积液组胸腔积液CRKL浓度显著高于良性胸腔积液组(P<0.001);恶性胸腔积液组血清CEA显著高于良性胸腔积液组(P<0.001),恶性胸腔积液组胸腔积液CEA浓度显著高于良性胸腔积液组(P<0.001)。ROC曲线分析得血清及胸腔积液CRKL临界值分别为2.04ng/mL、3.04ng/mL,其敏感度分别为80.9%、74.5%;特异性分别为80.4%、84.8%。联合检测血清及胸腔积液CRKL的灵敏度为80.9%,特异性为80.4%;联合检测胸腔积液CRKL及CEA的灵敏度为89.4%,特异性为95.7%;联合检测四者的灵敏度为87.2%,特异性为97.8%。结论血清和胸腔积液中CRKL可作为鉴定良恶性疾病的重要辅助指标;胸腔积液CRKL联合胸腔积液CEA检测可提高恶性胸腔积液的诊断价值。

对马铃薯类受体激酶CRK基因家族的鉴定及响应病原真菌信号的表达分析

富含半胱氨酸的类受体激酶(cysteine-rich receptor-like kinase,CRK)在植物生长发育和环境适应过程中发挥重要的作用。本研究鉴定了马铃薯CRK(StCRK)家族成员,并对其理化性状、进化特征、亚细胞定位、染色体位置和表达模式进行分析。鉴定获得8个StCRKs,其氨基酸序列大小为459~686 aa,分子量介于50.75~77.50 kD,等电点介于5.84~8.75,主要位于质膜。进化分析将来自马铃薯、拟南芥、香蕉、苹果、水稻、番茄和棉花的CRKs分为9个亚组,2号、3号和5号染色体上的StCRKs分布于亚组I(6个成员)和VI(2个成员);存在2个串联重复基因簇,包含4个成员。StCRKs启动子区域存在多种顺式调控元件,主要响应激素、低温、防卫和逆境等信号。接种晚疫病菌(Phytophthora infestans,Pi)和干腐病菌(Fusarium sulphureum,Fs)后,分别发现8个和6个StCRKs为差异表达。其中,StCRK4和StCRK8响应Pi和Fs信号,在接种以上2种病原菌后,表达量上调8倍以上,推测其响应多个真菌信号,可能在马铃薯对真菌病害的广谱抗性中起重要作用,可作为进一步抗病研究和功能分析的候选基因。

miR-126通过靶向调控Crk基因抑制非小细胞肺癌细胞增殖及侵袭

目的:探究miR-126通过靶向调控Crk基因来调控非小细胞肺癌(NSCLC)细胞增殖及侵袭。方法:应用实时定量PCR检测NSCLC组织及其癌旁肺组织中miR-126和Crk mRNA的表达。应用荧光素酶报告基因系统验证Crk是miR-126的靶基因。在NSCLC细胞转染miR-126 mimics或特异沉默Crk的siRNA后,用MTT法检测NSCLC细胞增殖能力,Transwell测定NSCLC细胞侵袭能力。结果:与癌旁肺组织相比,miR-126在肺癌组织中表达显著降低(P<0.05),Crk mRNA在肺癌组织中表达明显升高(P<0.05)。miR-126直接作用于Crk-3'UTR的预计靶位点;MTT细胞增殖实验及Transwell侵袭实验表明,miR-126过表达或Crk基因沉默均能减弱肺癌细胞增殖及侵袭能力(P<0.05)。结论:miR-126通过靶向调控Crk来抑制NSCLC细胞的增殖及侵袭。

接头蛋白Crk与肿瘤

Crk是一种重要的细胞内信号接头蛋白,含有SH2和SH3结构域,在信号传递过程中不仅承上启下,对信号强度还有着调控作用.迄今主要发现了4种Crk分子,即v-Crk、CrkⅠ、CrkⅡ和CrkL(Crk-Like).CrkⅡ和CrkL在分子结构上具有高度同源性,但对信号分子却具有不同的偏好性,从而体现出功能差异.本文就接头蛋白Crk的结构、Crk与相互作用蛋白质的作用机制以及与肿瘤的发生发展关系进行了阐述.

接头蛋白c-Crk单克隆抗体的制备和鉴定

目的制备接头蛋白c-Crk单克隆抗体。方法以c-Crk为抗原,免疫Balb/c小鼠,用杂交瘤技术建立稳定分泌抗c-CrkmcAb的杂交瘤细胞,用ELISA,western-blot等鉴定其生物活性。结果获得两株能稳定分泌c-CrkmcAb的杂交瘤细胞(3C7、3G11),亚类均为IgG1;腹水效价为1∶105;western-blot、免疫组织化学分析和ELISA检测证实两株mcAb均与c-Crk有较高的特异性。结论本实验成功制备了两株抗c-Crk特异性的mcAb,可用于c-Crk免疫检测方法的建立。

接头蛋白Crk Ⅰ在喉鳞癌中的表达及意义

目的:探讨接头蛋白Crk Ⅰ在喉鳞癌组织中的表达及意义;方法:采用免疫组化SP法,对54例喉鳞癌手术切除标本和22例癌旁正常组织进行检测,观察Crk Ⅰ在2种组织中的表达,分析Crk Ⅰ的表达与鳞癌临床分期、病理分级、肿瘤转移及生存时间的关系。结果:Crk Ⅰ在喉癌组织中主要表达于细胞质、细胞核可见少量表达、阳性率达64.8%,在癌旁正常组织中少量表达或无表达,2种组织中Crk Ⅰ表达阳性率比较,差异有统计学意义(χ~2=24.149,P<0.01);喉鳞癌组织中,有淋巴结转移者Crk Ⅰ蛋白阳性表达率为91.7%,与无淋巴结转移者的54.8%比较,差异有统计学意义(P<0.05);但Crk Ⅰ蛋白的阳性表达率在各年龄组、不同临床分期、病理分级及不同预后的喉鳞癌患者中比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:接头蛋白Crk Ⅰ可能在喉鳞癌细胞的发生、发展和转移中有重要意义。

CrkⅡ表达水平对喉癌细胞Hep-2增殖、迁移及侵袭的影响

目的探讨CrkⅡ表达水平对喉癌细胞Hep-2增殖、迁移及侵袭的影响。方法采用免疫组化法检测CrkⅡ在108例喉癌患者喉癌组织及癌旁正常组织中的表达情况,分析不同临床特征喉癌患者喉癌组织中CrkⅡ蛋白的阳性表达情况。构建并验证CrkⅡRNA干扰质粒,将培养后的Hep-2细胞分为空白对照组(未转染质粒)、阴性对照组(转染阴性对照质粒)和实验组(转染CrkⅡ干扰质粒),细胞转染后行实时聚合酶链反应(PCR)扩增。采用蛋白质印迹法(Western blot)检测转染后Hep-2细胞中CrkⅡ的表达水平,噻唑蓝(MTT)法检测细胞的增殖情况,Transwell实验检测细胞的侵袭和迁移能力,细胞划痕实验检测细胞的迁移情况。结果喉癌组织中CrkⅡ蛋白的阳性表达率明显高于癌旁正常组织(P﹤0.01)。临床分期为Ⅲ~Ⅳ期、组织分化程度为中低分化、有淋巴结转移喉癌患者喉癌组织中CrkⅡ蛋白的阳性表达率均高于临床分期为Ⅰ~Ⅱ期、组织分化程度为高分化、无淋巴结转移的喉癌患者(P﹤0.05)。实验组喉癌细胞Hep-2中CrkⅡmRNA和蛋白的相对表达量均低于阴性对照组、空白对照组(P﹤0.05)。实验组穿过基质膜至下室的细胞数目低于阴性对照组和空白对照组(P﹤0.05)。转染48 h时,实验组细胞的迁移率低于阴性对照组、空白对照组(P﹤0.05)。细胞培养24、48、72 h时,实验组Hep-2细胞的光密度(OD)值均低于空白对照组和阴性对照组(P﹤0.05)。结论喉癌细胞Hep-2中CrkⅡ的表达下调可降低细胞的增殖、迁移和侵袭能力,CrkⅡ有可能成为喉癌临床治疗的新靶点。