(Dig)-DNA探针检测恶性疟病人的研究

采用异羟基洋地黄毒苷配基(Digoxigenin,(Dig)-11-dUTP),以随机引物法标记含有恶性疟原虫(P.f.)DNA的重组质粒片段(酶切克隆pPF14),制成pPF14-F-Dig探针。用此探针,以斑点杂交试验检测提纯的P.f.DNA及海南地区疟疾病人。结果显示,pPF14-F-Dig探针至少可检出40pg的P.f.DNA和低至0.005％原虫血症。38例P.f.病人中,检出阳性33例。3例恶性疟原虫和间日疟原虫混合感染者中,2例阳性。4例间日疟病人中,阴性3例,可疑1例。21例正常人血皆为阴性。

应用(Dig)-DNA探针进行恶性疟流行病学调查

重组的恶性疟原虫DNA片段用洋地黄毒苷配基标记后作为探针(pPF_(14)-F-Dig),以斑点杂交试验对海南省恶性疟流行区人群的274份血样进行检测,并同时作厚薄血片镜检。结果显示,274例样本中血片镜检阳性1例,带虫率为0.36%;pPF_(14)-F-Dig 探针检出阳性15例(其中1例为镜检阳性者),阳性率为5.47%;pPF_(14)-F-Dig 与镜检的阳性符合率为1/1,阴性符合率为94.87%。每张硝酸纤维素膜可查96份样本,故该探针具有用于大规模流行病学调查的价值。

Use of (Dig)-DNA Probe for the Epidemiological Survey of Plasmodium falciparum Malaria

The Plasmodtum falctparum DNA fragment was isolated from a cloned recombinant plasmid pPF14. labelled with Digoxigenin (Dig) and used as a probe (pPF14-F-Dig)to detect 274 blood samples from the eqdemic area population in Hainan Province by dot hybridization.The results showed that out of 274 blood specimens one was positive when using microscopic examination and the positivity rate was 0.36 percent. Fifteen samples showed to be positive (including one positive specimen examined by microscopy) when this probe was applied to detect the 274 samples and its positivity rate was 5.47 percent.The positive coincidence rate between pPF14-F-Dig and microscopic examination was 1/1 and the negative coincidence rate was 94.87 percent. Since a piece of nitrocellulose membrane with the size of 9 by 12 square centimetres can accommodate blots of 96 samples,this probe is fit for large-scale epidemiological surveys.

DIG标记罗非鱼DNA指纹图谱研究

运用 Hae / 33.6、Hae / 33.15、Hinf / 33.6、Hinf / 33.154种限制酶 /探针组合对奥利亚罗非鱼、美国尼罗罗非鱼、沙市尼罗罗非鱼三种群体罗非鱼进行非放射性 DNA指纹图谱研究 ,结果表明在三种罗非鱼群体中 4种限制酶 /探针组合都能产生具有种属特异性和个体特异性的 DNA指纹图谱 .Hae / 33.6、Hae / 33.15组合中奥利亚罗非鱼特有的强阳性杂交图带可作为鉴别奥利亚罗非鱼的分子遗传标记 .4种限制酶 /探针组合在奥利亚罗非鱼、沙市尼罗罗非鱼、美国尼罗罗非鱼检出的个体平均图带数分别为 8.72 6、8.0 86和 6 .975.4种限制酶 /探针组合在奥利亚罗非鱼、沙市尼罗罗非鱼、美国尼罗罗非鱼检出的多态性位点比例分别为 6 2 .95%、96 .31%和85.2 6 % .

PCR-DIG探针斑点杂交法快速检测SRY基因

以正常男性ＤＮＡ作为模板，用本文设计的ＳＲＹ基因的１对引物组合进行ＰＣＲ法制备ＤＩＧ探针，然后通过低熔点琼脂糖电泳回收将扩增产物纯化，得到ＳＲＹ基因探针。与其他制备探针的方法相比，此方法制得的探针产量和标记效率都很高，标记灵敏度达００１ｐｇ，片段长度均一，为２９０ｂｐ。在ＤＮＡ斑点杂交检测ＳＲＹ基因时显示了很好的特异性，显示这种方法可以同时对大量性反转病例进行临床检测。

应用Digoxigenin标记探针定量检测血清HBV DNA

本文报道采用非同位素Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ标记探针定量检测血清ＨＢＶＤＮＡ。显色膜经空气干燥、液体石蜡透明处理后，即可置酶联免疫检测仪上测定各斑点的光密度（ＯＤ）值，波长６３０ｎｍ。结果发现已知含量的ＨＢＶＤＮＡ在２－５００ｐｇ／样点范围内与其相应的ＯＤ值有着良好的线性关系（ｒ＝０．９７０ｙ＝０．００１２ｘ＋０．１０５６）。标本测得ＯＤ值后，便可知其含量。该法重复性试验结果良好，１１份ＨＢＶＤＮＡ阳性的血清经定量测定，其ＨＢＶＤＮＡ含量在２０－１０５ｐｇ／４０μｌ之间。定量检测血清ＨＢＶＤＮＡ不仅可用来评价乙肝治疗的效果，而且也可用于了解血清传染性的强弱。

地高辛标记探针检测重组人肿瘤坏死因子α衍生物中残余DNA

本文用地高辛标记工程菌ＤＮＡ片段作探针，通过分子杂交和免疫显色检测ｒ－ｈＴＮＦαＤ半成品和制剂中的残余ＤＮＡ。该法对半成品和制剂分别采用蛋白酶Ｋ膜后处理和酚与氯仿抽提方法，消除了蛋白质或甘露醇对ＤＮＡ测定的干扰。本法特异、准确，灵敏度达１ｐｇ／点。用此法测定３批ｒ－ｈＴＮＦαＤ半成品和制剂（ｎ＝５），其残余ＤＮＡ均小于１００ｐｇ／剂量且重复性较好。

用地高辛标记探针检测基因工程人β干扰素制品中的外源DNA

基因工程人β干扰素工程菌经发酵培养、纯化后获得纯的制品，采用斑点杂交技术，用非放射性地高辛标记超声裂解的全工程菌ＤＮＡ作为探针，检测基因工程人β干扰素纯品，结果显示：基因工程人β干扰素纯品中的外源ＤＮＡ含量小于１００ｐｇ／剂。

人肾素转基因小鼠的建立

为研究人肾素基因在体内的功能和建立其药物干预实验的动物模型 ,采用显微注射法 ,将纯化的人肾素基因导入小鼠受精卵 ,再培育成转基因小鼠 .通过DIGDNA印迹和PCR分析 ,进行转基因整合检测 .在出生的 13只子代鼠中 ,得到一只转基因阳性鼠 .整合率为 7 7% ,有效率 0 3% ,转基因已稳定传代 .RT PCR显示转基因阳性鼠的肾、心和肺组织中有肾素基因表达 ,而在肝脏与骨骼肌中则未检测到 .阳性鼠血浆肾素活性较对照鼠明显升高 ,而肾与心脏组织的肾素活性则无明显变化 .

马立克氏病病毒（MDV）B抗原基因的克隆及鉴定

将ＭＤＶＧＡ株ＢａｍＨＩ基因文库中含Ｉ３片段的质粒ｐＡＣＹＣ１８４和Ｋ３片段的质粒ｐＨＣ７９扩增。用碱裂解法抽提质粒后，利用相应的限制性内切酶切出目的基因片段，连接到合适的载体上，构建了完整的ＭＤＶＢ抗原基因克隆载体。通过内切酶分析、地高辛（ＤＩＧ）—探针原位杂交、ＤＮＡ序列测定，确认克隆的Ｂ抗原基因正确。

HBsAg无症状携带者血清HBV DNA与Pre S_2关系初探

应用Dig-HBV DNA探针点杂交检测96例HBsAg无症状携带者血清HBV DNA,同时检测其HBsAg、抗HBs、HBeAg、抗HBe、抗HBc及Pre S_2。结果表明,HBV DNA与HBeAg及Pre S_2有着极为密切的平行关系。Pre S_2与HBV DNA阳性强度基本符合,Pre S_2可作为HBV复制的敏感指标。HBVDNA与抗HBc无直接关系,说明抗HBc仅能作为HBV感染的一项指标。抗HBe阳性,患者传染性低,但不排除其具有传染性的可能。

地高辛标记探针与生物素标记探针用于斑点杂交检测HBV DNA的初步研究

为研究地高辛标记和生物素标记核酸探针斑点杂交检测HBVDNA的敏感性、特异性和稳定性，用两种探针和(32)P标记探针进行平行检测对照．结果表明，地高辛探针检测灵敏度为0．1Pg，已达到(32)P中标记探针水平。生物素探针为1～10Pg。两种探针与32P标记探针相比。符合率分别96．65％和89．13％；敏感性分别为94．44％和83．33％；特异性分别为96．43％和92．86％。两种探针在－20℃存放6月后检测结果前后一致。研究结果表明，地高辛标记探针和生物素标记探针斑点杂交检测HBV．DNA都具有较高的敏感性、特异性和稳定性，其中以地高辛标记探针更优。

孕妇血清中HBV－DNA与乙型肝炎疫苗阻断母婴传播HBV的效果

血清ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ双阳性母亲的新生儿分别于出生时、１月龄、６月龄各接种１剂２０μｇ乙型肝炎（乙肝）疫苗后随访２ａ。随机抽取母婴乙肝病毒（ＨＢＶ）传播阻断成功的６４例、失败的２９例。用斑点杂交测定孕妇临产时血清ＨＢＶ－ＤＮＡ水平。结果表明疫苗阻断母婴传播成功组孕妇血清ＨＢＶ－ＤＮＡ水平明显低于失败组提示孕妇血清ＨＢＶ－ＤＮＡ水平高可能是疫苗阻断母婴传播失败原因之一。

DNA探针的PCR标记法

采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）对幽门螺杆菌染色体ＤＮＡ片段进行地高辛配基标记制备探针，与经典的随机引物标记法相比较，ＰＣＲ标记法能使探针产量明显提高，而且快速、经济，值得进一步应用和探讨。

地高辛标记DNA探针应用于凝胶转移电泳

半抗原DIG-ddUTP与DNA连接,以此作为探针可以与其相识别的蛋白质相结合,再用带有碱性磷酸的抗体处理,形成的复合物可作用于底物CSPD,使其产生萤光,而被x光片记录下来。

中西医结合治疗乙型慢性活动性肝炎的疗效观察

对４１例乙型慢性活动性肝炎（ＣＡＨ）患者随机分为二组，一组（简称治疗组）（２１例）口服活血化瘀中药，同时静脉滴注强力宁注射液８０～１００ｍｌ／天，疗程３个月；另一组（简称对照组）（２０例）为常规用一般护肝药，疗程３个月。结果中西医结合治疗组降ＧＰＴ有效率为８６％，对照组为７４％ ；中西医结合组ＨＢｅＡｇ阴转率为５５％，抗ＨＢｅ阳转率为３７．５％，对照组分别为１６．６％、８．３％（Ｐ＜０．０５）。结果提示，中西医结合治疗ＣＡＨ效果较好。

探针检测鸭黄病毒的地高辛标记DNA的制备与应用

利用RT-PCR方法扩增鸭黄病毒的NS3基因406bp的特异性片段,回收并纯化PCR产物,用地高辛标记,制备核酸探针。特异性试验结果表明,该探针仅与鸭黄病毒的核酸特异性杂交,而与鸭瘟病毒、H9N2禽流感病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、减蛋综合征病毒的核酸杂交均为阴性。敏感性试验表明,该探针对鸭黄病毒的RNA最低检出限量为100μg/L。对疑似黄病毒感染鸭的肝脏、肺脏、脾脏、输卵管、卵泡膜和泄殖腔棉拭子进行检测,以卵泡膜的检出率最高。该研究为鸭黄病毒感染的诊断和流行病学调查提供了一种可靠的方法。

DNA探针法检测水牛乳及其制品中大肠杆菌O157:H7的研究

以大肠杆菌O157:H7的志贺氏氏毒素Stx I基因保守序列设计特异性引物,并进行PCR扩增,采用地高辛标记扩增的DNA片段以制备探针。用DNA探针对纯菌种大肠杆菌O157:H7和对照组菌株进行斑点杂交检测,结果表明:大肠杆菌O157:H7的Stx I基因探针对纯菌种大肠杆菌O157:H7DNA产生较强的阳性反应,而与福氏志贺氏氏菌、枯草芽孢杆菌、单增李斯特氏菌、大肠埃希氏菌和伤寒沙门氏菌DNA等均无反应,表明该Stx I的DNA探针特异性较强。用该探针对人工污染水牛乳进行检测,成功检出大肠杆菌O157:H7,最低检出限为8.58×102 cfu/m L,可应用于水牛乳中大肠杆菌O157:H7的快速检测。

DNA标记杂交技术筛选抗HBs-IFN-α融合蛋白表达载体

为在无抗药性改变 ,转化细胞无生物指示系统改变的克隆载体中扩大筛选范围 ,提高筛选阳性率 ,本文应用地高辛标记DNA检测系统筛选人源单抗片段与干扰素融合蛋白表达质粒 (Anti HBs IFN α ) ,取得了理想的效果。纯化制备载体的插入段DNA ,用地高辛标记系统进行化学标记 ,制成标记探针。挑取单克隆菌扩增 ,以溶菌酶加煮沸法批量制备载体DNA ,点样于硝酸纤维膜上并经 80℃烤 2h ,分别用预杂交液和标记探针进行 42℃ 2h、 42℃ 6h的膜预杂交和杂交反应 ,洗膜后用酶标抗地高辛抗体显色。未带插入片段的抗体表达载体为阴性对照 ,IFN α质粒DNA作阳性对照 ,在 40株转化细胞中筛选出 7个目的克隆。为进一步核实该法的筛选效率和可靠性 ,分别用单酶切和双酶切法对筛选出的阳性载体进行鉴定 ,琼脂糖电泳结果显示 ,两者的符合率为 10 0 %。该系统筛选结果可靠 ,尤其在克隆载体转化细胞后无抗药改变 。