重组禽流感病毒(H5+H7)三价灭活疫苗免疫黄鸡抗体水平分析

H5或H7亚型高致病性禽流感是一种高度致死性传染病,它不仅给养禽业造成了巨大的危害和损失,还威胁着人类的生命健康安全。为了分析重组禽流感病毒(H5+H7)三价灭活疫苗(H5N1 Re-11株+H5N1 Re-12株和H7N9 H7-Re3株)免疫抗体水平,本研究对如皋市内14个养殖场近2万只黄鸡进行重组禽流感病毒三价灭活疫苗肌肉注射,免疫三周后,随机采集420份血液样品进行HI抗体效价检测。结果表明,免疫后的鸡群均无明显不良反应,可以诱导黄鸡产生良好的抗体,检测时具有较高的抗体效价,H5亚型Re-11株平均抗体效价为7.8log2,Re-12株平均抗体效价为8.2log2,H7亚型Re-3株的平均抗体效价为6.8log2,并且免疫抗体合格率均达到70%以上,对黄鸡具有良好的安全性和免疫保护效果,研究结果为有效地控制高致病性禽流感提供参考依据。

四川省宜宾市翠屏区2017—2021年禽流感H5亚型抗体水平监测与分析

为评估四川省宜宾市翠屏区禽流感疫苗的临床免疫效果,对近5年14个镇、街道的家禽采取简单随机抽样的方法进行禽流感H5亚型免疫抗体检测。结果显示:2017—2021年禽流感抗体免疫合格率均达到了农业农村部标准,其中鸡禽流感个体抗体合格率为83.03%,鸭禽流感个体抗体合格率为76.89%,家禽的抗体水平与季节不具有一定相关性。

H5、H7亚型二价灭活疫苗悬浮培养工艺及免疫效果研究

为获得高质量禽流感灭活疫苗候选株,研究其遗传稳定性与免疫原性。将利用反向遗传技术构建的H5N2亚型(rD8株)和H7N9亚型(rGD76株)AIV分别在MDCK悬浮细胞上传代培养,检测各代病毒液的血凝效价,并制备二价油乳剂灭活疫苗免疫4周龄SPF鸡。免疫后21d检测两种亚型抗体的HI效价,分别用H5N1亚型和H7N9亚型效检毒株对免疫鸡群进行攻毒保护实验。两株病毒传代后其血凝效价rD8株可达8log2,rGD76株可达9log2,与亲本毒株基本一致。对传代后的第1、5、15代病毒液进行HA、NA基因测序分析,各代次序列同源性较高,关键位点氨基酸序列未发生变异,与亲本毒株保持一致。实验鸡免疫后21d,血清中H5亚型HI抗体几何平均值为8.0log2,H7亚型HI抗体几何平均值为 8.4log2,攻毒后5d各组试验鸡均未检测到有排毒现象。两株病毒经传代后逐渐适应了悬浮培养的MDCK细胞,血凝效价稳定,且均具有较好的免疫原性,可作为禽流感疫苗种毒。

基于抗体-适配体夹心生物传感器检测大肠杆菌O157:H7

大肠杆菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7)是一种重要的与公共卫生相关的食源性病原体。抗体分子是体液免疫应答中最重要的效应分子,具有多种生物学活性,最主要的生物学功能是与相应抗原特异性结合。适配体是体外合成的较短DNA序列,可通过识别特定区域和靶标特异性结合。利用抗体和适配体的特异性识别功能及免疫磁珠的捕获作用和磁分离,并通过多克隆抗体和裁剪得到的适配体搭建生物传感器,使用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qPCR)可以实现对靶标在(8×10^(3))-(8×10^(6))CFU/mL范围内的定量检测,检测限为800 CFU/mL。

鸡鸭H7N9禽流感和新城疫抗体水平检测结果分析

为掌握衢州市衢江区鸡鸭H7N9禽流感和新城疫的免疫效果,笔者从2019至2021年连续3年对辖区内的规模养殖场及散养户鸡和鸭开展免疫抗体水平检测。检测结果表明,鸡H7N9禽流感、鸡新城疫及鸭H7N9禽流感的抗体合格率分别为93.91%、79.75%及90.96%,均达到国家规定合格率,其中鸡H7N9禽流感的抗体合格率显著高于鸡新城疫的抗体合格率(P=0.014);规模场的新城疫抗体合格率为88.37%显著高于散养户的抗体合格率61.15%(P=0.012);H7N9禽流感抗体合格率与新城疫抗体合格率在上半年和下半年间没有显著差异,说明季节对抗体合格率的影响较小。

2019~2021年花溪区H5、H7亚型禽流感免疫抗体监测情况及分析

为了解2019~2021年花溪区的禽流感免疫效果,对其管辖的部分涉农乡镇(街道)随机采集120~400日龄的鸡群血清样品4 391份,采用血凝抑制试验对禽流感H5和H7亚型进行免疫抗体检测,根据高致病性禽流感诊断技术中抗体效价标准进行判定,HI抗体效价≥4log2,判定个体免疫效力合格;群体免疫抗体合格率≥70%,判为群体抗体合格率达标。检测结果显示,花溪区(H5+H7亚型)禽流感免疫抗体合格率2019、2020、2021年依次为91.03%、91.78%、96.19%,呈现逐年上升趋势;H7亚型抗体合格率高于H5亚型,规模化鸡场抗体合格率高于大户和散养户。综上所述,禽流感免疫抗体合格率均高出国家标准,说明全区免疫工作较扎实有效;监测禽流感免疫抗体为花溪区科学预防H5、H7亚型禽流感的流行提供数据支撑,推动花溪区的家禽业健康持续发展。

血清抗PLA2R抗体、增殖诱导配体、24 h尿蛋白水平联合检测在特发性膜性肾病中的应用价值

目的:探究在特发性膜性肾病中采用血清抗PLA2R抗体、增殖诱导配体(APRIL)、24 h尿蛋白水平联合检测的应用价值。方法:研究对象为80例特发性膜性肾病患者与30例进行体检健康者。回顾80例患者的病历资料,所有患者的病情均经肾穿刺活检病理检查确诊,并按病理分期分为3组,即病理分期为1期者为观察A组(25例),病理分期为2期者为观察B组(30例),病理分期为3期者为观察C组(25例),健康体检者为对照组。四组参与研究者,均开展血清抗PLA2R抗体、增殖诱导配体(APRIL)、24 h尿蛋白水平检测,对比四组血清抗PLA2R抗体、增殖诱导配体(APRIL)、24 h尿蛋白水平,同时评估联合检测在特发性膜性肾病中的应用价值。结果:特发性膜性肾病患者的抗PLA2R抗体、APRIL、24 h尿蛋白水平明显高于对照组相应指标水平,比较差异具有统计学意义(均P<0.05);三组患者的血清抗PLA2R抗体、APRIL、24 h尿蛋白水平比较差异无统计学意义(均P>0.05),其中观察C组患者以上指标高于观察1、2组,观察B组患者以上指标高于观察A组,比较差异均具有统计学意义(均P<0.05);血清抗PLA2R抗体表达越高,患者的APRIL、24 h尿蛋白水平越高,之间存在明显的正相关关系,比较差异具有统计学意义(均P<0.05)。结论:特发性膜性肾病采用血清抗PLA2R抗体、增殖诱导配体(APRIL)、24 h尿蛋白水平联合检测,不仅可以检测出相关病情,还可以对病情的严重程度进行鉴别诊断。

肉鸡与蛋鸡H5、H7、H9亚型禽流感病毒抗体水平调查

为了解养殖场家禽中H5、H7、H9亚型禽流感病毒抗体水平,通过血清学调查,应用血凝抑制试验(HI)的方法,对四川内江、山东济南、河南鹤壁、江苏扬州4个定点实验观测站负责的养殖场的鸡血液样本进行禽流感病毒抗体分析,其中包含2个肉鸡场和3个蛋鸡场。研究发现蛋鸡场通常免疫了H5、H7、H9(或H5与H9)亚型禽流感疫苗,而肉鸡场只免疫了H9亚型禽流感疫苗;蛋鸡场和肉鸡场都存在免疫禽流感疫苗后抗体水平低和无抗体产生的情况,从而导致免疫不合格或免疫失败。以上结果表明,应加强家禽养殖场对不同亚型禽流感疫苗的免疫以及免疫后的禽流感病毒抗体水平监测,以防免疫失败,从而预防禽流感的发生和流行。

2017年中国普通人群H5和H9亚型流感病毒抗体水平检测分析

了解我国各省区人体H5和H9亚型流感病毒抗体水平变化,为我国流感防控政策的制定提供科学依据。2017年3月~4月份分批采集了来自中国大陆31个省市自治区18岁~94岁之间普通人群血样3 145份,采用微量血凝抑制试验检测H5和H9亚型流感病毒抗体水平。结果表明,我国人群中H5亚型流感病毒抗体总阳性率60.48%,阳性主要集中在18~29岁和70岁~99岁年龄段;H9亚型流感病毒抗体总阳性率为3.78%,阳性主要集中在30岁~39岁年龄段。从性别来看,H5和H9亚型流感病毒抗体阳性率女性显著的高于男性。就地域而言,我国东北部分省市及沿海省市流感病毒抗体阳性率偏高,其中吉林省人群中H5亚型流感病毒抗体阳性率78.57%,海南省人群中H9亚型流感病毒抗体阳性率为28.57%;我国中部及西北地区H5和H9流感病毒抗体阳性率较低。我国大部分省市人群中H5亚型流感病毒抗体阳性率显著高于H9亚型流感病毒抗体阳性率。

免疫程序与母源抗体对H5禽流感疫苗免疫鸭和鹅HI抗体水平的影响

对不同日龄与母源抗体水平的鸭和鹅,用H5亚型禽流感疫苗免疫后,其HI抗体消长情况进行了比较和观察,结果,初生水禽3日龄首免即可对禽流感疫苗(H5亚型)产生良好的免疫应答;雏鹅母源抗体几乎以每4d下降1个HI抗体效价单位的速度消退;母源抗体对H5禽流感疫苗免疫后的HI抗体水平存在一定的干扰作用;加强免疫鸭和鹅所产生的H5 HI抗体水平及其维持时间与仅免疫一次的鸭和鹅所产生的抗体水平之间存在显著差异;鸭和鹅免疫H5禽流感疫苗后第25～30d H5 HI抗体水平达到高峰.

抗大肠杆菌O157∶H7鸡卵黄抗体的制备及其被动保护作用的研究

目的 制备鸡蛋卵黄免疫球蛋白IgG抗体 (YolkImmunoglobulin ,IgY) ,研究其对肠出血性大肠杆菌 (EHEL)O15 7∶H7的被动保护作用。方法 采用EHECO15 7∶H7933菌株制备抗原 ,免疫SPF莱杭鸡 ,用脱脂和盐析的方法 ,从其所产鸡蛋中提取IgY抗体 ,用所得抗体对乳鼠进行动物毒性试验及动物被动保护实验。结果 用酶联免疫吸附试验 (ELISA)检测提取IgY抗体滴度达到 1∶2 0 0 0 0 0以上 ,SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS -PAGE)检测所提取抗体纯度及回收率较高。未发现IgY抗体对动物的毒性作用 ,被动保护实验结果表明 ,IgY抗体对乳鼠感染模型具有明显的保护作用。 结论 (1)通过常规免疫技术 ,可使SPF鸡产生高效价的IgY抗体。 (2 )脱脂和盐析是一种简便有效的IgY抗体制备方法。 (3)建立了EHECO15 7∶H7的乳鼠肠道感染模型。 (4)

大肠杆菌O157:H7异硫氰酸荧光素标记抗体的制备及评价

目的:制备高效价、高纯度、特异性好、荧光强度高及稳定的抗大肠杆菌O157∶H7异硫氰酸荧光素(FITC)标记抗体,初步探讨其在大肠杆菌荧光免疫检测试验中的应用。方法:复苏培养E.coli O157∶H7标准菌株,甲醛灭活制备疫苗免疫家兔。4次免疫后,颈动脉采血分离血清,经辛酸-饱和硫酸铵法粗提后应用蛋白亲和层析柱HiTrap Protein G HP进行IgG纯化,借助SDS-PAGE电泳、BCA试剂盒法、间接ELISA法分别对蛋白纯度、蛋白含量及抗体效价进行测定。应用不同FITC与蛋白量比值以及不同标记反应条件对多克隆抗体进行标记。比较荧光抗体F485/535,结合差异性显著分析对FITC与蛋白量比值及反应条件进行合理选择,应用标记抗体与E.coli O157∶H7和金黄色葡萄球菌混合菌液反应验证标记效果。结果:HiTrap Protein G进行E.coli O157∶H7多克隆抗体纯化的最佳纯化方法为35%、100%二梯度洗脱,制备抗体效价为1∶25 600,与沙门氏菌、阴沟肠杆菌等8种肠杆菌无交叉反应,最佳FITC与蛋白量比值为1∶10,最佳标记反应条件为20℃、2h。由最佳条件制得的荧光抗体与E.coli O157∶H7反应明显,强荧光连续照射15min后仍显示高亮度荧光反应,且不与金黄色葡萄球菌反应。结论:本实验首次制备出纯度高、荧光强度高、持续时间长的E.coliO157:H7FITC标记多克隆抗体,为E.coli O157:H7荧光免疫检测方法的建立完成了关键步骤。

基于血凝素蛋白特异性抗体的H7亚型流感病毒双抗体夹心ELISA检测方法建立

目的基于H7亚型流感病毒,制备针对于HA抗原的单克隆抗体,并建立双抗体夹心ELISA检测体系,为其在流感病毒快速检测试剂研发中提供技术储备。方法用H7亚型禽流感病毒HA重组蛋白免疫BALB/c小鼠,通过传统杂交瘤技术制备HA特异性单克隆抗体,筛选可在双抗体夹心ELISA技术平台上使用的配对抗体,初步探索该ELISA体系的检测特异性、敏感性和广谱性。结果共制备出6株HA特异性单克隆抗体,并成功筛选出捕获抗体8B11-C9及检测抗体7C3-G5的最佳配对。该双抗体夹心体系对HA重组蛋白的检测灵敏度可达到1.56 ng/mL,能有效检测出不同宿主来源的H7亚型流感病毒,与其他亚型流感病毒无交叉。结论成功制备出H7亚型流感病毒HA单克隆抗体,建立了H7亚型流感病毒特异性的双抗体夹心ELISA检测方法,为其快速检测试剂研发奠定了基础。

出血性大肠杆菌O157∶H7单克隆抗体制备及免疫胶体金试纸条的研制

将骨髓瘤细胞SP2/0与出血性大肠杆菌O157∶H7免疫小鼠得到的脾细胞融合,通过筛选得到3株稳定分泌抗出血性大肠杆菌O157∶H7单克隆抗体的杂交瘤细胞株D3、E7、B9,D3和B9亚类为IgG1,E7亚类为IgG2a,轻链亚型均为κ。交叉反应结果显示这3株单抗仅结合出血性大肠杆菌O157∶H7,对15株其他细菌无反应,测得胶体金标记单抗最佳pH、最佳结合量分别为D3:pH 7.5~8.0、24μg/mL;B9:pH 7.5、12μg/mL;E7∶pH7.5、18μg/mL,抗体配对选择胶体金结合D3喷涂金标垫、E7以1 mg/mL喷涂NC膜作T线为最优组合,试纸条检测出血性大肠杆菌O157∶H7灵敏度为2.1×106CFU/mL,且仅可检出出血性大肠杆菌O157∶H7,对25株其他细菌均无交叉反应,模拟带菌实验表明,对市售面包、牛奶、果冻各25 g(mL)均添加约200 CFU出血性大肠杆菌O157∶H7,增菌培养8、10、10 h即可检出。研究表明,实验自主制备的抗体性能良好,试纸条特异性、灵敏度达到国外同类产品,可在政府食源性致病菌监管部门、食品企业推广运用。

动物源性人兽共患细菌病防控生物新制剂的研究Ⅰ．分泌抗大肠杆菌O157：H7单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

将E．coli O157：H7（EHEC—O157：H7）用甲醛灭活、超声破碎，免疫BALB／c小鼠，制备免疫脾细胞；与SP2／0骨髓瘤细胞融合后，获得7株分泌抗E．coli O157：H7单克隆抗体（mAbs）的杂交瘤细胞株，分别命名为F5、B8、E7、G9、G11、F1和C3，Ig亚类分别是IgG2ak、IgG2aK、IgG1K、IgMK、IgMh、IgMK和IgG2aK。用间接ELISA检测，E7和F1细胞培养上清液的效价为1．6×10^3，腹水效价均为1×10^11；C3、F5、B8、G9和G11细胞培养上清液的效价为1×10～2×10^2，腹水效价均为1×10^3。相加ELISA结果显示，F1、G9和G113株mAbs对应相同的抗原表位，而其它4株对应不同的抗原表位。用间接ELISA分析特异性，7株mAbs与某些其他血清型的大肠杆菌有交叉反应。Westernblotting表明，c3、E7和F13株mAbs在蛋白分子量28×10^3处有特异性条带，而其它4株mAbs则未显示蛋白带。

酶标记鸡卵黄抗E.coli O157∶H7抗体的制备与特性研究

目的：研究制备特异性抗E.coli O157：H7鸡卵黄免疫球蛋白（IgY）及酶标记抗体（IgY-HRP）的工艺条件。方法：分别用灭活菌体、脂多糖及O抗原多糖抗原免疫临产母鸡，水稀释法结合离子交换色谱分离提取IgY，再用过碘酸钠法和戊二醛法进行HRP标记，各种制品的分析用电泳及ELISA法。结果：可获得纯度为79．6％～85．3％的IgY，提取率74％～77％；过碘酸钠氧化法标记效果较好，IgY-HRP（1mg／ml）最高效价640。结论：免疫制备IgY方法可行，过碘酸钠法标记IgY-HRP取得良好效果。

大肠杆菌O157∶H7单克隆抗体胶体金免疫层析检测试纸条的研制

用E.coliO157∶H7菌体免疫BALB/c鼠,制备免疫脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞融合,获得了16株分泌单克隆抗体（mAb）的杂交瘤细胞株。其中,1D3、2E7和2H7三株为O157∶H7特异单克隆抗体,Ig亚类分别为IgMκ、IgG2bκ和IgG2bκ,腹水抗体ELISA效价分别为103、105和106。用纯化的单克隆抗体2E7标记胶体金,制备金标抗体玻璃纤维素膜;将纯化的2H7和羊抗鼠IgG分别作为检测和对照捕捉抗体包被于硝酸纤维素膜（NC）上;组装成双抗夹心法O157∶H7胶体金免疫层析检测试纸条。用该试纸条可特异检测O157∶H7,敏感度为106CFU/mL,与相同单克隆抗体2H7和2E7建立的O157∶H7夹心ELISA检测方法的敏感度相当,试纸条简便快速,在1~5 min内可得出检测结果,便于O157∶H7的临床快速诊断与现场检测样品的快速筛查。

特异性抗肠出血性大肠杆菌O157:H7内毒素鸡卵黄抗体的制备

目的:比较研究LPS和O-SP的免疫原性,制备出特异性抗内毒素(LPS)鸡卵黄免疫球蛋白(eggyolkimmunoglobulin,IgY),用于对E.coliO157:H7的免疫预防及检测。方法:分别用灭活E.coliO157:H7菌体、不同浓度内毒素(LPS)及O-特异性多糖链(O-SP)与不完全弗氏佐剂充分乳化后作抗原免疫临产蛋母鸡,以水稀释法从卵黄中提取抗体,阴离子交换色谱法实现对抗体的纯化,间接ELISA及双向免疫扩散检测抗体产生效价与活性。结果与结论:所制内毒素(LPS)和O-SP均有较好的免疫原性,刺激鸡体后可产生高效价抗体,灭活菌体、600μg/mlLPS、1200μg/mlLPS、2000μg/mlLPS、O-SP抗体产生效价最高可分别达1:32000、1:28000、1:32000、1:12000、1:40000。结合离子交换色谱,用0.185mol/L的离子强度可实现一步洗脱纯化抗体,制备出高纯度、高活性、特异性强的鸡卵黄免疫球蛋白IgY,为大肠杆菌O157:H7的感染防治提供了可靠的保证,在此实验基础之上可进一步探讨应用特异性IgY对大肠杆菌O157:H7的检测。

大肠杆菌O157:H7多克隆抗体纯化

目的制备大肠杆菌O157∶H7多克隆抗体,比较3种纯化方法对抗体性能的影响,为食品检验、临床和血清学检验O157∶H7奠定基础。方法应用传统方法制备大肠杆菌O157∶H7多克隆抗体,利用盐析法、亲和层析法和抗原吸附法对其进行纯化,采用SDS-PAGE、Bradford法、ELISA等实验技术检测纯化后抗体的纯度、比效价、交叉反应性,从而比较3种纯化方法的纯化效果。结果获得效价1∶131072的大肠杆菌O157∶H7抗血清。亲和层析法所得纯化产物纯度较高,抗体解链为分子量约55 kDa和25 kDa的蛋白,抗原吸附法所得产物纯度次之,盐析法所得产物的纯度较差,有多条杂蛋白条带。抗原吸附法所得纯化产物比效价较高为349.3,并且与其他5株细菌的交叉反应情况相对反应较小。结论亲和层析法和抗原吸附法纯化抗体均有一定的优越性,抗原吸法得到的抗体使用性能较好。

肠出血性大肠杆菌O157∶H7主要保护性抗原单克隆抗体的研制及特性分析

以基因重组技术构建工程菌株表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7主要保护性抗原紧密素和志贺毒素的融合蛋白。融合蛋白采用凝胶分离电洗脱法回收纯化,用纯化的蛋白抗原免疫BALB/c小鼠,细胞融合后获得的3株杂交瘤细胞株1G2、3C6、1B10,能分别稳定分泌针对紧密素、志贺毒素Stx1和Stx2的单克隆抗体。3株单抗分别制备腹水并纯化,ELISA检测效价分别为1∶6.4×105、1∶1.2×106、1∶3200。Western-blot检测表明,3株单抗与融合蛋白发生特异性反应。应用3株单抗均可特异性检出EHECO157∶H7,而3株单抗与其他不产生紧密素和志贺毒素的大肠杆菌不反应。