新疆经典型Kaposi肉瘤29例血清HHV-8 DNA的套式PCR检测

目的了解新疆经典型Kaposi肉瘤(Kaposi’ssarcoma,KS)患者血清中人类8型疱疹病毒(humanherpesivirus8,HHV8)感染的情况,以探讨HHV8感染与经典型KS发病之间的关系。方法采用套式PCR技术检测29例新疆经典型KS及68例正常对照的血清中HHV8感染的情况。结果25例KS(86.2%)检测到HHV8的DNA片断;正常对照中14例(20.6%)检测到HHV8的DNA序列,差异有显著性(χ2=36.412,P<0.001)。结论HHV8在新疆经典型KS的发病中发挥着非常重要的作用,但可能不是发病的唯一原因。

新疆Kaposi肉瘤组织内EBV、HHV-8双重感染的调查

应用PCR方法，对20例新疆Kaposi肉瘤病理组织进行了EBV和HHV－8双重感染的调查。结果：20例Kaposi肉瘤病理组织中14例检出HHV－8DNA（70％），EBV均为阴性。正常皮肤对照：10例这两种疱疹类病毒均为阴性。作者认为新疆Kaposi肉瘤的发生与EBV的相关性很小，但明显与HHV－8感染有关，但是否HHV－8感染就是新疆Kaposi肉瘤发生的决定因素，仍需进一步研究。

HHV-8 ORF50启动子区序列分离、鉴定及在293细胞中启动活性分析

目的:分离和鉴定人类疱疹病毒8型(HHV-8)ORF50基因上游启动子区序列,评价其在293细胞中启动活性。方法:以佛波酯(TPA)刺激的BCBL-1细胞总DNA为模板,PCR扩增HHV-8 ORF50启动子区序列,克隆进pGL-3基本载体中虫荧光素酶(Luciferase)报告基因上游多克隆位点,分别构建含正反双向ORF50启动子重组报告质粒,并分别转染293细胞,作Lu-ciferase活性检测,计算相对Luciferase活性单位(RLU)。结果:①克隆的HHV-8 ORF50启动子区序列长655碱基(bp),含多个潜在推测AP1、SP1和ERE等转录因子结合序列;②ORF50启动子与正常pGL-3基本载体相比,其RLU增加了26.3倍;③TPA刺激后ORF50启动子与刺激前相比启动活性增加了4.1倍。结论:HHV-8 ORF50启动子区序列在293细胞中具有较强的启动活性;TPA可以作为一有效的阳性对照刺激物用于进一步鉴定ORF50启动子特性。

武汉市450例无偿献血者中HHV-8病毒的检测及基于ORFK1基因的分型研究

目的:了解武汉市无偿献血人群中人类疱疹病毒8型(human herpes virus 8,HHV-8)的感染情况。方法:对武汉市450例无偿献血者的全血样本分别进行全基因组DNA的提取和血清的采集;采用PCR和ELISA 2种方法进行HHV-8阳性检测,比较2种方法阳性检出率之间的差异性;将检测结果为阳性的PCR样本再进行HHV-8 ORFK1基因的克隆,通过测序分析,同源性比对,进化树构建等对阳性样本进行HHV-8 ORFK1基因分型。结果:PCR和ELISA 2种方法分别检测出25例和23例阳性样本,其阳性率分别为5.56%和5.11%;χ2检验分析表明2种检测方法检出结果无统计学差异(P>0.05)。对23例阳性样本的ORFK1基因的克隆、序列分析结果显示,在23例阳性样本中有15例属于HHV-8 ORFK1基因C亚型,8例属于HHV-8 ORFK1基因A亚型。结论:武汉市无偿献血人群中存在一定比例的HHV-8感染,建议增加对无偿献血者的HHV-8病毒筛选,以保证血源质量。

HHV-8和HIV感染与卡波西肉瘤发病关系的研究进展

Kaposi肉瘤(Kaposi's Sarcoma,KS)是一种罕见的软组织恶性多发性色素性血管肉瘤,又称多发性、特发性出血性肉瘤。人类疱疹病毒8型(Human herpesvirus 8,HHV-8),又称为KS相关性疱疹病毒(KS-associated her-pesvirus,KSHV),目前研究表明,HHV-8与各型KS均有密切的联系,是各种临床类型KS发病的重要病原体。KS患者具有较高的病死率,特别是AIDS-KS型。随着AIDS发病率的逐年增长,HHV-8和HIV双重感染KS患病率也呈逐年增长趋势。

组合抗原ELISA法和潜伏态IFA在HHV-8血清检测中的对比研究

目的比较HHV-8组合抗原ELISA检测法与潜伏态病毒IFA法的检测灵敏性与特异性,并验证组合抗原ELISA法作为分子流行病学调查方法的可行性。方法组合抗原ELISA检测法与潜伏态病毒IFA法对32例法国AIDS相关KS患者血清和23例法国肝移植后皮肤癌患者血清检测对比;组合抗原法对12例新疆地区KS患者血清和不同地区儿童血清进行HHV-8检测,结果32例KS患者血清组合抗原ELISA与潜伏态IFA的检出效率分别为75.0%和40.6%,其中潜伏态IFA检出的13例阳性血清,12例被组合抗原ELISA成功检出。潜伏态IFA检测阴性的19例KS血清中,组合抗原检出12例阳性血清;23例肝移植后皮肤癌患者血清潜伏态IFA检测全部阴性,而组合抗原ELISA检出1例弱阳性,2方法符合率达95.6%。组合抗原对不同地区小样本血清HHV-8检测显示出不同的结果:新疆地区12例KS血清阳性率100%;儿童血清HHV-8检测结果:新疆地区儿童感染率17.8%,四川儿童1.4%,法国儿童0。结论该实验室建立的HHV-8组合抗原ELISA法在灵敏性方面较传统方法有明显提高,特异性方面差异较小,HHV-8组合抗原ELISA初步具备分子流行病学调查的灵敏性、特异性要求。

HHV-8 K13基因编码蛋白在人血管内皮细胞和前列腺癌细胞系中的表达及其对细胞增殖影响的初探

目的:研究人类疱疹病毒8型(HHV-8)K13(v-FLIP)基因编码蛋白分别在人血管内皮细胞和前列腺癌细胞中的表达及其对上述两种细胞增殖能力的影响。方法:将PEF-K13-Flag-IRES/Puro重组质粒瞬时转染人血管内皮细胞系EA.HY926细胞和前列腺癌细胞系PC-3细胞,采用Western blot方法检测K13基因编码蛋白表达情况;分别运用流式细胞术和MTT方法检测K13基因编码蛋白对这两种细胞增殖的影响。结果:HHV-8 K13基因编码蛋白能够在人血管内皮细胞和前列腺癌细胞中表达,流式细胞分析和MTT结果显示,HHV-8 K13基因编码蛋白对上述两种细胞的增殖均有明显的抑制作用(P<0.05)。结论:HHV-8 K13基因编码蛋白可以明显抑制人血管内皮细胞和前列腺癌细胞的增殖。

新疆地区200例汉族HHV-8重组抗原血清流行病学调查分析

目的:了解新疆地区汉族人群人类8型疱疹病毒(HHV-8)流行状况。方法:随机选择新疆地区2所三级甲等医院收治的155例汉族肿瘤患者,同时采集45例门诊就诊10岁以下汉族儿童血清,以77例四川儿童血清作为对照。采用组合抗原酶联免疫(ELISA)方法对277例样本血清进行HHV-8特异性抗体的流行病学调查。结果:155例肿瘤患者中41例血清HHV-8抗体呈现阳性反应,阳性率26.5%,45例新疆儿童8例血清阳性,阳性率17.8%,77例四川儿童中1例血清阳性,阳性率1.3%。结论:新疆地区汉族人群为HHV-8高流行区,儿童感染率高于其他地区,性传播途径可能不是新疆地区普通人群HHV-8主要传播途径。

副肿瘤天疱疮2例报告及与HHV-8关系初探

目的 报告副肿瘤天疱疮 2例 ,并对其与Castleman病、人类疱疹病毒 8之间的关系进行初探。方法 采用PCR法进行HHV 8检测。结果 2例病人外周血及肿瘤组织共 4份标本均为阴性。结论 这 2例副肿瘤天疱疮无HHV8感染。

新疆Kaposi肉瘤与皮肤鳞状细胞癌感染HHV-8阳性率的比较研究

目的探讨Kaposi肉瘤与皮肤鳞状细胞癌(SCC)感染人类疱疹病毒8型(HHV-8)的差异。方法用巢式PCR分别扩增30例鳞状细胞癌和30例Kaposi肉瘤组织皮损中的HHV-8 DNA。结果 30例皮肤鳞状细胞癌皮损组织有5份为阳性(16.7%),30例Kaposi肉瘤组织有28份为阳性(93.3%)。结论鳞状细胞癌感染HHV-8的阳性率较低,但并不除外HHV-8为新疆皮肤鳞状细胞癌的病因之一。

新疆地区非霍奇金淋巴瘤与HHV-8感染的关系

目的:检测新疆地区非霍奇金淋巴瘤(NHL)中HHV-8的感染情况,并探讨HHV-8感染与NHL形成之间的关系。方法:应用免疫组织化学方法检测135例已经确诊的NHL中HHV-8感染状况。结果:135例NHL中有1例弥漫性大B细胞淋巴瘤中HHV-8感染为阳性,阳性率为0.74%,其它亚型,包括滤泡性淋巴瘤、粘膜相关性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤等均为阴性。结论:新疆地区NHL中存在HHV-8感染,HHV-8感染与NHL发生发展之间的关系还有待进一步研究。

HIV-1 Tat蛋白对人类疱疹病毒8型复制的影响

用HindⅢ将HIV-1Tat101蛋白编码基因从pEV质粒中切出,BamHI、NotⅠ将绿色荧光蛋白(GFP)编码基因从表达质粒pcDNA3 1+/GFP中切出,分别插入到质粒LZRSpBMN-Z中,构建成重组反转录病毒表达质粒LZRS-Tat101和LZRS-GFP。采用磷酸钙转染法将两重组质粒转染到含反转录病毒env、gal和pol编码基因的包装细胞Phoenix(ΦNX)中,嘌呤霉素筛选获得稳定细胞系。分别收集稳定细胞系分泌的病毒上清,并感染体外培养的原发性渗出性淋巴瘤(PEL)BCBL-1细胞。收集LZRS-GFP重组病毒感染的BCBL-1细胞进行流式细胞计数,检测GFP表达水平。收集LZRS-Tat101重组病毒感染的BCBL-1细胞,提取蛋白作Westernblot,检测Tat蛋白表达状况;取细胞总RNA作Northernblot和定量PCR,检查HHV-8次要衣壳蛋白ORF26mRNA转录水平。重组LZRS-Tat101病毒进一步感染HL3T1细胞(HeLa细胞包含HIV-1-LTR/CAT报告基因),收集感染细胞提取蛋白,检测CAT活性,评价Tat生物学功能。PCR扩增HHV-8复制和转录激活蛋白Rta启动子区上游序列,并克隆至pGL-3载体中,构建Rta启动子+虫荧光素酶(Luciferase)报告基因重组质粒。此重组质粒进一步电转染预先感染了LZRS-Tat101病毒的BC-3细胞,TPA刺激后收集细胞,检测Luciferase活性。结果显示:①重组反转录病毒感染BCBL-1细胞,一次感染?

人类疱疹病毒8型包膜糖蛋白编码基因K8.1的分离、克隆及在大肠杆菌中的表达

目的:分离、克隆人类疱疹病毒8型(HHV-8)包膜糖蛋白K8.1编码基因,并置于大肠杆菌中作融合表达。方法:设计一对PCR引物,在引物的5'端分别引入BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点,以佛波酯(TPA)刺激的原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞系BCBL-1细胞总DNA为模板,PCR扩增出K8.1编码基因,克隆至原核表达载体pGEX-6p-1中,构建含K8.1基因重组质粒。重组质粒转化大肠杆菌(E.coli)BL21感受态细胞,以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白。结果:分离、克隆的411bp序列与基因数据库中所登记的HHV-8K8.1序列呈现100%同源性。IPTG诱导后的菌体,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),显示有一个41ku的融合表达蛋白产生。结论:HHV-8K8.1编码基因在E.coli中初步获得正确表达。

人疱疹病毒8型K12基因在大肠杆菌中的克隆和表达

目的:将人疱疹病毒8型(HHV-8)K12基因在大肠杆菌中进行融合表达。方法:设计一对PCR引物,在引物的5'端分别引入EcoRI和XhoI酶切位点,用此引物从质粒pCR-K12中扩增出HHV-8的K12基因,PCR产物经双酶切后按正确阅读框连接到原核表达载体pGEX-6p-1上相应酶切位点,并转化BL21感受态细胞。结果:重组菌经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后,菌体SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)显示有一个大小为33ku的融合表达蛋白产生。结论:初步表明K12基因在大肠杆菌中获得正确表达。

人类疱疹病毒8抗原融合的构建及初步应用

目的构建人疱疹病毒8型(HHV-8)融合蛋白原核表达载体,为诊断HHV-8感染奠定基础。方法构建HHV-8融合蛋白原核表达载体转化大肠杆菌DH5α,诱导表达融合蛋白ORF59-ORF65-K8.1。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹(Western blot)法鉴定融合蛋白。融合蛋白对无偿献血人员血清进行检测。结果 SDS-PAGE显示融合蛋白约24KD,与预期值一致;Western blot提示该融合蛋白可以和HHV-8阳性血清特异性结合。融合蛋白包被酶连免疫吸附实验(ELISA)板后与无偿献血人员血清反应检测HHV-8感染情况,检测结果与市售HHV-8ELISA试剂盒检测结果一致。结论本文构建的融合蛋白可作为HHV-8感染的检测抗原用来筛查献血人员HHV-8感染情况及普通人群HHV-8感染流行病学调查。

人类疱疹病毒8型肿瘤转化基因K12的分离及在昆虫细胞中的表达

目的:分离人类疱疹病毒8型(HHV-8)肿瘤转化基因 K12,克隆至杆状病毒载体并在昆虫细胞中作尝试性表达。方法:设计一对引物,在引物的5′端分别引入BamHI、EcoRI酶切位点,以佛波脂刺激的原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞系BCBL-1细胞总DNA为模板,PCR扩增HHV-8肿瘤转化基因K12。将经序列测定后的PCR产物克隆进杆状病毒转移载体pVL1393中,构建成重K12杆状病毒转移载体pVL-K12,并与线性BaculoGold病毒 DNA共转染昆虫细胞Sf9,获得重组病毒。RT-PCR检测K12 mRNA转录水平;间接免疫荧光染色(IFA)检测K12编码蛋白在Sf9细胞中的表达状况。结果:含 HHV-8 K12基因重组杆状病毒在昆虫细胞Sf9中获得表达,经IFA证实该重组蛋白为HHV-8特异性蛋白。结论:杆状病毒载体能够介导HHV-8肿瘤转化基因K12编码的蛋白在昆虫细胞中表达。

人类8型疱疹病毒的研究进展

人类8型疱疹病毒(human herpesvirus-8,HHV-8)又称卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus,KSHV),是一种新的肿瘤病毒,目前被认为是卡波氏肉瘤(Kaposi’s sarcoma,KS)致病因子,并且与primary effusion lymphoma(PEL)和multicentric Castleman’s disease(MCD)相关,近几年研究发现还与其它疾病相关。HHV-8不像EBv那样广泛存在,而是具有明显的地域民族特征。HHV-8属于DNA病毒,编码许多蛋白,包括潜伏感染相关蛋白,裂解感染相关蛋白和HHV-8特有基因表达蛋白,在KS发病中起到关键作用。但HHV-8导致相关疾病的确切机制还不明确,仍是目前研究的焦点。

新疆维吾尔族及哈萨克族经典型卡波氏肉瘤患者多种样本中人类疱疹病毒8型的初步研究

目的探讨新疆经典型卡波氏肉瘤(Kaposi′s sarcoma,KS)患者多种样本中人类疱疹病毒8型(Hu-man Herpesvirus-8,HHV-8)的病毒感染情况。方法对8例新疆地区经典型的Kaposi肉瘤患者冰冻肉瘤、血液、尿液、唾液标本进行基因组DNA抽提,PCR法扩增HHV-8ORF26基因片段。结果 HHV-8ORF26基因检测情况和8例新疆经典型Kaposi肉瘤组织、血液、尿液和唾液中均有HHV-8感染。结论 HHV-8感染是新疆经典型KS发病的主导因素,HHV-8感染可能与KS患者多器官损害的疾病。

人疱疹病毒8型感染的间接ELISA检测方法的建立

目的建立人疱疹病毒8型(HHV-8)感染的间接ELISA检测方法,并初步探讨其应用价值。方法利用PCR技术获得HHV-8 ORF73C基因,插入到原核表达载体pGEX-6P-1中,在大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导蛋白表达;以纯化的GST-ORF73C融合蛋白为包被抗原,利用方阵滴定法确定包被抗原和抗血清的最适工作浓度,并通过阻断试验、交叉试验、特异性试验、重复性试验及与Chou等建立的K8.1合成多肽-ELISA检测方法进行试验比较等评价其效果。结果SDS-PAGE及Western-blot检测结果显示,目的基因在大肠杆菌BL21(DE3)中得到高效表达,且表达产物能被KS阳性血清[HIV(+)/KS(+)血清]特异性识别;方阵滴定试验显示:包被抗原的最佳浓度为1.5μg/mL,血清抗体的最佳稀释度为1∶80;阻断试验、交叉试验、特异性试验、重复性试验等表明该方法特异性强、重复性好;对86份HIV(+)/KS(-)血清样品进行检测的结果显示,该方法与Chou等建立的K8.1合成多肽-ELISA检测方法的符合率为98.8%。结论GST-ORF73C-ELISA检测方法具有良好的特异性和重复性,可用于HHV-8感染的血清学检测及流行病学调查。

人类疱疹病毒8型ORF50基因截短片段和vIL-6全长基因的克隆、表达及表达产物的纯化

目的:克隆人类疱疹病毒8型(human herpesvirus 8,HHV-8)ORF50截短基因和编码病毒IL-6(vIL-6)全长基因,将其置于大肠杆菌中作融合表达,并纯化融合表达的vIL-6。方法:分别以本实验室先前构建的重组质粒pcDNA3.1+ORF50和pcD-NA3.1+vIL-6为模板,PCR扩增目的基因片段,克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,构建含HHV-8ORF50截短基因的重组原核表达质粒pORF50-C1,pORF50-C2,pORF50-C3和含vIL-6全长基因的重组原核表达质粒pvIL-6。重组质粒经酶切鉴定和核酸序列测定正确后转化大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞,以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白。用glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化vIL-6表达产物。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和Western blot检测GST融合蛋白的表达和纯化情况。结果:核酸序列分析的结果表明,克隆的序列与基因数据库中已登记的HHV-8相应序列呈现100%同源;IPTG诱导后的菌体,经SDS-PAGE,显示有相应大小的融合表达蛋白产生。Western blot亦在预期的位置检测到特异性条带。结论:在E.coli中获得了正确表达的HHV-8ORF50基因3个截短片段和vIL-6全长基因,并成功纯化了vIL-6融合蛋白。