GDNF对局灶性脑缺血大鼠SVZ和SGZ细胞增殖及学习记忆的影响

目的 观察胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)对局灶性脑缺血再灌注大鼠SVZ和SGZ细胞增殖的影响。方法 大脑中动脉线栓法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,立体定位下侧脑室注射GDNF,应用5 -溴脱氧尿核苷(Brd U )标记分裂细胞,观察模型组、GDNF组大鼠SVZ和SGZ神经干细胞的增殖,同时应用Y迷宫监测大鼠学习记忆能力。结果 局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠GDNF组神经干细胞增殖明显增加,Brd U免疫阳性细胞数与相应对照组比较,差异有显著性意义(P<0 .0 5 )。GDNF组大鼠学习和记忆能力与相应对照组比较,差异有显著性(P<0 .0 5 )。结论 GDNF可增强局灶性脑缺血SVZ和SGZ细胞增殖能力,外源性GDNF可加速中枢神经损伤的修复。

电针大肠俞募穴对功能性便秘小鼠结肠组织GDNF表达的影响

目的探讨电针大肠俞募穴治疗功能性便秘的作用机制。方法 32只小鼠随机分为对照组、模型组、针刺组和EGC抑制组。采用复方地芬诺酯灌胃造模法,电针刺激天枢、大肠俞,每次30min,共治疗5次。运用光镜、电镜、免疫组化及原位杂交技术,观察电针治疗前后结肠组织上皮细胞形态学改变,结肠组织中GDNF蛋白及mRNA表达水平。结果与对照组比较,模型组结肠组织GDNF蛋白及mRNA表达水平显著降低(P<0.01)。电针刺激大肠俞募穴可提高结肠中GDNF蛋白及其mRNA的表达水平(P<0.05),光镜和电镜发现针刺可修复受损上皮细胞,进而改善肠道传输功能。EGC抑制组结肠中GDNF蛋白表达与模型组比较无显著性差异(P>0.05),与针刺组比较显著降低(P<0.05),GDNF mRNA的表达水平高于模型组(P<0.05),低于针刺组,但差异无统计学意义(P>0.05)。光镜和电镜下EGC抑制组结肠组织形态改变较为严重。结论电针刺激大肠俞募穴可提高EGC细胞中GDNF蛋白及其mRNA的表达水平,修复受损结肠上皮细胞,进而改善肠道传输功能。

FSH对仔猪睾丸支持细胞增殖和GDNF表达的调节

以原代培养的仔猪睾丸支持细胞(SC)为试验模型,研究了FSH对SC胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)表达及其增殖的影响。结果显示,外源性添加FSH可促进GDNF蛋白表达,而且这种促进作用具有浓度和时间依赖关系,GDNF蛋白水平随着FSH浓度的增加而升高,当FSH浓度为50 ng/mL时,GDNF水平达到最高,然后逐渐降低;FSH(50 ng/mL)作用30 min,可显著促进GDNF蛋白的表达(P<0.05),当FSH作用1 h时,GDNF蛋白水平达到最高,随后逐渐降低。FSH可以时间-剂量依赖性促进SC增殖细胞核抗原(PCNA)的表达,FSH(50 ng/mL)作用30 min时,PCNA的表达显著增加(P<0.05),作用1 h达极显著水平(P<0.01),至2 h时,PCNA蛋白的表达水平达到最高,随后逐渐降低。提示,FSH可在体外条件下通过刺激SC表达GDNF进而促进其增殖。

GDNF及其受体Ret在腺样囊性癌嗜神经侵袭和细胞增殖中作用的初步研究

目的:探讨胶质细胞源性神经生长因子GDNF及其受体Ret的表达在涎腺腺样囊性癌(SACC)嗜神经侵袭和细胞增殖中的作用。方法:应用S-P法对42例SACC、5例腺泡细胞癌、5例正常涎腺组织中GDNF和Ret的表达进行检测。结果:GDNF在SACC肿瘤细胞的胞浆、肿瘤周围的神经纤维和正常腺体的导管中呈阳性表达,而在腺泡细胞癌和正常腺泡组织中均不表达。Ret在SACC肿瘤细胞的胞浆和正常的导管上皮细胞中呈阳性表达,在神经纤维中弱阳性或不表达,腺泡细胞癌中不表达。Ki-67在SACC细胞的胞核中呈阳性表达,靠近神经和远离神经的肿瘤细胞中阳性表达并无差异。有神经侵袭组Ki-67的阳性表达高于无神经侵袭组,但无统计学差异。GDNF与Ret表达间呈正相关(r=0.489,P<0.05),但GDNF与Ki-67的表达间无明显相关性(r=0.278,P>0.05)。结论:GDNF及其受体Ret在SACC中高表达,GDNF在周围神经组织内也高表达,提示SACC中存在GDNF的自分泌,GDNF和Ret可能在SACC嗜神经侵袭中发挥重要作用。此外,SACC细胞的增殖活性与神经侵袭的发生、GDNF的表达间关系可能不大。

NGF/GDNF基因修饰神经干细胞移植对AD模型鼠行为学的疗效

目的 观察NGF GDNF基因修饰神经干细胞 (NSC)单独和联合移植对AD模型鼠的学习记忆改善作用。 方法 单侧切断SD大鼠穹窿海马伞 (FF)制备AD模型鼠。术后 8～ 10d ,侧脑室移植基因修饰及未修饰的NSC。移植后 2周 ,进行Morris水迷宫行为学检测。 结果 NGF组和NGF +GDNF组的后 3个时间段的平均逃避潜伏期较损伤组和NSC组明显缩短 (P <0 0 1) ;平台象限游泳距离百分比明显增高 (P <0 0 1) ;GDNF组的平台象限游泳距离百分比高于NSC组 (P <0 0 1) ,但平均逃避潜伏期与NSC组无明显差异。 结论 NGF GDNF基因修饰NSC单独和联合移植对AD模型鼠的行为学有不同程度的疗效 ,其中NGF组和NGF +GDNF组疗效较好 ,但后者并未优于前者 。

电针对鱼藤酮诱导的帕金森病模型大鼠黑质GDNF mRNA表达的影响

目的探讨电针对鱼藤酮诱导的帕金森病(PD)模型大鼠黑质GDNF mRNA表达的影响及作用机制。方法 40只大鼠按照随机分组的原则分为空白组、假手术组、模型组、电针组,每组10只。持续4 w给模型组和电针组大鼠颈背部皮下注射鱼藤酮(2 mg·kg-1·d-1)以诱导其黑质多巴胺能神经元丢失,电针组选取"风府"、"太冲"两穴,频率20 Hz,电压2～4 V,连续波,每日1次,每次20 min,7 d为1疗程,连续治疗3个疗程;其余各组不行针刺。采用半定量RT-PCR方法检测,观察黑质GDNF mRNA表达变化。结果长期低剂量颈背部皮下注射鱼藤酮可诱导大鼠出现行为学的改变;模型组大鼠黑质GDNF mRNA表达减少,与空白组、假手术组比较有显著差异(P<0.01);电针组大鼠黑质GDNF mRNA表达增加,与模型组比较有显著差异(P<0.01)。结论电针治疗不仅可以减轻鱼藤酮引起的大鼠行为学异常,而且可以促进PD模型大鼠黑质GDNF mRNA的表达,修复营养DA能神经元,延缓PD的发病进程。

针刺对实验性脑出血大鼠脑组织GDNF和nestin表达的影响

目的:探讨急性脑出血后胶质源性神经生长因子(GDNF)和巢蛋白(nestin)的动态表达及针刺的干预作用。方法:选取健康的雄性Wistar大鼠160只,随机分为模型组、模型加针刺组(针刺组)、模型加忆立福组(西药组)3组。每组又分为6h、24h、48h、72h和168h5个时相点,每个时相点有10只大鼠,空白对照组10只,其余制备脑出血大鼠模型,运用免疫组化等方法检测各组大鼠脑组织中GDNF和nestin阳性细胞的表达以及针刺治疗对它们的影响。结果:模型组6h出现GDNF阳性细胞表达增加,1天时达高峰,7天时仍有表达,针刺组与模型组、西药组相比有统计学意义(P<0.01);模型组6h出现nestin阳性表达增加,2天时达高峰,7天时仍有表达,针刺组与模型组、西药组相比较,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:针刺通过调控神经营养因子GDNF和神经干细胞nestin的表达,增加神经干细胞增殖分化能力,这可能是针刺"百会"透"曲鬓"改善脑出血大鼠神经功能缺损症状和大鼠脑组织超微结构,治疗急性脑出血神经重塑的机制之一。

GDNF在慢性应激和老化致小鼠行为与认知损伤中的作用

目的:探讨慢性应激对不同月龄小鼠空间学习记忆功能的影响,以及小鼠前脑皮层和海马胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)的作用。方法:采用多因素慢性应激动物模型,通过旷场试验和Morris水迷宫试验,检测不同月龄小鼠行为及空间学习记忆能力,并检测GDNF在小鼠脑海马和前脑皮层的表达。结果:与青年(2月龄)小鼠比较,老年(15月龄)小鼠的自发活动和探究行为明显减少,空间学习记忆能力明显降低(P<0.05,P<0.01),且海马CA3区、齿状回和前脑皮层GDNF表达明显下降(P<0.05,P<0.01);在慢性应激后,与对照组比较,青年和老年应激组小鼠的自发活动和探究行为显著减少,空间学习记忆能力显著降低(P<0.05,P<0.01),且小鼠前脑皮层和海马GDNF表达显著下降(P<0.05,P<0.01),老年应激小鼠变化更加显著。结论:脑的老化和慢性应激导致小鼠行为及空间学习记忆功能改变,可能与海马和前脑皮层神经元GDNF表达的变化密切相关。

GDNF转基因成纤维细胞脑内移植治疗帕金森病大鼠模型

为了观察表达胶质细胞系源性神经营养因子 (GDNF)的基因工程细胞在脑内移植后对帕金森病大鼠的治疗作用 ,将 6-羟基多巴胺脑内定位单侧 (损伤侧 )注射制备大鼠帕金森病模型。随机将动物分为实验组 (2 0只 )和对照组 (15只 ) ,分别植入GDNF和 Lac Z转基因的原代培养大鼠成纤维细胞于损伤侧纹状体内 ,动态观察动物单侧旋转行为以及多巴胺及其代谢产物 3 ,4-二羟苯乙酸和高香草酸含量的变化。结果表明 :实验组帕金森病大鼠单侧旋转行为明显减少 ,为移植前旋转圈数的 (64 .8± 5 .8) % (P<0 .0 5 ) ;其纹状体内多巴胺含量显著提高 ,恢复至移植前水平的 (14 .5± 2 .2 ) % (P<0 .0 5 ) ,而对照组仅为 (1.92± 0 .15 ) % ;转基因细胞在脑内可存活 1年以上。本研究结果提示 GDNF基因治疗对大鼠帕金森病具有潜在的临床应用价值。

周围神经损伤后外源性GDNF对神经元的保护作用

采用硅管套接大鼠切断的坐骨神经模型 ,局部给予胶质细胞源性神经营养因子 (GDNF) ,应用尼氏染色、酶组织化学染色方法 ,观察到外源性GDNF能减少脊髓修复侧前角运动神经元死亡的数目 ,降低脊髓前角运动神经元及脊神经节感觉神经元中胆碱酯酶 (CHE)及酸性磷酸酶 (ACP)变化的幅度。这表明外源性GDNF能保护周围神经切断后引起的神经元损伤。

以GDNF为核心的哺乳动物精原干细胞调控网络

睾丸中的胶质细胞源神经营养因子由支持细胞、管周细胞、精母细胞和球形精子合成和分泌,是调节精原干细胞自我更新和分化的关键因子;GDNF通过与SSCs膜上受体GFRα1结合形成GDNF-GFRα1复合物,再结合并活化RET,最后激活MAPK、SFK和PI3K-AKT信号通路并达到调控SSCs自我更新和分化的目的。

重组大鼠质粒pEGFP-GDNF的构建及真核细胞转染

目的 构建携带大鼠胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因的真核细胞表达载体,为应用GDNF进行如帕金森综合征之类的神经元退化性疾病的基因治疗打基础。方法 采用RT- PCR方法从大鼠胎脑组织总RNA中扩增出该基因的c DNA序列,并克隆到增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的真核表达载体p EGFP- C1中,对重组质粒p EGFP- GDNF进一步鉴定。采用电转及阳离子脂质体将重组质粒p EGFP- GDNF转染至SH- SY5 Y细胞。结果 大鼠GDNF c DNA已正确地克隆到真核表达载体p EGFP- C1中,而构建成重组大鼠质粒p EGFP-GDNF。GDNF基因可稳定表达在细胞中。结论 真核细胞表达载体p EGFP- GDNF以及表达GDNF工程细胞SH-SY5 Y的成功构建,为进一步开展GDNF基因治疗PD等中枢神经系统疾病奠定了基础。

反义HLA-A2和GDNF共表达逆转录病毒载体的构建和鉴定

为构建GDNF和反义HLA -A2共表达的逆转录病毒载体,将人GDNF酶切片段(XhoI/SalI)克隆于逆转录病毒载体pLNCX2 的XhoI位点,再将HLA A2cDNA片段反向克隆于上述重组载体的HindIII/SalI位点,对其作酶切鉴定和测序后转染PA317包装细胞系进行病毒的包装。收获重组病毒感染的NIH3T3并进行病毒滴度的测定,GDNF及HLA- A2表达的RT -PCR检测,进一步感染人胚肺成纤维细胞,观察GDNF分泌情况。结果表明:GDNF和反义HLA -A2两片段的序列和插入方向完全正确,包装后获得的重组病毒的平均滴度为5×105 CFU/ml。RT PCR显示:在小鼠源性的PA317细胞中有人GDNF和HLA A2的表达,ELISA法测得病毒感染人胚肺成纤维细胞上清液中GDNF含量为450pg/ml。通过本实验,我们获得能共表达GDNF和反义HLA -A2的重组逆转录病毒,其转染的人成纤维细胞具有合成GDNF的能力。

慢病毒介导新型Tet-On系统调控大鼠GDNF和TH双基因表达对帕金森病大鼠的实验研究

目的观察改良Tet-On系统修饰慢病毒(Lv-TH-GDNF)目的基因的表达调控及纹状体内直接转移对帕金森病(PD)大鼠的作用。方法 1用Lv-TH-GDNF与rt TA2s-M2病毒感染He La细胞,免疫印迹法检测强力霉素(Dox)对TH、GDNF基因表达的调控。2用Lv-TH-GDNF与rt TA2sM2病毒共同注射到PD大鼠患侧纹状体,Dox诱导目的基因表达。通过观察阿扑吗啡(APO)诱导旋转行为、黑质多巴胺能神经元数量、患侧纹状体DA、DOPAC含量评估Lv-THGDNF治疗效应;通过移植侧纹状体内TH与GDNF蛋白量评估外源基因在体内的表达。结果 1在体外He La细胞实验,仅Dox阳性组见TH、GDNF蛋白条带。2在动物体内实验,病毒移植4周后,与PBS对照组相比,仅病毒+Dox组大鼠旋转行为明显改善(P<0.01),损伤侧黑质致密部TH阳性细胞数、纹状体DA、DOPAC含量及TH和GDNF蛋白量明显增高(P<0.01)。结论新型Tet-On系统修饰的Lv-THGDNF目的基因表达受四环素类抗生素调控,在体外实验未见基础活动,且纹状体内直接转移对PD大鼠有一定治疗作用。

大鼠局灶性脑缺血再灌注后GDNF mRNA及其蛋白表达的变化

目的观察大鼠脑缺血再灌注后缺血半暗带皮质脑源性神经营养因子(GDNF)mRNA和蛋白的表达变化。方法采用线栓法制作局灶性脑缺血大鼠(MCAO)模型,用原位杂交法和免疫组化法观察脑缺血后3、6、12 h及1、3、7 d共6个时间点GDNF mRNA及其蛋白的表达变化。结果缺血半暗带GDNF mRNA及其蛋白的表达均于缺血灌注后3 h开始明显上升,6 h达高峰,12 h表达开始减弱(P<0.05或P<0.01),3 d后降至正常水平。结论脑缺血再灌注后缺血半暗带GDNF mRNA及蛋白表达均明显增加可能参与了脑缺血后神经保护。

组蛋白高乙酰化介导的Egr-1结合促进gdnf基因高转录

目的探讨大鼠C6胶质瘤细胞中gdnf基因启动子II区组蛋白H3K9高乙酰化引发该基因高转录的机制。方法采用Ch IP-PCR技术检测了大鼠C6星形胶质瘤细胞和正常星形胶质细胞中gdnf基因启动子II区转录因子Egr-1结合位点处H3K9的乙酰化水平以及Egr-1与该启动子的结合能力;利用Real-time PCR和Ch IP-PCR技术,检测了组蛋白乙酰基转移酶抑制剂姜黄素(Curcumin)和去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(TSA)处理对C6胶质瘤细胞中gdnf基因启动子II区Egr-1结合位点处H3K9的乙酰化水平、Egr-1与之的结合能力以及该基因转录水平的影响。结果较之正常星形胶质细胞,C6胶质瘤细胞中gdnf基因启动子II区Egr-1结合位点处H3K9的乙酰化水平显著升高,并且Egr-1与之的结合能力也显著升高(P<0.01)。当Curcumin显著降低了Egr-1结合位点处H3K9乙酰化水平时,Egr-1与启动子II区的结合量以及gdnf基因m RNA的表达量都显著下调(P<0.05);而当TSA显著升高了Egr-1结合位点处H3K9乙酰化水平时,Egr-1与启动子II区的结合量以及gdnf基因m RNA的表达量都显著升高(P<0.05)。结论在大鼠C6胶质瘤细胞中gdnf基因启动子II区H3K9高乙酰化介导的Egr-1结合量升高可能是其高转录的原因。

IL-1β及TNF-α促进大鼠肠平滑肌细胞表达胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)并抑制其受体表达

目的研究白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)对SD大鼠肠平滑肌细胞(ISMC)胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)及其受体原癌基因受体酪氨酸激酶(Ret)和GDNF家族受体α1(GFRα1)表达的影响。方法改良酶消化法分离SD大鼠ISMC,免疫细胞化学染色法检测观察平滑肌细胞特异性标志物α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及结蛋白(desmin)的表达;单独或联合使用IL-1β和TNF-α处理ISMC 48 h,用实时定量PCR检测各组GDNF、Ret及GFRα1 mRNA相对表达水平。结果利用改良酶消化法获得了高纯度的大鼠ISMC,其α-SMA及desmin阳性率均大于95%;与空白对照组相比,TNF-α能促进ISMC表达GDNF,抑制其表达GFRα1,而对Ret的表达无明显影响,IL-1β能抑制ISMC表达Ret,对GDNF及GFRα1的表达无明显影响;IL-1β联合TNF-α能显著促进ISMC表达GDNF,抑制其表达Ret及GFRα1。结论IL-1β联合TNF-α能促进ISMC表达GDNF,抑制其表达GDNF受体Ret及GFRα1。

人参皂苷Rg1对SHR大鼠纹状体GDNFmRNA基因表达和多巴胺含量的影响

目的:探讨人参皂苷Rg1对SHR大鼠纹状体GDNFmRNA基因表达和多巴胺含量的影响。方法:将SHR大鼠随机分为模型对照组(MC组)、盐酸哌甲酯控释片组(MPH组)和人参皂苷Rg1组(Rg1组)。各组按设计剂量给药14天后,取纹状体组织,采用高效液相法检测多巴胺(DA)的含量、原位杂交法检测GDNFmRNA的基因表达。结果:盐酸哌甲酯控释片组和人参皂苷Rg1组的纹状体神经元的细胞膜及细胞浆GDNFmRNA基因表达明显增强,模型对照组未见明显表达;盐酸哌甲酯控释片组和人参皂苷Rg1组与模型对照组比较,纹状体多巴胺的含量显著升高。结论:人参皂苷Rg1可能通过促进纹状体GDNFmRNA的基因表达和增加多巴胺的含量而起到治疗ADHD的作用。

含GDNF基因的慢病毒载体的构建和其在人胚胎神经干细胞中的表达

利用含胶质源性神经营养因子(Glial cell derived neurotrophic factor,GDNF)基因的慢病毒载体转染了人胚胎来源的神经干细胞,探讨了转染后GDNF在神经干细胞中的体外表达水平及其影响因素。首先GDNF基因被克隆入慢病毒载体,通过瞬时转染法包装出病毒上清,经滴度鉴定后分别按拷贝数为1、2.5、5、10转染神经干细胞。转染后细胞经过潮霉素筛选得到均一表达GDNF的神经干细胞体系。其后分别利用酶联免疫吸附(ELISA)方法和Real-time PCR方法测定不同转染组细胞在不同时间点GDNF的蛋白分泌水平和基因表达水平。实验中构建了表达GDNF基因的慢病毒载体,包装出的病毒上清在体外培养条件下成功转染了神经干细胞,经潮霉素筛选可以得到均一的持续表达分泌GDNF的人胚胎皮层神经干细胞体系。实验结果表明转染拷贝数可以影响GDNF的分泌水平,相同条件下转染拷贝数越高,GDNF分泌量越多,其基因表达水平越高。因此,含GDNF的慢病毒载体可以成功转染人胚胎来源的神经干细胞,使其持续表达GDNF,转染过程中可以通过拷贝数在一定水平上控制GDNF的蛋白分泌水平和基因表达水平。

脑络欣通及其拆方对脑缺血再灌注大鼠脑组织GFAP、bFGF和GDNF蛋白表达的影响

目的探讨中药复方脑络欣通及其拆方抗气虚血瘀证脑缺血再灌注损伤的作用机制。方法复制大鼠气虚血瘀证模型,线栓法大脑中动脉制作局灶性脑缺血再灌注模型,随机分为假手术组、模型组、益气组、活血组和脑络欣通组,予相应处理;采用免疫组织化学染色SABC法检测额顶叶皮质缺血半暗带区GFAP、bFGF和GDNF蛋白表达。结果模型组GFAP、bFGF和GDNF蛋白表达较假手术组明显增强(P<0.01);各治疗组与模型组比较,在脑缺血再灌注48h和72h均有显著差异(P<0.05或0.01);在脑缺血再灌注24h,部分治疗组与模型组有显著差异(P<0.05);各治疗组间在脑缺血再灌注48h或72h有显著差异(P<0.05)。结论脑络欣通可通过抑制GFAP的表达,促进bFGF和GDNF蛋白的表达,调节不同细胞间相互作用,改善气虚血瘀证脑缺血再灌注损伤。