LPCAT1在FAB-M2亚型成人急性髓系白血病患者中的预后意义

目的:研究溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶1(LPCAT1)在急性髓系白血病(AML)中的预后价值。方法:使用基于Taq Man的逆转录-实时荧光定量聚合酶链反应检测214例初治成人AML患者和24例健康对照者LPCAT1的相对表达量。使用Kaplan-Meier方法进行生存分析,Cox比例风险回归模型用于确定预后因素。结果:LPCAT1在成人AML中的表达水平为34.37%(1.83%-392.63%),显著低于健康对照者的92.81%(2.60%-325.84%)(P<0.001)。本研究在具有完整临床信息和预后数据的171例非急性早幼粒细胞白血病患者中评估了LPCAT1的预后意义。生存分析结果表明,LPCAT1的表达水平对整个队列的预后没有显著影响。然而,在FAB-M2亚型(M2-AML)的AML患者中,低表达LPCAT1患者的2年无复发生存率为35.4%(95%CI:0.107-0.601),显著低于高表达LPCAT1患者的79.2%(95%CI:0.627-0.957)(P=0.012)。多因素分析结果表明,低表达LPCAT1是M2-AML患者无复发生存率的独立危险因素(HR=0.355,95%CI:0.126-0.966,P=0.049)。结论:LPCAT1在成人AML患者中低表达,LPCAT1低表达是M2-AML患者无复发生存率的独立危险因素。

犬冠状病毒S1蛋白特异性小分子抗体Fab的制备

为表达犬冠状病毒(canine coronavirus,CCV)S1蛋白,制备其特异性小分子抗体Fab,为CCV的防治提供新材料。采用PCR扩增CCV S 1基因全长及其截短片段,分别克隆到原核表达载体pET28a或pGEX4T-1中,转到BL21(DE3)或Rosetta(DE3)感受态细胞构建重组表达菌株;用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导目的蛋白表达,通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blot鉴定分析重组蛋白;纯化蛋白分别与ISA71AVG或ISA201VG佐剂配伍乳化后制备免疫原,免疫蛋鸡,用聚乙二醇(PEG)沉淀法提取得到CCV S1蛋白的卵黄抗体,通过Western blot检测抗体滴度,用胃蛋白酶水解卵黄抗体制备小分子抗体Fab。结果显示,S1蛋白全长无表达,CCV S1-a和CCV S1-b分子量分别为79 ku和68 ku。在免疫后第35天2种佐剂组的卵黄抗体滴度可达1∶128000。制备小分子抗体Fab最佳酶切条件为卵黄抗体与胃蛋白酶混合质量比20∶1、pH值4.1、37℃酶切8 h。完整的IgY可以与CCV呈特异性反应,胃蛋白酶处理后制备的小分子抗体Fab可以有效阻断CCV的感染性。综上,本研究成功表达了CCV S1的2个截短片段蛋白,制备了卵黄抗体及其小分子抗体Fab,为进一步开展犬冠状病毒病的诊断和防治技术研究奠定了基础。

Fab Lab创新模式及其启示

信息技术融合与发展为科技创新模式嬗变提供了新机遇。本文讨论了Fab Lab创新模式的发展背景及典型案例,并重点分析了其对我国以用户创新为中心的应用创新实践的理论及现实意义,以期引发研究与实践领域围绕用户参与的创新2.0模式发展的深入思考。

人源性抗HBsAg抗体Fab段在酵母中的表达

通过分步整合的方式 ,将人源性抗乙肝表面抗原 (HBsAg)抗体Fab的轻、重链基因分步整合到巴斯德毕赤(Pichiapastoris)酵母GS115菌株的染色体上 ,经甲醇诱导 ,成功地分泌表达出抗HBsAg抗体的Fab片段 ,表达量达5 0～ 80mg L。ELISA结果显示重组酵母分泌表达出的Fab具有较强的结合HBsAg的能力。通过抗Fab的抗体柱亲和层析 。

抗HBsAg抗体Fab段在大肠肝菌中的高效表达与复性

将抗ＨＢｓＡｇ 抗体的轻链（Ｌ）和重链Ｆｄ 段基因，分别克隆于ｐＥＴ２０ｂ 质粒中并分别转化到大肠肝菌ＢＬ２１（ＤＥ３），ＬＰＴＧ诱导后，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析发现在２７ＫＤ（Ｌ）和２５ＫＤ（Ｆｄ）处有外源蛋白表达，表达蛋白含量分别为５３％ 和４８％ 。Ｌ链和Ｆｄ 包涵体蛋白经盐酸胍变性后，等量混合于折叠液中，Ｌ和Ｆｄ 可复性形成了约５０ＫＤ的蛋白。ＥＬＩＳＡ结果表明，复性蛋白具有与ＨＢｓＡｇ 结合的能力。抗ＨＢｓＡｇ 抗体Ｆａｂ 段在大肠杆菌中的表达与复性的成功，表明包涵体表达基因工程抗体在技术是可行的。

抗轮状病毒IgY和Fab’的分离与纯化

抗轮状病毒IgY可用两步盐析结合凝胶过滤从蛋黄中分离出来,用SDS-PAGE检测其纯度可达到95%以上。纯的IgY经胃蛋白酶分解得到的抗体片断(Fab),经SDS-PAGE和MALDI质谱法测定,其纯度达到99%以上。结果表明,所设计的分离抗轮状病毒IgY和Fab的方法简单、有效。经ELISA法检测,Fab的活性仍保持在IgY原始活性的70%以上。

397例急性白血病细胞遗传学与FAB分型相关性研究

本研究探讨急性白血病的细胞遗传学改变,了解染色体核型异常与急性白血病FAB分型的关系及其对预后因素的影响。397例急性白血病患者于治疗前抽取骨髓标本,采用短期细胞培养法制备染色体标本,应用G显带技术进行染色体核型分析。结果显示,397例急性白血病中78例无分裂相,319例可供染色体核型分析的患者中染色体核型异常175例(占54.9%)。在急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓系白血病(AML)和急性混合细胞白血病(AMLL)3种类型的白血病患者中,染色体核型异常分别为33/120例(占27.5%)、129/252例(占51.2%)和13/25例(占52.0%)。超二倍体41例(占23.4%),亚二倍体22例(占12.5%),正常二倍体112例(占64.0%)。AML染色体核型异常中与FAB分型相关的特异性染色体重排74/129例(占57.4%)。结论:大约55%左右的急性白血病存在克隆性染色体异常,一些特异性染色体异常改变是急性白血病的细胞遗传学特征,与急性白血病的FAB分型有明显相关性,染色体检查和分子遗传学方法相结合,对于白血病的诊断、分型、治疗和预后都具有重要意义。

人源中和性抗汉滩病毒单克隆抗体Fab段基因的获得和表达

运用噬菌体表面表达（Ｐｈａｇｅｄｉｓｐｌａｙ）技术，获得人源中和性抗汉滩病毒汉滩型Ｇ１基因工程单克隆抗体（单抗）Ｆａｂ段基因及其表达，并同时获得抗汉滩病毒核蛋白（ＮＰ）的Ｆａｂ抗体。从肾综合征出血热疫区恢复期病人抗凝血中分离到的外周淋巴细胞中，提取了总细胞ＲＮＡ。通过ＲＴ－ＰＣＲ方法，用一组人ＩｇＧＦａｂ基因特异性引物，从合成的ｃＤＮＡ中经ＰＣＲ扩增了一组轻链和重链Ｆａｂ段基因，将轻链和重链先后插入噬菌体载体ｐＣｏｍｂ３，成功地建立了抗汉滩病毒抗体基因库，并用纯化的汉滩病毒颗粒及抗汉滩病毒糖蛋白鼠单抗捕捉糖蛋白抗体原的方法，对此抗体库进行了富集筛选，在短期内成功地获得了抗汉滩病毒核蛋白和糖蛋白Ｇ１的人源单抗Ｆａｂ段基因，并在大肠杆菌中获得有效表达。核苷酸序列分析证实，所获得的基因为人源ＩｇＧＦａｂ基因。用特异性放射免疫沉淀（ＩＰ）、ＩＦＡＴ和ＥＬＩＳＡ以及空斑减少中和试验鉴定表明，表达的人Ｆａｂ抗体能识别汉滩病毒结构蛋白，其中抗Ｇ１人Ｆａｂ抗体具有体外中和活性。人源抗汉滩病毒基因工程抗体的获得，为今后可能的临床应用提供了良好前景。

人源噬菌体Fab抗体库构建过程中引物的优化和初步鉴定

目的 优化设计一套引物 ,扩增全套人抗体Fd片段和L链基因 ,改善扩增效率 ,益于人源噬菌体抗体库的构建。方法 根据V BASE数据库提供的人抗体可变区胚系基因 ,在其家族分类基础上 ,根据FR1区 5’端保守序列重新分组 ,设计特异性的 5’端扩增引物。同时对设计引物的匹配情况进行分析 ,并应用PCR扩增和测序反应对其扩增效果进行鉴定。结果 Fd链 5’端扩增引物有 5条 ,κ轻链有 6条 5’端扩增引物 ,而λ轻链 5’和 3’扩增引物有 10条。分析表明 ,人抗体可变区胚系基因与 5’引物有较好的匹配率 ,数目较少 ,匹配率较高。PCR结果显示 ,全部的重链及轻链引物对均能高效扩增出特异性较高的目的片段。测序结果表明PCR扩增产物具有较好的亚类和可变区家族分布。结论 优化了一套扩增全套人抗体Fd片段和L基因的引物 。

抗乙型肝炎表面抗原Fab片段联合抗细胞核单抗为载体的肝癌放射免疫治疗实验研究

目的探讨核素标记人源化抗(乙型肝炎)乙肝表面抗原Fab片段(抗HBsAgFab)联合核素标记抗细胞核单克隆抗体(chTNT)瘤内注射治疗荷人肝癌移植瘤裸鼠的可行性和优越性,为临床应用核素标记多种不同性质的单克隆抗体进行放射免疫治疗肝癌提供实验依据。方法荷瘤裸鼠分为五组,分别瘤内注射131I-抗HBsAgFab、131I-chTNT、131I-抗HBsAgFab联合131I-chTNT、131I-无关抗体(131I-IgG)及PBS。治疗后行SPECT显像观察标记抗体在肿瘤内的浓聚,并测量肿瘤大小变化,计算肿瘤抑制率。结果研究发现2种标记抗体联合应用组的肿瘤抑制率为73.09%,明显高于131I-抗HBsAgFab组的47.8%和131I-chTNT组的54.26%。联合应用组标记抗体在肿瘤组织/非肿瘤组织内的放射活度比值(T/NT值)大于单独应用组。结论131I-抗HBsAgFab联合131I-chTNT瘤内注射放射免疫治疗可增加标记抗体在肿瘤组织内的浓聚,并能提高放射免疫治疗效果。

抗角蛋白Fab抗体在大肠杆菌中的表达与复性研究

目的 :用大肠杆菌分别表达抗角蛋白抗体的轻链和Fd片段 ,体外复性得到Fab抗体。方法 :从已构建的质粒p3MH/Fab中 ,亚克隆抗角蛋白抗体的轻链和Fd片段基因 ,并分别插入载体pET32a中 ,构建重组质粒。以重组质粒分别转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,在IPTG诱导下进行表达。SDS PAGE分析发现 ,在相对分子量 (Mr)为 2 5 0 0 0处有外源蛋白表达。轻链和Fd片段变性后等量混合于折叠液中 ,复性后形成Mr 约为4 5 0 0 0的蛋白。结果 :成功地表达抗角蛋白抗体的轻链和Fd片段 ,ELISA和Westernblot证实 ,复性产物具有与角蛋白结合的能力。结论 :获得了具有活性的抗角蛋白的Fab抗体 ,为其应用研究打下了基础 ,也表明包涵体表达基因工程抗体技术是可行的。

IgG Fab-BPI融合蛋白真核表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达

目的构建抗抗LPSFab-BPI真核表达载体,并在CHO细胞中表达。方法通过RT-PCR,获得广谱抗LPSmAbC3A2IgG的Fd和完整轻链LCcDNA片段。在分别构建了pcDNA3-Fd和pcDNA3-LC表达载体的基础上,将包括BPIN端抗LPS活性中心的180bpDNA片段,通过一段长16个氨基酸的linker连接于上述Fab表达载体中Fd基因的下游,构建成Fab-BPI融合蛋白FB真核表达载体。将pcDNA3-LC质粒中包括hCMV启动子、LC和BGHpolyA等序列在内的片段,插入到pcDNA3-Fd中hCMV启动子上游,从而构建成单质粒的Fab-BPI表达载体pcD-NA3-FB,转染真核细胞。结果序列测定表明,重组质粒构建正确。pcDNA3-FB转染CHO细胞后,经ELISA、免疫荧光和mR-NA鉴定表达成功,免疫印迹试验显示,与抗κ轻链和抗BPI抗体反应的蛋白区带的Mr均为60000左右。交叉反应试验证明,Fab和FB与多种革兰氏阴性菌的LPS有交叉反应性。结论成功地在CHO细胞中表达出了抗LPSFab-BPIFB融合蛋白。FB作为融合蛋白,集广泛交叉反应性和强大中和活性于一身,有可能成为更适于临床应用的新的抗LPS免疫制剂。

筛选Fab抗体库的细菌展示技术的建立

目的:利用NlpA蛋白的前六个氨基酸(CDQSSS)将抗体锚定在细菌内膜建立筛选Fabs抗体库的展示技术,为今后抗体的研发工作奠定基础。方法:从pNAD质粒中克隆出NlpAleader(含有CDQSSS序列)基因序列,利用相应的酶切位点将该序列插入pComb3表达载体中构建成用于展示Fab的重组质粒pBFD。将从pEAI质粒克隆得到的anti-human IL-1β抗体的重链Fab和全长轻链分别插入到NlpAleader和pelBleader(pComb3载体自带的果胶酶基因前导肽)的下游。将pBFD-Fab转入到E.coli DH5α中诱导表达,原生质球制备后,采用梯度浓度的抗原进行孵育,最后经流式细胞术(FCM)检测抗体展示情况并且分选阳性群体,利用质粒提取的方法来替代PCR方法拯救阳性基因,转化E.coli DH5α,利用FCM再次检测该群体展示的抗体与抗原结合情况。结果:所展示的anti-hIL-1β Fab抗体依次与抗原和FITC标记的抗原特异性抗体孵育后,用FCM实时检测,结果显示出很强的荧光信号并且表现出抗原浓度依赖性。拯救出的pBFD-Fab-原生质球的FCM检测结果与首次展示的FCM结果一致,该系统能够稳定的展示抗体。结论:经过该细菌展示系统展示的Fab抗体能够有效的折叠,与相应的抗原具有很好的特异性结合能力。成功改进该展示技术的基因拯救方法,避免了基因突变和链置换的发生。此外还证明了该展示技术具有很好的稳定性。本实验成功构建了筛选Fab抗体库的细菌展技术。

从人源性噬菌体抗体库分离出1株含有异常序列的抗HBsAg Fab克隆

曾从人源性噬菌体抗体库中筛选出１株抗人乙肝表面抗原（ＨＢｓＡｇ）的Ｆａｂ克隆，为了筛选出新的抗ＨＢｓＡｇＦａｂ段，采用抗原屏蔽法，用已得到的Ｆａｂ段封闭相应的抗原决定基，对该抗体库进行了再次筛选，得到了１株新的人抗ＨＢｓＡｇＦａｂ段克隆，经序列分析发现其轻链可变区基因来源于Ｖκ１亚群和Ｊκ４基因，重链可变区基因来源于ＶＨ１亚群和ＪＨ４基因，但在ＶＨ第７７位和第７８位氨基酸残基之间出现了７个多余的氨基酸残基，经对基因数据库检索未能查到该序列的来源，但显然这段序列未影响抗体的抗原结合活性。

新工科背景下应用型本科Fab Lab实验平台构建

近年来,随着物联网、人工智能、大数据等新兴技术的快速发展,有力地推动了社会的变革,引领了新的工业革命。在这样的背景下,建立适应应用型本科院校的Fab Lab实验平台可以看作很好的借鉴。从具体建设到创新生态系统的构成,Fab Lab实验平台可作为众创空间的一种形式,为创新型人才培养提供先进创客教育理念的实施场地,起到有效的人才培养作用。

抗CD20嵌合抗体片段Fab′突变体的表达和活性研究

利用PCR方法从抗CD2 0单链抗体 (ScFv)表达载体上扩增抗CD2 0抗体轻链可变区基因 (VL)、重链可变区基因 (VH) ,同时在抗体的可变区引入突变 ,然后将VH、VL 基因重组到Fab′表达载体pYZF1中 ,构建抗CD2 0嵌合抗体Fab′片段表达载体 ,并在大肠杆菌 16c9中进行高效可溶性分泌表达。经大量的筛选 ,获得一个产量和活性均有所提高的突变克隆。其突变位点在轻链可变区的CDR1区 ,即G77→A(Ser→Asn)。突变的抗体的表达量为每克干菌 3 8mg ,而未突变抗体的表达量为每克干菌 1.3mg。突变体的亲和力常数Ka为 2 .2× 10 9L mol,约为突变前的 2倍。竞争性免疫荧光抑制实验表明 ,突变的Fab′片段能竞争性抑制鼠源性抗CD2 0抗体HI4 7和CD2 0表达细胞Raji细胞的结合 ,使HI4 7的结合阳性率由 98%下降至 37.5 5 % 。

新型1,2,4-三唑并[3,4-b]-1,3,4-噻二唑类化合物的合成、抗菌活性及与FabⅠ作用的分子模拟

以3-芳基/烷基-4-氨基-5-巯基-1,2,4-三唑为原料,经过环化和糖化反应,设计合成了10个未见报道的化合物3-芳基/烷基-6-S-2',3',4',6'-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基-1,2,4-三唑并[3,4-b]-1,3,4-噻二唑(3a^3j),其结构经核磁共振波谱、高分辨质谱和红外光谱确认.生物活性测试表明,所有化合物均对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和白色念株菌表现出一定的抗菌活性,其中化合物3c对4种测试菌株的最小抑菌浓度(MIC)最低,且接近于氟康唑的参照数据,具有较强的抗菌活性.利用Auto Dock 4.0程序研究了目标化合物3a^3j与大肠杆菌FabⅠ受体蛋白分子的相互作用和结合自由能变化规律.

抗人肝癌单克隆抗体HAb18 Fab基因的克隆和表达

目的:克隆抗人肝癌单抗(mAb)HAb18的Fab基因,并在大肠杆菌中表达。方法:采用RT-PCR法,利用设计的引物扩增mAb Fd和K链全长基因,并分别克隆到T载体中进行序列分析。然后,亚克隆到原核表达载体pComb3中,转化感受态大肠杆菌后以IPTG诱导表达。采用ELISA和免疫荧光法检测表达产物的特异性。结果:克隆了mAb HAb18的Fah基因,并在大肠杆菌中获得表达。竞争性ELISA和免疫荧光检测证实,表达产物具有与相应抗原特异结合的活性。结论: 成功地构建了抗人肝癌小分子Fab抗体,为其进一步在肝癌诊断与治疗中的应用奠定了基础。

平阳霉素与单克隆抗体Fab′片段偶联物的抗肿瘤作用

目的 研制一种以单抗Fab′片段为基础的抗肿瘤导向药物。方法 制备单抗 3A5Fab′片段及其与平阳霉素 (PYM )偶联物Fab′ PYM后 ,测定Fab′ PYM与肿瘤细胞的免疫反应性、偶联物中PYM的抑菌活性、对肿瘤细胞的杀伤作用和体内抑瘤作用。结果 Fab′及Fab′ PYM保持了与靶细胞C2 6的免疫反应性 ;偶联物中PYM的抑菌活性为游离PYM的 15 % ;Fab′ PYM对C2 6细胞的杀伤作用强于PYM ;对非靶细胞KB的杀伤作用与PYM相似 ;ip和iv给药 ,Fab′ PYM对小鼠皮下接种的肠癌 2 6生长抑制作用均强于 3A5 PYM和PYM。结论 Fab′ PYM具有比PYM及 3A5

亲和层析纯化重组人源性抗HBsAg Fab抗体

目的 :纯化酵母发酵产生的重组人源性抗HBsAgFab抗体 ,建立稳定、适于生产应用的纯化工艺。方法 :以原核表达的重组人源性抗HBsscFv免疫BALB/c小鼠 ,经杂交瘤技术制备大量分泌mAb的杂交瘤细胞株 14F7。将该细胞株注入小鼠腹腔制备mAb腹水 ,经辛酸沉淀纯化后 ,制备亲和层析柱 ,纯化酵母发酵产生的重组人源性抗HBsAgFab抗体。结果 :用抗scFvmAb亲和层析柱纯化的重组人源性抗HBsAgFab的纯度可达 95 %以上 ,回收率可达 70 %～ 85 %。结论 :人源性抗HBsscFv制备mAb作为亲和层析的介质 ,可有效地从酵母发酵上清中纯化重组人源性抗HBsAgFab,适用于大规模生产重组人源性抗HBsAgFab。