Kdr等位基因频率与家蝇对溴氰菊酯抗性的关系

根据家蝇拟除虫菊酯kdr (knockdownresistance)抗性的遗传标记L10 14F突变 ,设计竞争特异性等位基因PCR扩增方法 (cPASA ,competitivePCRamplificationofspecificallele) ,用于检测单头家蝇基因组中的kdr点突变。通过对 1个实验室敏感种群及 8个野外种群共 4 5 0个个体的kdr等位基因型检测 ,结果表明kdr等位基因频率与溴氰菊酯LD50 值之间有线性正相关回归关系 (Γyx =0 913,P =0 0 0 0 6 )。遗传学分析表明各种群kdr等位基因频率处于Hardy Weinberg平衡状态 ,遗传差异的无偏估计值表明 。

人参皂苷Rg_3对人肺鳞癌细胞VEGF及KDR表达的影响

目的:探讨人参皂苷Rg3在抑制肿瘤新生血管生成过程中的作用,及其对人肺鳞癌SK-MES-1分泌的血管内皮细胞生长因子(VEGF)及其受体KDR的影响。方法:体外培养人肺鳞癌SK-MES-1细胞,经不同浓度的Rg3处理后,采用免疫细胞化学法与RT-PCR法检测Rg3对SK-MES-1细胞株VEGF mRNA、KDR mRNA及其蛋白表达的影响。结果:免疫细胞化学结果显示人参皂苷Rg3各浓度组SK-MES-1细胞VEGF及KDR蛋白阳性率与对照组比较差异显著。RT-PCR结果显示随着Rg3浓度的增加,VEGF、KDR扩增条带逐渐减弱,各浓度组与对照组比较差异显著。结论:人参皂苷Rg3能够抑制人肺鳞癌SK-MES-1细胞VEGF mRNA与KDR mRNA及其蛋白水平的表达,这可能是Rg3抑制肿瘤新生血管形成的机制之一。

不同杀虫剂选育对家蝇抗药性水平及kdr基因频率的影响

采用杀虫剂（溴氰菊酯和甲基嘧啶磷）筛选及不接触药物自然衰退的方法，研究了家蝇Musca domestica氯氟氰菊酯高抗品系（Cyh—R）对杀虫剂的抗性变化，探讨蝇类抗药性治理的方法。用点滴法测定氯氟氰菊酯对不同家蝇品系的毒力，比较抗药性的变化，结合特异性等位基因PCR扩增（PASA）技术检测了不同家蝇品系的kdr基因频率，探讨kdr基因频率与抗性水平之间的关系。结果表明：甲基嘧啶磷筛选后，氯氟氰菊酯对第2～8代Cyh—R品系的LD50呈递减趋势，从F0的2．8434μg／蝇降为F8的0．4404μg／蝇，但第8—18代Cyh—R品系的LD5u呈逐代递增趋势；溴氰菊酯筛选后，氯氟氰菊酯对Cyh—R品系第2～16代的LD50呈上升趋势，从F0的2．8434μg／蝇升至F16的24．3249μg／蝇；表明了施用有机磷杀虫剂可降低其对氯氟氰菊酯的抗药性，而施用拟除虫菊酯药剂则有助于其对氯氟氰菊酯抗药性的增长；不使用任何杀虫剂也能降低其对氯氟氰菊酯的抗药性，但下降速率低于甲基嘧啶磷。PASA技术检测表明Cyh—R品系的kdr抗性基因频率为88．8％，不经过任何药剂筛选其kdr抗性基因频率下降程度最大，达到69．7％；甲基嘧啶磷筛选后其结果降为78．8％，而经溴氰菊酯筛选后kdr抗性基因频率则明显升高，达到98．9％。通过对kdr抗性基因频率和抗性水平进行相关和回归分析表明kdr抗性基因频率与家蝇对氯氟氰菊酯的LD50呈对数关系，即LD50值高的品系其kdr抗性基因频率相应的也较高。建议在家蝇防治中考虑轮换用药。

VEGF受体KDR胞外区基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达

VEGF(血管内皮细胞生长因子 ,VascularEndothelialGrowthFactor)是刺激内皮细胞增殖和新生血管形成的最重要因子 ,与多种实体瘤的生长和转移密切相关。应用其可溶性受体阻断它的病理作用是一个非常有前景的课题。将VEGF受体KDR胞外区前三个Loop 96 9碱基对的cDNA片段克隆到杆状病毒表达载体pFastBacI,与杆状病毒表达载体Bacmid同源重组后 ,转染昆虫细胞SF 9,获得重组杆状病毒并证明了目的基因的高效表达。经Westernblot证实表达产物的特异性。经ELISA和体外生物学活性检测表明表达产物可阻断VEGF的生物学活性 ,抑制鸡胚CAM血管的生长。

益气化瘀解毒方对人肝癌裸鼠HepG2移植瘤MVD、HIF1a、VEGF/KDR表达的影响

目的:观察益气化瘀解毒方对人肝癌裸鼠HepG2移植瘤MVD、HIF1a、VEGF/KDR表达的影响。方法:建立人肝癌移植瘤模型,分为7组,分别以益气化瘀解毒方、黄芪、莪术、重楼、壁虎、顺铂药物干预21 d后,取瘤组织行免疫组化检测。结果:①对MVD的影响:全方组与除顺铂外的其它组比较有统计学意义(P<0.05);除黄芪、莪术外的其它组与空白组比较有统计学意义(P<0.05)。②对HIF1a的影响:全方组与除黄芪外的其它组比较有统计学意义(P<0.05);各组与空白组比较有统计学意义(P<0.05)。③对VEGF表达的影响:全方组与除顺铂外的其它组比较均有统计学意义(P<0.05);莪术组与空白组比较无统计学意义(P>0.05)。④对KDR表达的影响:全方组与其它各组比较均有统计学意义(P<0.05);黄芪组与空白组比较无统计学意义(P>0.05)。结论:益气化瘀解毒方能明显抑制人肝癌裸鼠移植瘤MVD、HIF1a、VEGF和KDR的表达而发挥抗血管生成作用;各单味药对其作用各有侧重,但作为整方的有机组成从不同环节发挥了协同作用。

大肠癌中C-Met VEGF及其受体KDR的表达与预后的相关性

目的:探讨C-Met、CEGF及其受体KDR在大肠癌组织中的表达与预后的关系,为判断大肠癌患者预后提供参考。方法:应用免疫组织化学法检测60例大肠癌标本中C-Met、VEGF及其受体KDR的表达情况。随访统计5年生存率。结果:C-Met、VEGF及其受体KDR在大肠癌组织中的表达阳性率分别为43.3%、61.7%及68.3%;三者在大肠癌组织中的表达与患者的年龄及性别无明显相关(P>0.05),与肿瘤侵袭深度、是否淋巴结转移及Dukes分期密切相关(P均<0.05)。C-Met、VEGF及KDR阳性者5年生存率分别为423%、43.2%及51.2%,阴性者5年生存率分别为73.5%、87.0%及78.9%,两组差异有统计学意义(P<0.05)Cox回归生存分析显示:对于大肠癌患者,VEGF、KDR及C-Met均是独立危险因素;联合检测VEGF、KDR及C-Met,是预测大肠癌预后很好的指标。结论:C-Met、VEGF及其受体KDR在大肠癌患者组织中的表达与大肠癌的发生、发展有关,三者均阳性表达提示患者预后差,可作为评价预后的指标。

黄芪、丹参配伍提取物调控心肌梗死大鼠血管内皮生长因子及其受体KDR的作用

观察黄芪、丹参配伍提取物对心肌梗死大鼠血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及其受体KDR(kinase insert domain receptor)的调控作用,分析其对心肌梗死大鼠的保护机制。对SD雄性大鼠采用冠状动脉左前降支结扎法复制心肌梗死大鼠模型,随机分为模型组、黄芪、丹参配伍提取物高、中、低剂量组(40、20、10 mg·kg-1·d-1);另设假手术组,各组均为8只。黄芪、丹参配伍提取物各组采用上述对应剂量灌胃给药,模型组和假手术组采用等量生理盐水灌胃,连续饲养28 d后采用ELISA法、RT-PCR法和Western blot法检测分析VEGF及其受体KDR的表达变化。黄芪、丹参配伍提取物各剂量组与模型组相比VEGF及其受体KDR随着剂量加大表达明显升高(P<0.01,P<0.05)。说明:黄芪、丹参配伍提取物可以有效上调VEGF及其受体KDR的表达,从而促进心肌梗死大鼠心肌组织中血管新生作用。

淡色库蚊kdr等位基因突变及抗药性检测方法的研究

目的了解山东省不同地区的淡色库蚊成蚊对溴氰菊酯的抗药性水平及其kdr等位基因的突变与抗药性水平间的关联情况,并探索建立蚊虫抗药性的现场检测方法。方法采用PCR和AS-PCR技术,使用特异性引物克隆不同地区野生淡色库蚊成蚊kdr基因序列,并进行基因测序。利用线性回归分析判断其突变情况与抗药性的关联情况。结果成功克隆出kdr等位基因,通过基因序列分析发现在淡色库蚊钠通道第II结构域S6节段1014位点上存在2种突变,即L1014F:TTA突变为TTT,相应的亮氨酸(L)被苯丙氨酸(F)取代,L1014S:TTA突变为TCA,相应的亮氨酸(L)被丝氨酸(S)取代。Kdr基因L1014F突变和L1014S突变与淡色库蚊对溴氰菊酯的抗性表型呈正相关。蚊虫抗药性检测的结果显示PCR技术优于AS-PCR技术。结论淡色库蚊kdr基因突变与溴氰菊酯抗药性表型呈正相关,PCR和AS-PCR技术都可以应用于蚊虫抗药性的现场检测。

桃红四物汤Ⅱ号抑制小鼠B16黑色素瘤生长及VEGF,KDR/FLK-1表达

目的:观察桃红四物汤Ⅱ号对小鼠B16黑色素瘤生长、血管内皮生长因子(VEGF)和血管内皮生长因子受体-2(KDR/FLK-1)表达及肿瘤微血管密度(MVD)值的影响。方法:采用C57BL/6J小鼠皮下接种B16黑色素瘤细胞建立模型,分别给予2.5,5,10 g.kg-1桃红四物汤Ⅱ号水煎剂、环磷酰胺0.05 g.kg-1及联合用药桃红四物汤Ⅱ号10 g.kg-1+环磷酰胺0.025 mg.kg-1,检测各组肿瘤体积、重量、VEGF和KDR/FLK-1表达及肿瘤MVD值。结果:桃红四物汤Ⅱ号5,10 g.kg-1及联合用药组肿瘤体积、重量、VEGF和KDR/FLK-1表达及肿瘤MVD值均较生理盐水组明显降低(P<0.01)。结论:桃红四物汤Ⅱ号能抑制小鼠B16黑色素瘤的生长,其抗肿瘤机制可能与抗血管生成作用有关。

腺病毒介导的KDR启动子-胸苷激酶系统对血管内皮细胞的选择性杀伤作用

目的 :研究腺病毒介导的KDR启动子 胸苷激酶系统对血管内皮细胞的选择性杀伤作用。方法 :应用PCR克隆出人KDR基因启动子序列 - 2 2 5bp～ +12 7bp ,以AdEasysystem为载体 ,构建携带受KDR启动子或CMV启动子调控tk基因表达的 2种重组腺病毒质粒 pAdKDR tk和 pAdCMV tk ,在 2 93细胞中包装、扩增后 ,体外感染表达KDR的脐静脉血管内皮细胞系HUVEC和不表达KDR的肝癌细胞系HepG2 ,并给予不同浓度的丙氧鸟苷 (GCV)处理 ,5d后收集存活细胞并计数。结果 :产生的病毒滴度均为 5× 10 9pfu/ml。在MOI为 10 0、GCV为 5 0 μg/ml条件下 ,AdKDR tk转染HUVEC后细胞生存率下降 (31 49%± 6 .42 % ) ,AdKDR tk转染HepG2后细胞生存率为 76 .5 7%± 3.49% ,而转染AdCMV tk的 2细胞系生存率均显著下降 ,细胞生存率分别为 2 2 .2 4%± 3.77% (HUVEC)和 2 6 .5 3%± 6 .84% (HepG2 )。 结论 :KDR基因启动子可调控HSV tk在血管内皮细胞中特异性表达 ,为进一步开展靶向肿瘤血管内皮的自杀基因治疗研究奠定了基础。

桃红四物汤Ⅱ号抗血管生成作用及其对KDR/FLK-1表达的影响

目的探讨桃红四物汤(THSWD)Ⅱ号抗血管生成作用及其机理。方法以鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)法检测THSWDⅡ号对新生血管的效应,以MTT法检测其对血管内皮细胞ECV304增殖有无抑制作用,并以免疫组化法观察该方对小鼠B16黑色素瘤血管内皮细胞KDR/FLK-1的表达和微血管密度(MVD)计数的影响。结果THSWDⅡ号1 g/mL、2 g/mL组CAM血管指数降低(P<0.01);THSWDⅡ号1 mg/mL、2 mg/mL组ECV304细胞吸光度值降低(P<0.01);THSWDⅡ号5 g/kg、10 g/kg组及THSWDⅡ号10 g/kg+环磷酰胺25 mg/kg组肿瘤重量、KDR/FLK-1的表达、MVD计数均降低(P<0.01)。结论THSWDⅡ号具有抗CAM血管生成、抑制ECV304细胞增殖、抑制小鼠B16黑色素瘤生长的作用。其抗肿瘤作用机制可能与抑制内皮细胞KDR/FLK-1的表达,继而抗血管生成有关。

重组可溶性KDR及其抗体对内皮细胞的增殖抑制作用

目的 :分析可溶性KDR(sKDR)及其抗体对内皮细胞增殖的抑制作用。方法 :通过ELISA分析大肠杆菌表达的sKDR纯化产物与VEGF16 5结合的能力 ;sKDR免疫家兔制备KDR2 6 2抗血清 ,Wensternblot分析该抗血清与KDR2 6 2蛋白结合的特异性 ;用3 H TdR掺入法 ,MTT法和细胞计数 3种方法分析重组sKDR及其抗体对内皮细胞的增殖抑制作用。结果 :sKDR蛋白可与VEGF16 5特异性结合 ,肝素可增强其结合能力。KDR2 6 2抗血清具有特异性识别KDR蛋白的能力 ,其滴度为 1∶2 0 0 0。用3 H TdR掺入法和MTT 2种方法分析sKDR蛋白及其抗体对内皮细胞的增殖抑制作用结果一致 ,sKDR蛋白浓度在 10 μg/ml,2μg/ml,0 .4μg/ml时对内皮细胞增殖抑制率平均为 5 6 %,44 %和 32 %;抗KDR2 6 2抗体在稀释度为 5 0 ,2 0 0和 80 0倍时对内皮细胞增殖的抑制率平均为 70 %,5 6 %和 43%。细胞计数法测定结果 ,sKDR及抗KDR2 6 2抗体组与VEGF16 5单独刺激组 ,GST和PBS对照组相比 ,内皮细胞增殖被明显抑制 ,随浓度增加抑制活性明显增强 ,但抗体的抑制活性比sKDR蛋白高。结论 :大肠杆菌表达的sKDR及其抗体对内皮细胞均具有明显的增殖抑制作用。

KDR基因遗传变异与接受5-FU辅助化疗的结直肠癌患者预后的关系

目的:探讨激酶插入区受体(kinase insert domain receptor,KDR)基因遗传变异与接受5-FU为基础辅助化疗的结直肠癌(colorectal cancer, CRC)患者预后的关系。方法:回顾性分析2012年1月至2017年12月在郑州人民医院肛肠外科接受手术切除治疗的CRC患者共176例的临床资料,并收集93例术后癌组织标本。采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCRRFLP)技术检测KDR基因多态性位点基因型,采用qPCR检测癌组织中KDR基因mRNA的表达水平。通过logistic回归模型分析多态性位点的基因型与其他变量的相关性,非参数检验分析KDR不同基因型的表达,采用Kaplan-Meier生存分析单变量KDR基因型与患者预后的关系,并通过Cox风险比例模型对其他变量进行校正。结果:在KDR的多态性位点中,仅发现了rs2071559位点具有临床意义。该位点在176例CRC患者中的分布频率:TT基因型95例(53.98%),TC基因型70例(39.77%),CC基因型11例(6.25%);最小等位基因频率为0.26;3种基因型分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律(P=0.690)。携带C等位基因的TC/CC基因型患者与野生型TT基因型患者的中位无复发生存期(mDFS)分别为4.4和3.2年(P<0.05);TC/CC基因型和TT基因型患者的中位总生存期(mOS)分别为5.2和4.0年(P<0.05)。对OS构建多变量的Cox模型校正后,TC/CC基因型对mOS具有明显影响(OR=0.55,P<0.05)。rs2071559位点TC/CC基因型患者相对于野生型TT基因型患者KDR m RNA表达水平显著降低(P<0.01)。结论:KDR基因rs2071559位点多态性与CRC患者临床治疗效果相关,其机制是可能通过影响KDR mRNA表达水平进而影响CRC患者的预后。

胃康宁含药血清对胃癌细胞生长与血管内皮生长因子及其受体KDR、Flt-1表达的影响

目的观察中药胃康宁含药血清对胃癌细胞生长和VEGF及其受体表达的作用。方法分别以高、中、低等不同剂量的胃康宁制剂对Wistar雄性大鼠进行灌胃,制备含药血清,然后分别用不同剂量组合药血清培养胃癌细胞,以倒置显微镜及流式细胞仪观测各组胃癌细胞的生长状况,免疫组织化学SABC法检测各组胃癌细胞中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及其受体Flt-1的表达,RT- PCR法检测各组胃癌细胞中VEGF及其受体KDR,Flt-1 mRNA的表达。结果与对照组比较,用药组胃癌细胞的生长及细胞周期明显改变(P＜0．01),用药组G_0-G_1期细胞增多,S期细胞减少,凋亡率增加,并呈一定的量效关系。VEGF的灰度值由对照组的147．82±0．15升高到低剂量组的174．80±0．81,中剂量组的178．65±0．56,高剂量组的182．44±0．54(P＜0．01)。Flt-1的灰度值由对照组144．31±0．71升高到低剂量组148．20±0．69,中剂量组162．01±0．52,高剂量组168．51±0．81(P＜0．01)。胃康宁含药血清培养的胃癌细胞中VEGF及其受体KDR、Flt-1 mRNA的表达明显减弱(P＜0．01)。结论中药胃康宁对胃癌细胞的生长,VEGF及其受体的表达有抑制作用。

贵阳市家蝇对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性现状与kdr（L1014F）等位基因频率分析

探讨贵阳市区家蝇对拟除虫菊酯类杀虫剂抗药性水平与kdr等位基因上的L1014F点突变频率相关性，为贵阳市科学合理使用卫生杀虫剂控制家蝇提供科学依据。本研究采用WHO推荐的微量点滴法进行抗性测定。结果显示贵阳市4城区家蝇对氯菊酯和高效氯氰菊酯的LD50分别为0．00620～0．013339μg／雌蝇、0．02298～0．03614μg／雌蝇，抗性系数分别为3．35～7．56、7．38—11．62。采用特异性等位基因PCR法测定基因频率，结果显示4城区家蝇种群的L1014F点突变频率在29％～37％。相关性分析显示L1014F点突变等位基因频率与高效氯氰菊酯LD50值之间存在直线相关。研究结果表明贵阳市家蝇对氯菊酯、高效氯氰菊酯已经产生了抗药性，击倒抗性是其抗性机理之一。

VEGF mRNA、KDR mRNA及蛋白在非小细胞肺癌中表达的意义探讨

目的探讨非小细胞肺癌中血管内皮生长因子(VEGF)、受体KDRmRNA和蛋白表达的意义。方法应用原位杂交技术及免疫组织化学PV-9000法分别检测30例新鲜非小细胞肺癌标本中VEGFmRNA、KDRmRNA及蛋白的表达。结果VEGF、KDRmRNA和蛋白均主要分布在肺癌细胞、血管内皮细胞及纤维母细胞,肺癌细胞VEGFmRNA和蛋白的阳性率分别为66.67%(20/30)和60.00%(18/30),两者的表达有极显著正相关性(r=0.86,P<0.01);KDRmRNA和蛋白的阳性率分别为73.33%(22/30)和76.67%(23/30),两者的表达亦有极显著正相关性(r=0.7366,P<0.01);VEGFmRNA、KDRmRNA及相应蛋白在肺癌细胞中的表达均呈极显著性正相关(原位杂交r=0.853,免疫组化r=0.5148,均P<0.01);肺癌细胞VEGFmRNA、KDRmRNA及相应蛋白的阳性表达率在不同大小的3组肺癌标本间,差异均具有显著性(确切P=0.014,P=0.002;P=0.0087,P=0.0016);淋巴结有转移组的VEGFmRNA、KDRmRNA及相应蛋白在肿瘤细胞中的阳性表达率显著高于淋巴结无转移组者(确切P=0.007,P=0.003;P=0.0008,P=0.0073)。结论肺癌细胞产生的VEGF通过自分泌环作用于癌细胞上的KDR受体促进癌细胞生长;VEGF及KDR的检测可作为肺癌淋巴结转移的有效评估指标;VEGF及KDR有望成为肺癌治疗的新靶点。

KDR反义寡核苷酸对人胃癌细胞的作用

目的 用 KDR反义寡核苷酸作用于人胃腺癌细胞 ,观察对细胞增殖及超微结构的影响 ,检测作用后 KDR基因的表达 ,并测定细胞分泌 VEGF的能力 .方法 MTT法测定细胞的增殖能力 ,电镜下观察细胞的超微结构 .原位杂交及免疫组化法检测 KDR m RNA及蛋白的表达 .ELISA法测细胞培养液中人 VEGF的含量 .结果 KDR ASODN可明显的抑制人胃腺癌细胞增殖 .增殖抑制率最高可达 55.4% .当剂量为 2 0μmol· L-1 时还可诱发细胞凋亡 .KDR ASODN能明显抑制细胞内 KDR m RNA和蛋白的表达 .胃癌细胞还能分泌一定量的人 VEGF:(92± 1 .7) ng· L-1 .结论 胃癌细胞能分泌一定量的人 VEGF.KDR ASODN能抑制细胞内 KDR基因的表达 ,并显著抑制胃癌细胞的增殖 .在一定剂量下还可诱发其凋亡 .说明 VEGF及受体 KDR在人胃腺癌细胞的增殖。

共培养系统中视网膜微血管周细胞经KDR/Flk-1途径对内皮细胞增生的影响(英文)

目的:采用细胞共培养模型研究缺氧诱导视网膜新生血管生成过程中周细胞对微血管内皮细胞增生的作用及其相关血管内皮细胞生长因子受体2(KDR/Flk-1)调节机制。方法:免疫磁珠法原代分离培养大鼠视网膜微血管内皮细胞和周细胞,分别采用抗VIII因子、CD31抗体以及抗血小板源性生长因子受体β、结蛋白抗体免疫细胞化学法鉴定内皮细胞和周细胞。通过Millicell小室建立周细胞和内皮细胞共培养模型,使用MTT法和流式细胞仪检测内皮细胞增殖数量及周期,观察缺氧和常氧下周细胞对血管内皮细胞增生的影响,并采用RT-PCR法检测内皮细胞KDR/Flk-1的mRNA水平变化,探讨相关调节机制。结果:经免疫细胞化学法鉴定,免疫磁珠法可获得高纯度的视网膜微血管内皮细胞和周细胞。MTT法显示,缺氧3～9d内皮细胞增生明显,6d增生达高峰(24.9%,P<0.01);共培养时内皮细胞的增生可被周细胞抑制。流式细胞仪检测发现,缺氧6dS期内皮细胞数量明显增加(43.9%,P<0.01);常氧(3.6%,P<0.05)或缺氧(15.1%,P<0.01)共培养时,周细胞均可抑制内皮细胞增生。缺氧下内皮细胞KDR/Flk-1的mRNA水平是常氧下的1.3倍;常氧(45.1%,P<0.05)和缺氧(27.7%,P<0.05)共培养下,周细胞均可下调内皮细胞KDR/Flk-1的mRNA表达。结论:缺氧和常氧共培养时周细胞均可抑制微血管内皮细胞增生,此抑制作用部分是通过下调内皮细胞KDR/Flk-1mRNA表达实现。

抗KDR单链抗体的构建、表达及生物学活性鉴定

目的: 构建并表达抗人血管内皮生长因子受体KDR单链抗体(scFv)蛋白, 并测定其生物学活性。方法: 设计合成抗KDR单抗 (mAb)Ycom1D3VH、VL引物, 通过重叠延伸拼接 (splicingoverlapextensive, SOE)PCR, 在VH 和VL基因间引入柔性短肽(Gly4Ser)3, 构建抗KDRscFv基因并进行序列分析。将其克隆入pAYZH原核表达载体, 在大肠杆菌中诱导表达, 并以ELISA及免疫荧光结合实验测定重组蛋白的生物学活性。结果: 序列分析表明, 抗KDRscFv基因的全长为 729bp, 编码 243个氨基酸。将重组体表达产物进行SDS PAGE及Westernblot分析显示, 融合蛋白的相对分子质量(Mr)约为 30 000, 同预期的结果一致。表达产物主要以不溶性包涵体的形式存在, 表达量占菌体总蛋白的 20%。表达产物经变性、纯化及体外复性后, 纯度达 90%以上。ELISA和竞争性免疫荧光结合实验显示, 重组小分子scFv可与可溶性KDR抗原及表达KDR受体的人脐静脉内皮细胞特异性结合, 保留了亲本mAb的抗原结合活性。结论: 成功地构建了抗KDRscFv基因, 并在大肠杆菌中功能性表达, 为靶向诊断、治疗及进一步基因工程改造奠定了基础。

VEGF受体KDR克隆及其对内皮细胞增殖和血管新生的影响

目的 :克隆VEGF受体KDR基因膜外 5 7区 ,探讨其生物学活性。方法 :提取脐静脉血管内皮细胞总RNA ,克隆KDR基因膜外部分 5 7区 ,并使之在QIA表达系统进行表达 ;镍柱亲和层析纯化、复性、生物学活性鉴定。结果 :该系统能表达KDR基因片段 ,表达量约占菌体蛋白总量的 5 %左右。经复性 ,可溶性蛋白具有与VEGF特异结合功能 ,并能抑制VEGF促使脐静脉内皮细胞增殖和鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的作用。结论 :KDR基因片段能在QIA表达系统中得到表达 ,复性后表达蛋白具有与VEGF结合的生物学功能。