重组HBcAg激活p38MAPK信号通路增加髓源性树突状细胞IL-15的分泌

目的探讨重组人乙型肝炎病毒核心抗原(rhHBcAg)诱导髓源性树突状细胞(mDC)分泌白细胞介素15(IL-15)的机制。方法采用人单核细胞磁珠负分选试剂盒分选外周血单核细胞,采用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、IL-4和肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导分化为mDC,10μg/m L rhHBcAg刺激mDC 1~6 d;分别用25μmol/L磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路抑制剂LY294002、1μmol/L p38丝裂原激活蛋白激酶(p38MAPK)信号通路抑制剂SB203580、100 nmol/L c-Jun N末端激酶(JNK)信号通路抑制剂SP600125和150 nmol/L胞外信号调节激酶(ERK)信号通路抑制剂U0126预处理1 h,再给予10μg/m L rhHBcAg刺激48 h。之后收集细胞和细胞培养上清,实时定量PCR检测IL-15 mRNA水平,ELISA检测IL-15蛋白水平,Western blot法检测PI3K/Akt和MAPK信号通路分子磷酸化水平。结果与rhHBcAg未刺激组比较,rhHBcAg刺激组IL-15 mRNA和蛋白水平显著升高;与rhHBcAg刺激组比较,p38抑制剂预处理组IL-15水平明显降低,但PI3K/Akt、JNK和ERK抑制剂预处理组IL-15水平未见显著性改变。结论 rhHBcAg通过p38MAPK信号通路上调外周血mDC IL-15的分泌。

死胎胎盘组织中HBcAg表达的临床和病理研究

观察乙型肝炎病毒在胎盘、肝组织中的表达和引起胎盘组织的病理改变情况。采集４０例乙型肝炎产妇产下的死胎，常规尸检，取胎盘、肝组织，ＳＰ法检测ＨＢｃＡｇ，常规病理观察；回访婴母产前静脉血ＨＢＶ的检测结果。ＨＢｃＡｇ阳性颗粒在死胎胎盘的蜕膜细胞、滋养层细胞、绒毛间质细胞、绒毛毛细血管内皮细胞浆、血管中呈点、灶状分布，细胞的核不着色。ＨＢＶ呈单项阳性小三阳、大三阳的婴母分娩的死胎胎盘组织中ＨＢｃＡｇ阳性率；死胎胎盘的蜕膜细胞、滋养层细胞、绒毛间质细胞、绒毛毛细血管内皮细胞中ＨＢｃＡｇ阳性率；彼此比较，差异不显著（Ｐ＞０．０５）。死胎胎盘绒毛发育迟缓、慢性绒毛炎。单脐动脉的发生率；ＨＢＶ呈单项阳性、小三阳、大三阳的婴母分娩的死胎肝组织中ＨＢｃＡｇ阳性率，彼此比较，差异显著（Ｐ＜０．０５）。ＨＢＶ母婴传播可能还存在一种从母体面向胎儿的细胞转移方式；ＨＢＶ可以导致胎盘发育不良和屏障功能障碍；死胎胎盘组织中ＨＢｃＡｇ阳性率与孕妇ＨＢＶ静脉中ＨＢＶ标志无关；胎盘组织中可能存在ＨＢＶ复制；死胎肝组织中ＨＢｃＡｇ阳性表达与孕妇ＨＢＶ感染状态、静脉中ＨＢＶ标志有关。

肝炎肝硬化患者肝组织中HBcAg、HBVDNA表达的初步探讨

观察乙型肝炎引起的肝炎肝硬化患者肝组织中HBcAg和HBVDNA的表达。随机采取 10 0例乙型肝炎肝硬化患者 ,行肝活检术取肝组织 ,采用免疫组织化学和原位分子杂交法 ,检测其中HBcAg和HBVDNA。肝组织中HBcAg、HBVDNA的检出率分别为 6 4%和 6 2 %(P >0 0 5 )。血清HBV呈高复制时 ,肝组织中HBcAg和HB VDNA的阳性表达 ,有较好的一致性 ;HBcAg颗粒在肝呈弥漫的浆、膜型分布者 ,其肝组织中HBVDNA呈高表达 ;其肝组织病变是活动的 (P <0 0 5 )。乙型肝炎肝硬化患者肝组织中有较高的HBV复制率 ;肝组织中HBcAg和HBVDNA的分布类型与其中的HBV的复制状况和组织病变的活动性有关。

慢性乙型肝炎患者肝细胞内HBsAg、HBcAg的表达与肝组织病理、血清HBV DNA定量关系

目的探讨慢性乙型肝炎(CHB)患者肝细胞内HBsAg、HBcAg的表达与肝组织病理及血清HBV DNA定量、肝组织HBV DNA定量之间的关系。方法对188例CHB患者进行肝组织穿刺活检,采用免疫组化技术观察肝细胞内HBsAg、HBcAg的表达,采用HE染色及免疫组化染色。光镜观察肝炎活动度及纤维化程度,同时测定其肝组织及血清中HBV DNA含量。结果在CHB患者肝组织内HBsAg和HBcAg阳性表达率分别为95.7%和77.1%。HBsAg表达方式主要为胞浆型(98.3%);HBcAg表达方式为浆膜型和胞核型,分别为62.1%和37.9%,浆膜型组炎症活动度分级和纤维化分型均高于胞核型组(P<0.05);浆膜型组血清和肝组织的HBV DNA含量均显著高于胞核型组,二者比较差异有统计学意义(χ2=8.214,P=0.042;χ2=11.250,P=0.010)。结论在CHB患者肝组织免疫损伤发生的免疫应答中,HBcAg的表达方式与病毒的复制有关,与肝组织炎症、纤维化损伤有直接关系。肝组织中HBcAg的表达结合HBV DNA载量作为抗病毒治疗指标更为可靠。

乙肝病人胃十二指肠粘膜HBsAg、HBcAg与胃部病变、血清HBVM的关系研究

目的：研究乙肝病毒与胃十二指肠粘膜病变及血清HBVM的关系。方法：应用HE染色、SP兔疫组化法检测63例乙肝病人胃十二指肠粘膜的HBsAg、HBcAg；应用酶标法检测其血清HBsAg、HBcAg，地高辛探针法检测HBV－DNA。结果：63例乙肝病人胃十二指肠粘膜均有不同程度的病理改变，以慢性浅表性胃炎多见，其次为溃疡病；胃十二指肠粘膜单项HB－sAg阳性率约31．7％，单项HBcAg阳性率约22．2％，一项以上阳性率约42．9％；胃十二指肠粘膜HBVM与病变程度有关，与血清相应的HBVM、HBV-DNA无关。结论：HBV可侵犯胃十二指肠粘膜，可能发生原位复制引发病理损伤。胃十二指肠粘膜HBsAg、HBcAg检测可作为判断HBV在体内复制、分布状态的新指标。

PTD-HBcAg融合蛋白经树突状细胞诱导特异性CTL抑制HBV的体外研究

目的:探讨经PTD-HBcAg融合蛋白致敏的树突状细胞(DCs)体外诱导特异性细胞毒T淋巴细胞(CTLs)对HBV的抑制作用。方法:体外分离培养小鼠髓源性DC,加入融合蛋白刺激DC成熟后与T淋巴细胞共培养,ELISA法检测T淋巴细胞上清中IL-2、IL-4、IL-10和INF-γ的分泌水平,流式细胞术检测胞内细胞因子水平,乳酸脱氢酶释放试验检测特异性CTL活性,并对HepG2.2.15细胞上清中HBsAg及HBV DNA水平进行检测。结果:经不同融合蛋白刺激的DCs能有效促进T淋巴细胞的细胞因子分泌,同时融合蛋白PTD-HBcAg组中IL-2(552.7±117.5ng/L)和INF-γ(150.6±7.945ng/L)明显高于HBcAg组中IL-2(420±12.47ng/L)和INF-γ(107.5±12.19ng/L)分泌。流式细胞计数术检测的PTD-HBcAg融合蛋白诱导CTL细胞水平明显高于对照组。经PTD-HBcAg融合蛋白诱导的CTL比HBcAg有明显的特异性杀伤作用(P<0.05),同时对HBsAg及HBV DNA水平有明显的抑制作用。结论:经PTD-HBcAg融合蛋白致敏的DCs能有效刺激T淋巴细胞分泌细胞因子及增加细胞毒T淋巴细胞的表达,并增强特异性CTL活性及对HepG2.2.15细胞上清中HBsAg及HBV DNA水平的抑制。

高压氧治疗慢性肝炎对患者免疫功能和肝组织中HBsAg、HBcAg影响的研究

观察慢性肝炎(CH)高压氧(HBO)治疗前后患者的免疫功能和肝组织中HBsAg、HBcAg的变化。用纯氧单仓治疗(0.25 MPa,1.5h/d,10d/cyc,6cyc)60例CH,治疗前后用Array TM Protein System Array 160测静脉血A/G、r、lgA、lgG、lgM、C_1、C_4;肝穿刺活检,SP法检测肝组织中HBsAg、HBcAg。HBO治疗后CH患者静脉血r、lgA、lgG、lgM、C_1、C_4明显降低,A明显升高,治疗前后差异显著(P<0.05);CH患者肝组织中HBsAg、HBcAg治疗前后差异不显著(P>0.05)。HBO治疗CH,可降低患者的免疫反应,对CH肝组织中HBsAg、HBcAg抑制作用不明显。

重组HBcAg与HBsAg混合抗原的免疫效果

目的观察重组HBcAg与HBsAg混合抗原免疫BALB/c小鼠后体液免疫与细胞免疫的效果。方法配制含Al(OH)3佐剂与不含佐剂的混合抗原,分别免疫BALB/c小鼠,采用ELISA法测定抗体滴度和细胞因子水平;采用流式细胞仪分析T细胞亚群。结果HBcAg与HBsAg混合抗原免疫小鼠产生的IFN-γ量明显高于二者单独免疫,CD3+和CD4+水平显著增高;含Al(OH)3佐剂的混合抗原CD8+水平明显高于阴性对照组;混合抗原免疫小鼠血清产生的抗-HBs抗体与2倍剂量的HBsAg单独免疫相比,差异无显著意义。含Al(OH)3佐剂与不含佐剂的疫苗免疫效果差异无显著意义。结论重组HBcAg与HBsAg混合抗原表现出良好的体液免疫与细胞免疫效果,为治疗性乙肝疫苗的开发提供了依据。

融合基因Aβ-HBcAg的原核表达及表达蛋白的免疫反应性和免疫原性分析

目的 研究 β 淀粉样肽 (β amyloidpeptide,Aβ)与乙型肝炎核心抗原 (HBcAg)融合基因Aβ HBcAg的原核表达 ,检测融合蛋白的免疫反应性及免疫原性。方法 将重组质粒pBV2 2 0 /Aβ HBcAg转化大肠杆菌DH5α,温控表达 ,超声破碎细菌 ,通过SDS PAGE、考马斯亮蓝染色和ELISA等方法 ,观察Aβ HBcAg的表达及融合蛋白的免疫反应性 ;用融合蛋白免疫Balb/c小鼠 ,ELISA法检测血清中的抗 Aβ抗体和抗 HBc抗体滴度。结果 融合蛋白以包涵体的形式存在于沉淀中 ,表达量为菌体沉淀的 5 % ,融合蛋白既有Aβ的免疫反应性 ,又有HBcAg的免疫反应性。Balb/c小鼠经过 3次免疫后 ,血清中的抗体滴度很低 ,继续强化免疫 2次后 ,血清中抗 Aβ抗体滴度、抗 HBc抗体滴度分别上升为 1∶80 0和1∶32 0 0。结论 融合基因Aβ HBcAg可在大肠杆菌DH5α中表达 ,表达蛋白有一定的免疫反应性和免疫原性 ,但表达量较低 ,免疫反应性和免疫原性较弱。提示融合基因Aβ HBcAg的表达量和融合蛋白免疫原性的提高尚需进一步研究。

EGFRvⅢ与HBcAg重组疫苗抗肿瘤作用的实验研究

目的:观察PEP-3/HBcAg融合蛋白疫苗的体内抗肿瘤作用。方法:BALB/c小鼠30只随机分成3组,分别接种PEP-3/HBcAg融合蛋白、HBcAg和生理盐水,待融合蛋白组小鼠体内抗体效价达到1:20000时终止免疫,于每只小鼠背部皮下种植阳性Renca细胞,2×105个/只。观察融合蛋白疫苗的抗肿瘤效应。采用HE染色和免疫组织化学图像分析法检测各组肿瘤组织的坏死情况和EGFRvIII表达水平。结果:融合蛋白组、HBcAg组和生理盐水组的成瘤率分别为50%、100%和100%。生理盐水组肿瘤生长速度最快,HBcAg组次之,融合蛋白组肿瘤出现最晚,生长速度最慢。融合蛋白组成瘤小鼠肿瘤平均质量显著小于生理盐水组和HBcAg组(t=4·731,P=0·044;t=6·890,P=0·040);后两组肿瘤质量无统计学意义(t=0·024,P=0·382)。HBcAg组和生理盐水组移植瘤呈不完全小片状坏死,融合蛋白组移植瘤呈大片状坏死,伴炎细胞浸润。融合蛋白组EGFRvⅢ表达水平明显低于生理盐水组和HBcAg组(t=3·157,P=0·006;t=2·539,P=0·021),后两者EGFRvIII表达水平无统计学差异(t=0·460,P=0·651)。结论:PEP-3/HBcAg融合蛋白疫苗能诱导机体产生保护性免疫反应,并具有抗肿瘤作用。

乙型肝炎患者胃粘膜中HBcAg和HBVDNA表达分析

目的 探讨乙型肝炎患者胃粘膜中是否有HBcAg和HBVDNA的存在。方法 随机选择 12 0例乙型肝炎患者并对其行胃粘膜活检。采用ELISA法检测其静脉血HBVM ,采用免疫组织化学SP法检测其胃粘膜中的HBcAg ,采用原位分子杂交法检测其胃粘膜中的HBVDNA。 结果乙型肝炎患者胃粘膜中有HBcAg和HBVDNA的存在 ,主要呈胞浆型分布 ,少数在胃粘膜腺细胞胞核上表达。胃粘膜腺腔、胃小凹及间质中也可见HBcAg和HBVDNA颗粒。血清HBsAg合并HBeAg和抗HBc阳性、HBsAg和抗 HBe及抗 HBc均阳性与抗 HBc阳性或HBsAg阳性或抗HBe阳性 ,但HBeAg阴性者的乙型肝炎患者胃粘膜中HBcAg、HBVDNA阳性率比较 ,差异无显著性(P >0 .0 5 )。结论 乙型肝炎患者胃粘膜中有HBcAg和HBVDNA的存在 ,与其血清中HBV复制状态不相关。

死胎多脏器组织中HBcAg表达的初步探讨

观察乙型肝炎病毒通过母婴传播在胎儿多脏器组织中表达情况。采集 4 0例乙型肝炎产妇产下的死胎 ,常规尸检 ,取大脑、胸腺、心脏、肺、肝、脾、肾脏、脐带、胎盘组织 ,SP法检测HBcAg ;回访婴母产前静脉血HBV的检测结果。死胎多脏器组织中HBcAg阳性率以肺、肝、肾脏、脐带为最高 ,胸腺、心脏、脾、胎盘次之 ,大脑最低 (P<0 0 5 )。HBV呈单项阳性、小三阳、大三阳的婴母分娩的死胎同一脏器 (除胸腺外 )组织中HBcAg阳性率比较 ,差异不显著 (P >0 0 5 )。HBcAg阳性颗粒在死胎的大脑、胸腺、心脏、肺、肝、脾、肾脏、脐带、胎盘组织中呈点、灶状分布 ,脏器实质细胞核不着色。HBV对胎儿组织的嗜好与胎儿脏器种类有关 ;死胎同一脏器组织 (除胸腺外 )中HBcAg阳性率与孕妇HBV静脉中HBV标志无关 ;死胎多脏器组织中可能存在HBV复制。

乙型肝炎病毒相关性肾炎患者肾组织中HBsAg、HBcAg的检测(英文)

目的 观察乙型肝炎病毒相关性肾炎 (HBV -GN)患者肾脏组织中HBsAg、HBcAg的表达情况。方法 以 6 3例HBV -GN患者为研究对象 ,另随机选择 2 0例非乙型肝炎病毒相关性肾炎 (NHBV -GN)患者、12例血清HBV标志阳性的其他肾病 (肾结核、肾结石、肾细胞癌、肾萎缩等 )患者作为对照组 ,用免疫组化方法检测肾穿刺活检组织HBsAg、HBcAg的表达。 结果 HBV -GN患者肾脏组织中均可检出HBsAg、HBcAg阳性颗粒 ,阳性率分别为 76 .2 % (4 8/ 6 3) ,4 2 .9% (2 7/ 6 3) ;2 0例NHBV -GN患者肾组织HBsAg、HBcAg均未检出 ,与HBV -GN患者相比有统计学差异 (P <0 .0 5 ) ;12例血清学HBV标志阳性的其它肾病患者肾组织HBsAg、HBcAg阳性率均为 75 % ,与HBV -GN患者相比无统计学差异 (P >0 .0 5 )。血清HBeAg阳性与血清HBeAg阴性的HBV -GN患者相比 ,肾脏组织中HBsAg、HBcAg表达情况经统计学比较 ,无显著性差异 (P >0 .0 5 )。结论 HBV在肾脏中定位及复制 ,不仅可引起肾脏损害 ,并与病毒的保存及乙型肝炎的传播可能有关。

β-淀粉样肽与乙型肝炎核心抗原融合基因Aβ-HBcAg表达载体的构建

目的 构建 β 淀粉样肽 ( β amyloidpeptide ,Aβ)与乙肝核心抗原 (HBcAg)融合基因Aβ HBcAg的原核表达载体 pBV2 2 0 /Aβ HBcAg ,为阿尔茨海默病基因工程疫苗的研究和制备奠定基础。 方法 采用非对称互补引物 /模板法 ,制备两端含有酶切位点的Aβ1- 42肽的cDNA ,将其连接到删除了Pre C区的HBcAg亚型ayw基因的N端组成融合基因Aβ HBcAg ,再将该融合基因亚克隆于载体 pBV2 2 0 ,构建为原核表达载体pBV2 2 0 /Aβ HBcAg。 结果 经DNA测序 ,限制性内切酶酶切等方法证实已成功地将Aβ1- 42cDNA重组到HBVcore的N端 ,并将融合基因亚克隆于 pBV2 2 0内。 结论 成功构建了原核表达载体 pBV2 2 0 /Aβ HBcAg。

慢性乙肝患者肝细胞胞浆和胞核的HBcAg表达强度与肝脏炎症纤维化、乙肝病毒复制的关系

目的分别评定慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)患者肝细胞胞浆和胞核的HBcAg表达强度,分析与临床的关系,研究肝细胞胞浆和胞核内HBcAg的作用。方法对CHB患者肝活检标本317例行免疫组化染色,显示HBc Ag在肝细胞胞浆和胞核的表达强度,同时记录患者的多种临床指标。分别分析肝细胞胞浆和胞核的HBcAg表达强度相互关系以及与各临床指标的关系。结果 HBcAg胞浆和胞核表达强度无相关关系(r=0. 104,P=0. 064)。HBcAg表达胞核阴性组比阳性组呈现年龄更大,ALT、肝组织炎症活动度分级(G)及纤维化分期(S)更高,但血清HBeAg阳性率更低的特点; HBcAg表达胞浆阴性和阳性组两组的上述指标差异均无统计学意义(P>0. 05)。HBcAg胞核和胞浆表达阴性组均比阳性组血清HBVDNA载量更低,差异有统计学意义(P=0. 025,P=0. 00)。结论肝细胞胞核的HBcAg表达强度与肝脏炎症和纤维化联系的紧密性远高于肝细胞胞浆内HBcAg。肝细胞胞核内HBc Ag表达强度可能才是肝脏炎症活跃和纤维化进展的关键,且CHB患者肝细胞胞浆、胞核的HBcAg表达强度均与HBV复制呈正相关。

丁型肝炎患者肝组织HDAg与HBsAg/HBcAg和HBV DNA相关性研究

目的探讨丁型肝炎患者肝组织中HDAg与HBsAg,HBcAg和HBV DNA表达及相关性。方法应用免疫组化双重染色及连续切片技术和原位杂交,检测了79例丁型肝炎患者肝组织佃ADAg,HBsAg,HBcAg和HBV DNA表达,以52例乙型肝炎作对照。结果丁型肝炎HBsAg,HBcAg检出率为81％,71％,乙型肝炎为94％,92％,两组比较有显著性差异(P<0.05或0.01)。HDAg以肝细胞核表达为主,其次是胞质表达,HBsAg以肝细胞浆表达为主,HDAg和HBsAg表达强度及阳性细胞分布呈一致性,两种抗原的表达程度与肝组织的炎症活动和病理损害相关(P<0.01)。HBcAg以以肝细胞核表达为主,阳性细胞主要呈单个细胞或点状分布,且HBcAg阳性细胞明显少于HDAg阳性细胞。HDAg表达强度与HBV DNA表达呈负相关(P<0.05)。结论 HDV感染会抑制HBV DNA复制或病毒抗原表达;在HDV致病机制中HDV的直接细胞毒性可能起主要作用,也有HBV的协同作用。

慢性乙型肝炎肝组织HBsAg和HBcAg的表达

目的探讨慢性乙型肝炎患者肝组织中HBsAg和HBcAg的表达与血清HBV-DNA含量、肝组织中HBV-DNA含量、肝组织病理及临床之间的关系。方法选择慢性乙肝患者83例,检测血清HBV-DNA的含量,并行肝穿刺取肝组织,用免疫组化法检测乙肝患者肝组织中HBsAg和HBcAg的表达并检测肝组织中HBV-DNA的含量,同时行常规肝组织病理染色。结果在慢性乙型肝炎患者肝组织内HBsAg和HBcAg阳性表达率分别为81.9%和53%。HBsAg 98.5%是浆膜型;HBcAg浆膜型占62.8%、胞核型占37.2%,浆膜型的肝组织炎症、纤维化较胞核型明显。HBsAg表达强度与血清HBV-DNA定量、肝组织HBV-DNA定量及肝组织炎症和纤维化之间均无相关性。HBcAg表达强度随着血清HBV-DNA定量的增加而增加,呈正向关联(r=0.291,P=0.008),与肝组织HBV-DNA定量呈现明显的正向关联(r=0.664,P<0.001),与肝组织炎症、纤维化分级也呈正相关(r=0.611,0.841,P<0.001)。结论慢性乙肝患者肝组织免疫损伤发生的免疫应答的主要抗原是HBcAg。将肝组织中HBcAg的表达结合HBV-DNA载量作为抗病毒治疗指标更可靠。

EGFRvIII/PEP-3 cDNA与HBcAg重组基因原核表达载体的构建、表达与免疫分析

目的:构建EGFRvIII与HBcAg重组基因的原核表达质粒,进行原核表达、纯化,观察表达蛋白的免疫原性和抗原性。方法:通过双酶切从pGEM-TEasy/PEP-3载体获得编码EGFRvIII突变区的cDNA片段,插入去除了主要免疫优势区的重组质粒pGEMEX/HBcAg中,获得重组质粒pGEMEX/c-PEP-3-c,将重组基因亚克隆于原核表达载体pET28a(+)中,通过IPTG诱导蛋白表达,利用Ni2+-NTA亲和层析法对融合蛋白进行纯化;用融合蛋白常规免疫BALB/c小鼠,用间接ELISA检测小鼠血清中抗体的滴度。结果:经酶切鉴定、序列测定证实融合基因已插入pET28a(+)载体中,融合基因序列与设计序列完全一致。原核表达后表达量占沉淀全菌蛋白的56%,纯化产物占总蛋白的92%,浓度约8g/L。BALB/c小鼠经4次免疫后,其血清中中和抗体的滴度可达1∶16000,第6次免疫后血清中中和抗体的滴度达到1∶2.56×105,抗PEP-3抗体滴度达到1∶1.28×105,抗HBcAg抗体滴度小于1∶4×103。结论:融合基因PEP-3-HBcAg在大肠杆菌中可获得高效表达,表达的融合蛋白可以诱导小鼠产生高滴度和高特异性中和抗体,从而为高表达EGFRvIII恶性肿瘤基因工程疫苗的研究奠定基础。

重组质粒pYTA/Aβ-HBcAg的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的 :研究 β 淀粉样肽 (Aβ)与HBcAg的融合基因Aβ HBcAg的原核表达 ,并检测表达的融合蛋白Aβ HBcAg的免疫原性。方法 :从重组质粒 7Z/Aβ HBcAg中 ,切下含Aβ HBcAg的基因片段 ,将其融合于质粒pYTA1的lac启动子之后 ,构建重组表达质粒pYTA/Aβ HBcAg。以此重组质粒转化大肠杆菌DH5α,在IPTG诱导下表达。超声破碎表达的细菌 ,通过SDS PAGE及考马斯亮蓝染色 ,检测融合蛋白Aβ HBcAg的表达。采用ELISA法检测融合蛋白的反应原性。融合蛋白经饱和硫酸铵盐析法分离和纯化后免疫BALB/c小鼠 ,用ELISA法检测血清中抗 Aβ抗体的滴度。 结果 :融合蛋白以可溶性形式存在于细菌裂解液的上清中 ,其表达量为菌体总蛋白量的 7%。表达的融合蛋白既有Aβ的反应原性 ,又有与HBcAg的反应原性。经 3次免疫后 ,BALB/c小鼠血清中抗 Aβ抗体的滴度最高可达为 1∶16 0 0 0。结论 :融合基因Aβ HBcAg可在大肠杆菌DH5α中表达。表达产物为可溶性蛋白 ,存在于细菌裂解液的上清中 ,具有较强的免疫原性。

G250抗原肽与HBcAg融合基因原核表达载体的构建及表达蛋白的免疫分析

目的构建肾癌G250抗原肽与HBcAg重组基因的原核表达质粒pET28a(+)/C-G250肽-C,并通过大肠杆菌进行原核表达并纯化,分析表达融合蛋白的免疫原性及抗原性。方法 PCR扩增编码G250抗原中249～268氨基酸的基因片段,将G250肽插入去除主要免疫优势区的重组质粒pGEMEX/HBcAg中,获得重组质粒pGEMEX/C-G250肽-C,为更换酶切位点,以pGEMEX/C-G250肽-C为模板,PCR扩增C-G250肽-C基因片段,最终将目的基因亚克隆入原核表达质粒pET28a(+)中,IPTG诱导融合蛋白表达,利用Ni 2+-NTA亲和层析法纯化重组融合蛋白,SDSPAGE鉴定融合蛋白的表达,纯化后融合蛋白经腹腔注射免疫BALB/c小鼠,间接ELISA法检测小鼠血清中抗体的滴度。结果酶切及基因测序鉴定证实融合基因正确重组于表达质粒pET28a(+)中,原核表达并纯化后,该分离纯化融合蛋白纯度达95%以上,其相对分子质量约为22.35。BALB/c小鼠经4次免疫后,所有小鼠血清中均可检测到抗体,免疫第6周其血清中抗体滴度可达到1∶5.12×105,抗G250肽抗体滴度达到1∶6.4×104,抗HBcAg抗体滴度不超过1∶4×103。结论成功构建肾癌G250抗原肽与HBcAg重组基因原核表达质粒pET28a(+)/C-G250肽-C,在大肠杆菌中可高效表达,纯化后融合蛋白具有较强的免疫原性,能诱导小鼠产生高滴度和高特异性的抗体。