布氏杆菌pCDNA3.1-L7L12核酸疫苗的构建及其免疫学评价

目的 获得布氏杆菌保护性抗原L7 L12重组蛋白及pCDNA3.1 L7 L12重组质粒 ,并比较其诱导特异性免疫应答的能力。方法 PCR扩增布氏杆菌核蛋白L7 L12基因分别构建至原核表达载体PET32a(+)和真核表达载体pCDNA3.1(+)中 ;pET32a L7 L12重组质粒转化BL2 1(DE3) ,所表达蛋白经SDS PAGE、免疫印迹分析、纯化后免疫小鼠 ;pCDNA3.1 L7 L12重组质粒配以GM CSF同时肌肉注射免疫小鼠 ,3次免疫后测定免疫功能进行免疫效果的评价。结果 ELISA、Westernblot检测到免疫鼠体内有特异性抗体产生 ,蛋白苗所诱导的抗体效价远远高于DNA疫苗 ;通过淋巴细胞增殖实验、细胞因子和CD分子测定表明DNA疫苗以诱发TH1 型免疫为主。结论 所构建的布氏杆菌DNA疫苗和蛋白苗均具有诱导特异性细胞和体液免疫应答的能力 ,DNA疫苗诱导产生的细胞免疫反应强于蛋白苗 ,可作为潜在的布氏菌新型疫苗 。

羊布鲁氏菌BCSP31、OMP31、L7/L12基因的原核表达载体构建及表达

目的构建羊布鲁氏菌外膜蛋白BCSP31、OMP31和L7/L12基因的重组表达质粒,并在原核系统中表达。方法根据羊布鲁氏菌M5株外膜蛋白BCSP31、OMP31和抗原L7/L12蛋白基因序列设计引物,分别扩增出大小约为1kb、730bp和380bp的目的基因片断,插入pGEM7Zf(+)中测序并进行分析。将3种基因片段亚克隆入pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,用SDS-PAGE及Western-blot进行分析鉴定。结果SDS-PAGE结果表明3个目的蛋白均以融合蛋白的方式成功表达,在相对分子量57kDa、49kDa、38kDa处有表达条带,经薄层扫描分析,目的蛋白分别占全菌蛋白的42%、36%、40%。Western-blot证实3种融合蛋白均能被布鲁氏菌免疫兔血清识别。结论成功构建了3种蛋白的表达载体并进行了高效表达,3种蛋白均具有良好的免疫原性。

瑞士乳杆菌L7生物转化共轭亚油酸的研究

建立了瑞士乳杆菌L7(Lactobacillus helveticusL7)分批发酵生物转化c9,t11-CLA的优化条件:MRS培养基、30℃发酵、静置培养、LA浓度为1.000 mg/mL、发酵时间36h。5L发酵罐分批发酵时,c9,t11-CLA的产量高达0.572 mg/mL。

L.helveticus L7生物转化的共轭亚油酸异构体结构分析

利用HPLC分离出L.helveticusL7生物转化的2种CLA异构体单体,通过紫外光谱、傅立叶变换红外光谱、气相色谱-质谱联用分析,确定了L.helveticusL7生物转化形成的两种CLA异构体是t9t11-CLA和c/t-911-CLA。

布鲁菌核糖体蛋白L7/L12的表达纯化及生物活性鉴定

目的:原核表达系统表达布鲁菌核糖体蛋白L7/L12与GST的融合蛋白GST-L7/L12,并纯化蛋白L7/L12,建立检测特异性抗体的间接ELISA方法。方法:对含有L7/L12的原核表达载体pGEX-4T-1-L7/L12进行了原核表达。利用亲和层析柱分别纯化融合蛋白GST-L7/L12和蛋白L7/L12,并用SDS-PAGE及Western印迹分析鉴定。以L7/L12为抗原包被微量板,优化抗原包被浓度和羊抗鼠IgG-HRP稀释度,建立间接ELISA方法,并检测其特异性。结果:SDS-PAGE结果显示在相对分子质量为38000和12000处可见纯化蛋白的条带,Western印迹分析表明这2条带均能被免疫兔血清识别,表明获得了纯化的有生物活性的融合蛋白GST-L7/L12和蛋白L7/L12。间接ELISA方法的L7/L12抗原包被浓度为5μg/mL,羊抗鼠酶标二抗稀释度为1∶1000。小鼠免疫血清与L7/L12抗原出现阳性反应,而与布鲁菌融合蛋白OMP31、结核分枝杆菌抗原85b及牛血清白蛋白则呈阴性。结论:成功地对布鲁菌核糖体蛋白L7/L12进行了原核表达和纯化,以其为基础建立的间接ELISA方法稳定且特异。

布鲁氏菌L7/L12、OMP31基因的克隆、测序及免疫原性分析

为研制鹿布鲁氏菌病工程疫苗,根据已发表的布鲁氏菌核糖体蛋白L7/L12、外膜蛋白OMP31基因设计两对引物进行扩增,PCR产物连接pGEM-Teasy载体,转化DH5α后测序,并进行基因分析。结果从布鲁氏菌疫苗株中克隆出L7/L12和OMP312个目的基因,同源分析L7/L12达97.1%,OMP31达100%,免疫原性分析可作为免疫优势抗原。

RedHat As 5下L7-filter封包过滤的搭建应用

分析了Linux netfilter/iptables架构下L7-filter的功能、工作原理和实现机制,利用iptables的独立模块L7-fiter实现了具有封锁MSN、QQ等P2P封包过滤功能,并进行相关测试。测试结果表明,该layer7的封包过滤可以在具有网络地址转换(NAT)功能的防火墙体系上实现,限制对P2P等大流量数据对网络带宽的占用,使得网络运行更加高效稳定。

基于Netfilter框架的L7-filter模块实现研究与应用

本文介绍了Netfilter框架的工作原理和Netfilter扩展匹配模块的实现机制。L7-filter是防火墙体系Netfilter的一个扩展匹配模块,其功能是利用正则表达式匹配技术基于数据流的应用层内容的过滤。本文分析了L7-filter的原理和实现,并举例说明了如何使用L7-filter匹配各种协议。

匹诺塞林对体外共培养海兔SN/L7神经元电生理活动的作用

目的研究匹诺塞林(PNCB)对海兔神经元共培养体系(SN/L7)的电生理效应,探讨可能的作用机制。方法体外共培养海兔(aplysia)的感觉神经元(SN)和运动神经元(L7),使其互相接触形成突触连接。细胞培养至d 5,给予不同浓度的PNCB刺激,考察药物对SN/L7兴奋性突触后电位(EPSP)的影响,随后撤去药物,观察EPSP的恢复情况。另取细胞,在PNCB孵育后加入0.005 mmol.L-15-羟色胺(5-HT),观察SN/L7对5-HT的反应性的变化。结果 PNCB作用5 min,使SN/L7的EPSP幅值降低。药物浓度低于0.1 mmol.L-1时,作用强度与药物剂量呈负线性关系(r>0.995),在0.1～0.4 mmol.L-1的浓度范围内,作用强度与药物剂量呈正线性关系(r>0.998);撤去药物后,SN/L7的EPSP幅值可恢复至初始值。PNCB使SN/L7对5-HT的反应性消失,撤去药物后,该反应性得以恢复。结论 PNCB可逆地抑制体外共培养的海兔SN/L7神经元突触的兴奋性传导,并可逆地抑制SN/L7对5-HT的反应性。这一效应可能与突触后膜的谷氨酸受体有关。

抗羊布鲁菌核糖体蛋白L7/L12单克隆抗体制备及初步鉴定

制备抗羊布鲁菌核糖体蛋白L7/L12的单克隆抗体(mAb),为进一步研制布鲁菌检测方法和免疫制剂提供基础。常规动物免疫、细胞融合、克隆化制备抗核糖体蛋白L7/L12的mAb,并用Westernblot和ELISA方法对其特异性、抗原识别表位及相对亲和力等做了初步鉴定。获得了4株抗L7/L12蛋白的mAb:1B1,2A2,2H9和2H10,相对亲和力为2A2>2H10>2H9>1B1,4株mAb识别的抗原表位相近,但仍存在一定的差异。得到的4株稳定的杂交瘤细胞系分泌的mAb能特异结合L7/L12蛋白。

Netfilter防火墙下L7-filter模块的研究和应用

分析了Netfilter防火墙的工作原理和L7-filter的工作原理,介绍了添加layer7模块的方法,举例说明了如何使用L7-fil-ter过滤MSN、QQ等数据包和Flash等文件格式的数据包。分析L7-filter模板文件的格式,并给出了编写L7-filter模板文件的方法。利用该方法可以更加灵活的配置适合不同需要的防火墙。

布鲁菌L7/L12蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

为制备布鲁菌(Brucella)L7/L12蛋白及其小鼠源多克隆抗体,根据猪布鲁菌(Brucella suis)S2株L7/L12基因序列,设计合成特异性引物,PCR扩增L7/L12基因并将其克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组质粒pET-28a-L7/L12,经鉴定正确后转化至大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达。SDS-PAGE分析表明,重组菌经IPTG诱导后成功表达出分子质量为17ku的重组蛋白。将诱导表达的蛋白经镍柱亲和层析纯化后免疫小鼠制备多克隆抗体,并测定其抗体效价。Western blot结果表明,原核表达后纯化的L7/L12蛋白能够与制得的小鼠抗L7/L12蛋白多克隆抗体特异性结合。成功获得了纯化的L7/L12重组蛋白和小鼠抗L7/L12多克隆抗体,为进一步研究L7/L12蛋白对布鲁菌感染的诊断方法和基因工程疫苗的研发奠定了基础。

新疆羊种布鲁氏菌分离株的鉴定与L7/L12蛋白的原核表达和生物信息学分析

【目的】分离并鉴定新疆羊种布鲁氏菌。原核表达该菌的L7/L12蛋白,检测该蛋白的反应原性及进行部分生物学分析。【方法】采用细菌划线培养、形态学观察、PCR检测以及生化试验进行布鲁氏菌分离鉴定。利用常规分子生物学方法表达并纯化羊种布鲁氏菌分离株的L7/L12蛋白,应用Western Blot分析融合蛋白的反应原性。使用生物信息学软件对该蛋白进行了生物信息学分析。【结果】分离鉴定确定该菌株为羊种布鲁氏菌。经过测序与酶切鉴定,正确构建了表达载体p ET-28a-L7/L12.SDS-PAGE试验显示纯化的L7/L12蛋白为单一条带;经过Western Blot检测,该融合蛋白具有良好的反应原性。生物信息学分析显示,该蛋白无跨膜区结构,不存在信号肽,二级结构α-螺旋为主并利用Phyre2服务器成功构建了该蛋白的三维模型。【结论】鉴定出该分离菌株,表达并纯化了该菌的L7/L12融合蛋白,Western Blot证明该蛋白具有良好的反应原性,为后续该蛋白的亚单位疫苗研究奠定了基础。

产共轭亚油酸瑞士乳杆菌L7固定化条件的研究

对瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)L7发酵生产c9,t11-CLA的固定化条件进行研究。应用响应面法对细菌固定化的条件进行优化,得到的优化条件为:海藻酸钠质量浓度1.78g/100mL、氯化钙质量浓度3.13g/100mL、固定化时间60.30min,利用在此条件下制备所得的固定化胶珠发酵,c9,t11-CLA的产量达到561μg/mL。固定化细胞重复利用5次后活力没有明显变化,c9,t11-CLA产量保持在549μg/mL。电镜观察发现,固定化胶珠表面及内部为错综复杂的网状通道结构,能够很好的满足物质的传递。结果表明菌体细胞经海藻酸钠固定,可以有效提高菌体的重复利用率,从而降低c9,t11-CLA的生产成本。

基于多核处理器的L7-Filter规则匹配改进算法

针对多核处理器的体系结构和网络数据流在时间上的局部性特点,提出了一种基于多核处理器的分链动态适应算法。该算法通过对网络数据流进行类型分类并根据网络数据流的时间局部性对规则链进行动态优化,从而有效减少了多核处理器下L7-Filter对网络数据流的匹配次数,显著提升了规则匹配效率。仿真实验结果表明:在网络数据包个数相同条件下,所提算法在性能上约有7%的提高。随着网络数据包个数的增加,性能优越性更加明显。

布鲁氏菌L7/L12和GroES真核表达载体的构建及免疫效果分析

利用Overlap PCR方法连接基因L7/L12和GroES,分别利用pET32a和pcDNA3.1构建原核和真核表达质粒,分别命名为pET32a-LG和pcDNA3.1-LG。原核表达并纯化的重组蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体,用于验证真核表达载体目的基因的表达;重组真核表达质粒pcDNA3.1-LG转染293T细胞,经间接免疫荧光和Western blot验证蛋白成功表达。真核质粒免疫小鼠后,利用ELISA方法检测血清抗体水平,淋巴细胞转化试验检测细胞免疫水平,结果显示,该重组质粒具有良好的免疫效果。

叉头框蛋白O3介导Th1/Th17/Treg失衡在白塞综合征发病机制中的潜在作用

白塞综合征(Behçet’s syndrome,BS)是一种慢性复发性、可累及多种重要脏器的变异性血管炎。免疫紊乱是BS发生发展的基石,其中辅助性T细胞(T helper cell,Th)1/Th17/调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)失衡起重要作用。叉头框蛋白O3(forkhead box O3,FOXO3)可调节T细胞活化、分化和T细胞功能。FOXO3表达改变与Th1/Th17/Treg失衡相关,使FOXO3成为免疫疾病治疗的潜在靶点。目前尚缺乏FOXO3与BS相关的研究,故本文对FOXO3作为BS潜在治疗靶点的机制进行总结与展望。

应用^(60)Coγ射线诱变选育武夷菌素高产菌的研究

武夷菌素是一种广谱、高效、低毒的生物农药,对蔬菜病害及果树、粮食作物病害有着明显的防治效果。但目前生产上所用的武夷菌素产生菌的效价都相对较低,为进一步提高武夷菌素产生菌药效,降低生产成本,研究以L7为出发菌株,采用3种不同剂量(500Gy,1000Gy,1500Gy)的60Coγ射线对其进行诱变处理。通过琼脂块法初筛,从3582株突变株中选育出78株相对高产菌株进行摇瓶复筛,最终选出5株效价最高的菌株(C-28,C-42,C-64,C-75,C-76)进行遗传稳定性测定。5次传代后,结果显示,菌株C-75遗传稳定性较好,能够稳定保持高效价不变(达到5 528μl/L),较出发菌株L7(效价4112μL/L)提高了34.4%。

特应性皮炎患儿外周血巨噬细胞游走抑制因子及IL-17和IL-23的表达及其相关性研究

目的检测特应性皮炎(AD)患儿外周血单个核细胞(PBMCs)中巨噬细胞游走抑制因子(MIF)、IL-17和IL-23 mRNA表达水平及血清水平,并探讨其相关性。方法选择2010年4—11月在我院门诊就诊的36例AD患儿为病例组,同期在我院体检正常儿33例为对照组,采用实时荧光定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测两组受试者PBMCs中MIF、IL-17和IL-23 mRNA表达水平,酶联免疫吸附试验检测其血清MIF、IL-17和IL-23水平。结果病例组PBMCs中MIF、IL-17和IL-23 mRNA表达水平分别为(5.93±2.35)、(6.76±1.87)和(3.21±0.73),对照组分别为(1.83±0.69)、(1.77±0.51)和(0.92±0.22),病例组PBMCs中MIF、IL-17和IL-23mRNA表达水平均高于对照组(P<0.01)。病例组血清MIF、IL-17和IL-23水平分别为(34.92±8.73)μg/L、(33.29±5.70)ng/L和(54.62±9.69)ng/L,对照组分别为(9.80±2.21)μg/L、(11.71±2.08)ng/L和(18.97±4.39)ng/L,病例组血清MIF、IL-17和IL-23水平均高于对照组(P<0.01)。线性相关分析结果显示,AD患儿PBMCs中MIF mRNA表达水平(r=0.418,P=0.011)及血清MIF水平(r=0.419,P=0.011)与疾病严重程度(SCORAD)评分均呈正相关;PBMCs中MIF mRNA表达水平与IL-17 mRNA、IL-23 mRNA表达水平均呈正相关(rIL-17 mRNA=0.395,P=0.017;rIL-23 mRNA=0.422,P=0.010);血清MIF水平与IL-17、IL-23水平均呈正相关(rIL-17=0.407,P=0.014;rIL-23=0.375,P=0.024)。结论 MIF在AD患儿中高表达,且与IL-17、IL-23密切相关,炎性因子间的相互作用可能共同参与了AD的发生、发展。

以减毒沙门菌为载体布鲁氏菌DNA疫苗的构建及免疫原性分析

目的构建携带布鲁氏菌BLS-L7/L12融合基因的重组减毒沙门菌并进行免疫原性分析,为口服布鲁氏菌DNA疫苗研究奠定基础。方法将BLS-7/L12融合基因克隆到真核表达载体asd+-pVAX1,依次将重组质粒转化减毒沙门菌X3730、X4550得到重组沙门菌X4550(asd+-pVAX1-BLS-L7/L12)。以1×109CFU/只的剂量口服免疫Balb/C小鼠,3次免疫后进行免疫效果的评价。结果构建的重组减毒沙门菌质粒转染COS-7细胞经免疫组化和Western-blot试验证明BLS-L7/L12融合蛋白在细胞中得到了瞬时表达,ELISA检测到免疫小鼠血清和肠黏液中有特异性抗体IgG和sIgA产生。通过淋巴细胞增殖实验、细胞因子和CD分子测定表明DNA疫苗以诱发Th1型免疫为主。结论所构建的以重组沙门菌为载体口服布鲁氏菌DNA疫苗具有诱导特异性细胞免疫和体液免疫应答的能力,且以细胞免疫应答为主。可作为潜在的布鲁氏菌新型疫苗。