MAPK信号通路对大鼠低氧性PASMCs增殖、凋亡的调控

目的:研究低氧性大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMC)的增殖、凋亡与丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)关系。方法:用组织酶消化法获取肺动脉平滑肌细胞(PASMCs),进行原代培养;采用普通光学显微镜和免疫荧光染色法,分别鉴定PASMCs;选择处于对数生长期的4~6代PASMCs,随机分为7组进行造模:常氧对照组(N)、低氧组(H)、DMSO组(D)、U0126组(U)、SB203580组(S)、Anisomycin组(A)、Staurosporine Aglycone组(SA);N组加入10%培养基后置于常氧培养箱中,其它各组分别加入含相应药物的10%培养基后置于低氧培养箱(3%O2,5%CO2,37℃)中,造模时间均为48 h。CCK-8法检测各组PASMCs增殖情况;TUNEL法测定各组PASMCs凋亡情况。结果:与N组相比,H组PASMCs的OD值显著上调(0.990±0.041 vs 1.143±0.033,P<0.01),凋亡指数没有明显变化(4.913±0.451 vs 5.452±0.557,P>0.05);与H组相比,D组PASMCs的OD值和凋亡指数均无显著变化(1.143±0.033 vs 1.142±0.049,5.452±0.557 vs 5.402±0.651,均P>0.05);U组PASMCs的OD值下降,凋亡指数升高(1.143±0.033 vs 0.985±0.078,5.452±0.557 vs 10.145±2.545,均P<0.01);S组PASMCs OD值上调,凋亡指数明显下调(1.143±0.033 vs 1.295±0.039,5.452±0.557 vs 3.093±0.409,均P<0.01);A组PASMCs的OD值下降,凋亡指数升高(1.143±0.033 vs 0.347±0.067,5.452±0.557 vs 25.753±1.262,均P<0.01);SA组PASMCs OD值上调,凋亡指数下调(1.143±0.033 vs 1.685±0.100,5.452±0.557 vs 1.700±0.095,均P<0.01)。结论:低氧对PASMCs增殖和凋亡的调控与MAPK信号通路有关。

薄荷醇对低压低氧诱导小鼠肺动脉高压的作用及机制研究

目的 探讨薄荷醇对低压低氧诱导小鼠肺动脉高压的作用和机制。方法 健康雄性10~12周C57小鼠、瞬时受体电位通道M8基因敲除(TRPM8-/-)小鼠各40只,分为对照组、薄荷醇组、低压低氧组、低压低氧+薄荷醇组,超声测量肺动脉加速时间(PAT)和肺动脉射血时间(PET),右心导管测量右心室收缩压(RVSP),计算右心室肥厚指数(RVHI),观察肺小动脉重构(<100μm)情况,Western blot检测Krüppel样因子4(KLF-4)和增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白表达。肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)经低氧(3%氧浓度)、低氧+薄荷醇(100μmol·L^(-1))处理,测定增殖和迁移能力。结果 薄荷醇处理野生型小鼠后,PAT和PAT/PET比值增加(P<0.05),RVSP和RVHI降低(P<0.05),同时肺小动脉增厚和管腔狭窄程度减轻(P<0.05),KLF4表达增加(P<0.05)、PCNA表达降低(P<0.05);薄荷醇处理TRPM8-/-小鼠后,PAT、PAT/PET、RVSP、RVHI、KLF4、PCNA表达和肺血管重构均未见明显改变(P>0.05)。薄荷醇干预PASMCs后增殖、迁移能力下降(P<0.01、P<0.05)。结论薄荷醇可能通过TRPM8抑制PASMCs增殖、迁移,改善低压低氧诱导的小鼠肺血管重构和肺动脉高压,其机制可能与上调KLF4表达有关。

基于TMT技术对低氧与常氧条件下牦牛PASMCs的蛋白组学分析

旨在利用串联质谱标签(tandem mass tag,TMT)技术对牦牛肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)在低氧和常氧不同培养条件下的蛋白组学进行差异表达蛋白(differentially expressed proteins,DEPs)分析,进而了解高原牦牛PASMCs的DEPs。本试验采用贴壁培养法培养PASMCs,分别在低氧与常氧条件下培养72 h,然后收集细胞,提取两组细胞的总蛋白,利用TMT标记蛋白定量技术筛选DEPs进行分析,并进行GO功能注释和KEGG通路分析。在比较低氧和常氧下PASMCs的2组蛋白样品中共获得6859个蛋白,以FC(fold change)≥1.3或≤0.78,且P<0.05条件进行筛选,获得DEPs共531个,其中上调DEPs有186个,下调DEPs有345个。富集分析结果表明,DEPs主要富集在中枢碳代谢、糖酵解与糖代谢合成、HIF-1信号通路、次生代谢产物的生物合成等低氧适应相关通路中。在这些通路中发现其中有7个重要的DEPs(PGK、HK、LDH、PGAM、pfkA、IL6ST、PDK1)。亚细胞定位中质膜(28.9%)所占比例最高。结构域分析中主要以表皮生长因子样结构域为主。结果表明,DEPs分别富集在代谢、酶活性、低氧适应性等相关类别与通路中,并发现7个重要的DEPs(PGK、HK、LDH、PGAM、pfkA、IL6ST、PDK1)可能与缺氧环境的适应有关。这些结果为进一步研究牦牛PASMCs在低氧中的适应性提供了理论支持。

低氧对牦牛肺动脉平滑肌细胞增殖及氧化应激损伤作用的影响

【目的】通过研究低氧环境对牦牛(Bos grunniens)肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)增殖及氧化应激损伤的影响,初步探究牦牛肺动脉平滑肌对低氧的适应性特点。【方法】分离纯化并利用α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)鉴定牦牛PASMCs。试验分为常氧组和低氧组,采用CCK-8法检测牦牛PASMCs在低氧和常氧状态下0、2、4、6、12、24、48、72、96、120 h的增殖效率;采用ELISA法检测常氧组和低氧组培养24、48、72、96 h细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、肌酸激酶(creatine kinase,CK)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)的蛋白浓度。【结果】细胞鉴定结果表明,95%以上的细胞均能表达α-SMA,即分离纯化所得细胞为牦牛PASMCs。CCK-8结果表明,低氧组在72、96、120 h细胞增殖倍数极显著低于常氧组(P<0.01);低氧组和常氧组在72 h的细胞增殖倍数均极显著高于48 h(P<0.01),表明牦牛PASMCs在72 h出现增殖高峰,且长时间的低氧环境能够降低牦牛PASMCs增殖效率。ELISA检测结果表明,与常氧组相比,低氧组牦牛PASMCs培养上清液中LDH蛋白浓度在72 h极显著上调(P<0.01);SOD蛋白浓度在72、96 h均极显著或显著上调(P<0.01;P<0.05);CK蛋白浓度在48、72 h均显著或极显著上调(P<0.05;P<0.01);MDA蛋白浓度在72 h显著上调、96 h显著下调(P<0.05)。在低氧条件下,各时间点上清液中LDH、SOD蛋白浓度差异不显著(P>0.05),CK、MDA蛋白浓度在24、48和72 h均显著高于96 h(P<0.05)。在常氧条件下,上清液中LDH蛋白浓度在48 h显著高于24、72 h(P<0.05);SOD蛋白浓度在24、48 h均显著高于72、96 h(P<0.05);CK蛋白浓度在24 h显著高于72、96 h(P<0.05);MDA蛋白浓度在48 h显著高于72 h(P<0.05)。【结论】长时间低氧能够增强牦牛PASMCs氧化应激反应和细胞损伤,抗氧化作用减弱,细胞增殖效率显著降低,LDH、SOD、CK和MDA 4种蛋白在低氧条件下牦牛PASMCs损伤与抗损伤以及抗氧化中发挥重要调节作用,这可能与牦牛肺脏血管的低氧适应性有关。

血府逐瘀汤对缺氧条件下肺动脉平滑肌细胞增殖及培养液中NO水平的影响

目的研究血府逐瘀汤(XFZYD)对缺氧条件下肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖及培养液中NO水平的影响。方法通过建立新生牛PASMC的原代和传代培养及缺氧细胞增殖模型,采用MTT法、光镜计数观察缺氧对PASMC增殖的影响;Griss试剂法测定PASMC培养液中NO的量。结果血府逐瘀汤能显著抑制缺氧条件下PASMC增殖,高、中、低剂量组与对照组比较差异显著(P<0.05);血府逐瘀汤能显著提高缺氧条件下PASMC培养液中NO的量(P<0.05)。结论血府逐瘀汤能抑制缺氧条件下PASMC增殖;提高NO水平可能是血府逐瘀汤抑制缺氧条件下PASMC增殖作用的途径之一。

15-HETE对肺动脉平滑肌细胞钙离子浓度的影响

目的 通过阻断细胞外钙离子 (Ca2+ )内流,观察 15 羟化二十烷四烯酸 ( 15 HETE)对兔肺动脉环收缩张力和肺动脉平滑肌细胞内游离钙浓度 ( [Ca2+ ]i)的影响,探讨缺氧时 15 HETE引起细胞钙动员的机制。方法 采用组织浴槽血管环方法观察L 型钙通道阻断剂硝苯地平和无钙液对15 HETE诱导的兔肺动脉环收缩力的影响;酶法分离培养兔肺动脉平滑肌细胞,激光扫描共聚焦显微镜测定 15 HETE对细胞内 [Ca2+ ]i的作用。结果 在正常组和缺氧组, 10μmol·L-1硝苯地平和无钙液对 1μmol·L-1 15 HETE引起的肺动脉环收缩均没有影响;培养的 15 HETE组细胞 (正常培养的细胞暴露于 1 μmol·L-1 15 HETE下继续孵育 8min)与正常对照组相比,细胞内 [Ca2+ ]i明显增加 (P<0 05)。结论 15 HETE可引起肺动脉平滑肌细胞 [Ca2+ ]i增加,且此钙来源于细胞内贮钙库的释放。

参与肺动脉平滑肌细胞增殖信号转导机制及信号转导抑制剂的研究进展

肺动脉高压是一种以肺血管阻力升高为特征,最终导致右心功能严重受限、衰竭甚至死亡的慢性进展性疾病。其组织病理学改变主要以肺血管重构为特点,而肺动脉平滑肌细胞在外周血管的异常增殖是肺血管重构的主要病理基础。该文主要对参与肺动脉平滑肌细胞增殖信号转导机制及信号转导抑制剂的研究进展作一综述。

低氧、山莨菪碱对肺内小动脉平滑肌细胞产生血栓素A_2和前列环素的影响

本工作观察了急性重度低氧及山莨菪碱（anisodamine，Am）对分离培养家兔肺内小动脉平滑肌细胞（PASMCS）培养液中TXB2和6-酮-PGF1a含量及它们的比值的影响。结果是：重度低氧明显增加PASMCS培养液中TXB2和6-酮-PGF1a含量及它们的比值。常氧和低氧条件下，终浓度为2.5×10－5×mol／L的山莨菪碱显著降低TXB2的含量，但6-酮-PGF1a的含量无变化。这提示：急性重度低氧可能通过增加PASMCS产生和释放TXA2和PGI2及它们的比值而致肺血管收缩，山莨菪碱可能通过抑制PASMCs产生ThA2和降低ThB2与PGI2的比值逆转低氧所致的肺血管收缩效应。

NHE-1核酶基因转染对大鼠肺动脉平滑肌细胞凋亡的影响

目的 探讨NHE 1核酶基因转染对大鼠肺动脉平滑肌细胞 (PASMC)凋亡的影响。方法 构建NHE 1核酶基因逆转录病毒载体 ,转染体外培养的大鼠PASMC ,应用半定量RT PCR法 (sqRT PCR)测定细胞内NHE 1mRNA的表达、BCECF法测定pHi、流式细胞仪测细胞周期、电镜及原位细胞凋亡检测 (TUNEL法 )观察细胞凋亡情况。结果 转染NHE 1核酶基因的细胞 ,NHE 1mRNA表达量及pHi较空载体转染细胞及未转染细胞显著降低 ,细胞凋亡率显著增加 ,电镜示细胞凋亡 ,凋亡小体形成。结论 NHE 1核酶基因转染可通过NHE 1抑制、细胞内酸化 ,显著诱导肺动脉平滑肌细胞凋亡。

钙蛋白酶介导低氧诱导的肺动脉高压肺血管重构

目的:研究钙蛋白酶(calpain)在低氧诱导肺动脉高压肺血管重构中的作用及机制。方法:SD大鼠随机分为低氧模型组和常氧对照组。插管法测定大鼠右心室收缩压及平均肺动脉压,右心室/(左心室+室间隔)比值评价右心肥厚指数,HE染色检测血管重构情况,分别采用实时荧光定量PCR和Western印迹检测肺动脉calpain-1,-2和-4 m RNA和蛋白的表达。原代培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞分为4组:常氧对照组、常氧对照+MDL28170(calpain抑制剂)组、低氧模型组、低氧模型+MDL28170组。MTS及流式细胞术观察细胞增殖情况,实时荧光定量PCR检测Ki-67及增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)m RNA表达情况。结果:与常氧对照组大鼠比较,低氧模型组大鼠右心室收缩压、平均肺动脉压及右心肥厚指数显著增加,肺动脉血管显著重构;同时,低氧模型组大鼠肺动脉中calpain-1,-2,-4 m RNA和蛋白表达也显著上调。与常氧对照组细胞比较,低氧模型组细胞显著增殖,MDL28170可显著抑制低氧诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖,同时逆转低氧诱导的Ki-67和PCNA m RNA表达上调。结论:calpain介导低氧诱导的肺动脉高压肺血管重构,其机制可能与介导低氧诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖有关。

间尼索地平对5-羟色胺诱导大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖和迁移的影响及其机制

目的探讨间尼索地平(m-Nis)对5-羟色胺(5-HT)诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖和迁移的影响,并深入研究其作用机制。方法采用植块法培养大鼠PASMCs。实验分为6组:空白对照组、5-HT(1μmol·L-1)组,m-Nis(10-5、10-6、10-7、10-8mol.L-1)组。噻唑蓝(MTT)比色法、Transwell迁移小室法分别测定PASMCs的增殖和迁移,Western blot法检测大鼠PASMCs中增殖细胞核抗原(PCNA)的蛋白表达及细胞外信号调节激酶1和2(ERK1/2)的磷酸化水平,研究m-Nis对ERK1/2/MAPK信号通路的影响。结果不同浓度m-Nis明显抑制了5-HT诱导的大鼠PASMCs增殖(P<0.05或P<0.01)和迁移(P<0.01),并呈现一定的浓度依赖性;另外,Western blot结果显示m-Nis对5-HT诱导的大鼠PASMCs中PCNA的蛋白表达有不同程度的抑制作用(P<0.05或P<0.01),10-5,10-6,10-7mol.L-1m-Nis还明显抑制了5-HT诱导的大鼠PASMCs中ERK1/2磷酸化水平的升高,p-ERK1/2/ERK1/2比值均有不同程度地降低(P<0.05或P<0.01)。结论m-Nis对5-HT诱导的大鼠PASMCs增殖和迁移有明显的抑制作用,可能与其抑制PCNA蛋白表达及ERK1/2/MAPK信号通路有关。

黄芪皂苷Ⅱ通过阻断NOX/ROS/AKT/mTOR信号通路抑制低氧诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞增生

目的探讨黄芪皂苷Ⅱ(AS-Ⅱ)对低氧诱导的肺动脉平滑肌细胞(PASMC)过度增生的抑制作用及相关机制。方法将大鼠原代PASMC分为常氧组、低氧组、低氧联合(20、40、80)μmol/L AS-Ⅱ处理组、低氧联合还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NOX)抑制剂VAS2870处理组,在常氧(210 mL/L O_(2))或低氧(20 mL/L O_(2))条件下培养24 h。利用CCK-8法检测细胞增殖活性,二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)荧光探针检测细胞内活性氧(ROS),Western blot法检测细胞蛋白激酶B(AKT)、磷酸化的AKT(p-AKT)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化的mTOR(p-mTOR)、增殖细胞核抗原(PCNA)以及NOX1、NOX4的蛋白表达。结果与常氧组相比,低氧组PASMC明显增生,细胞内ROS含量显著升高,PCNA、p-AKT、p-mTOR、NOX1、NOX4蛋白均表达增加。AS-Ⅱ处理抑制低氧诱导的PASMC增生,降低细胞ROS水平,并抑制PCNA、p-AKT、p-mTOR、NOX1、NOX4的蛋白表达。VAS2870处理后也有类似改变。结论AS-Ⅱ抑制低氧诱导的PASMC增生,可能与阻断NOX/ROS/AKT/mTOR信号通路相关。

三种钠尿肽抑制大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖效应的比较

本文比较了心房钠尿肽 (ANP)、C 型钠尿肽 (CNP)、血管钠肽 (VNP)抑制肺动脉平滑肌细胞 (PASMCs)增殖的效应。用蛋白激酶C激动剂佛波酯 (PMA)刺激体外培养大鼠PASMCs的增殖 ,以总蛋白含量和MTT比色OD值为指标 ,观察三种钠尿肽对PMA刺激大鼠PASMCs增殖的影响。结果表明 ,PMA (10 -9～ 10 -7mol/L)显著升高(P <0 0 5 )PASMCs的总蛋白含量和MTTOD值 ,VNP (10 -8～ 10 -6mol/L)、ANP和CNP (10 -7～ 10 -6mol/L)均可显著降低 (P <0 0 5 )PMA (10 -8mol/L)刺激PASMCs的总蛋白含量和MTTOD值。结果提示 :PMA对大鼠肺动脉平滑肌细胞有促增殖作用 ,ANP、CNP、VNP均可抑制PMA刺激大鼠肺动脉平滑肌细胞的增殖 ,VNP的抑制效应最强。

酶消化法分离培养原代肺动脉平滑肌细胞及免疫组化鉴定

目的建立体外胶原酶消化法分离培养大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）及免疫鉴定的方法。方法采用I型胶原酶对PASMCs进行体外培养。在无菌环境下,分离提取雄性Sprague Dawley（SD）大鼠肺动脉主干,剥离外膜、剔除内皮细胞,经酶消化法,体外培养PASMCs。倒置相差显微镜观察PASMCs生长状态及特点;台盼兰测定细胞活力;免疫细胞染色法进行平滑肌α-肌动蛋白（α-SM actin）鉴定。结果酶消化法分离培养的PASMCs 3 d后,可见细胞贴壁呈梭形生长,6 d后生长迅速呈典型的峰-谷状生长,9 d后达90%融合。通过形态学观察及免疫荧光染色法鉴定表明：培养的细胞为PASMCs;细胞存活率为98.5%;原代培养8-10 d后即可传代,3-10代细胞生长迅速、细胞形态不易发生改变,可用于进行细胞实验。结论采用I型胶原酶消化法简单易行、可靠、PASMCs生长迅速、传代周期短的特点;尤为重要的是,培养的原代PASMCs可用于肺动脉高压和肺血管重构的研究工作。

TLR-4信号通路对COPD大鼠肺动脉平滑肌细胞合成分泌IFN-γ、PDGF-AB的影响

目的:探讨TLR-4信号通路在COPD大鼠肺动脉平滑肌细胞合成分泌IFN-γ、PDGF-AB中的作用。方法:消化、分离及纯化COPD大鼠原代肺动脉平滑肌细胞(PASMCs),并随机分为:对照组、LPS组、TLR-4抑制剂组(TAK242)、LPS+TAK242组;RT-PCR、Western blot法检测各组PASMCs中TLR4和NF-κB的基因表达水平;ELISA法检测PASMCs上清液中IFN-γ、PDGF-AB的水平。结果:与对照组比较,LPS组TLR-4和NF-κB的基因表达水平及上清液中IFN-γ、PDGF-AB的表达水平显著升高(P<0.05),而TAK242组显著降低(P<0.05);使用TAK242预处理后,再给予相同浓度LPS刺激,与LPS组相比,其表达水平显著下降(P<0.05)。结论 :LPS介导的TLR4信号通路参与COPD大鼠PASMCs合成分泌IFN-γ、PDGF-AB因子的调控,进而影响炎症反应及肺血管重塑。本实验为临床早期干预COPD提供了理论依据。

血小板生长因子(PDGF-BB)刺激体外培养兔肺动脉平滑肌细胞DNA和蛋白质合成

应用细胞培养、３Ｈ－ＴｄＲ和３Ｈ－Ｌｅｕｃｉｎｅ掺入方法，观察血小板生长因子ＢＢ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒＢＢ）对体外培养兔肺动脉平滑肌细胞ＤＮＡ和蛋白质合成的影响。结果表明：（１）当ＰＤＧＦ－ＢＢ浓度为１０ｎｇ／ｍｌ时，３Ｈ－ＴｄＲ掺入值已较对照组显著增高（６２６２．５±４１２．９ｖｓ８３３．５±１２４．０，Ｐ＜０．０５）；当ＰＤＧＦ－ＢＢ浓度为２０ｎｇ／ｍｌ时，３Ｈ－Ｌｅｕｃｉｎｅ掺入值亦较对照线显著增高（１０２１２．８±６３８．３ｖｓ７３４０．３±１１９７．９，Ｐ＜０．０５）。（２）ＰＤＧＦ－ＢＢ浓度在５－２５ｎｇ／ｍｌ范围内，３Ｈ－ＴｄＲ，３Ｈ－Ｌｅｕｃｉｎｅ掺入值与剂量直线相关（ｒＤＮＡ＝０．９７，ｒｐｒｏｔ＝０．９０Ｐ＜０．０５）。说明ＰＤＧＦ－ＢＢ刺激体外培养兔肺动脉平滑肌细胞ＤＮＡ和蛋白质合成。

慢性低氧性肺动脉高压鼠原代培养肺动脉平滑肌细胞内钙的检定

用共聚焦激光扫描显微镜观察经Ｆｌｕｏ－３／ＡＭ负荷的慢性低氧性肺动脉高压（ＨＰＨ）大鼠原代培养的肺动脉平滑肌细胞（ＰＡＳＭＣ）的形态与内游离Ｃａ２＋浓度的动态变化。结果表明：原代培养的（ＨＰＨ）大鼠的ＰＡＳＭＣ与正常大鼠相比，①细胞内游离Ｃａ２＋浓度增加，但其收缩性减弱；②随培养日数增加，咖啡因（Ｃａｆｅｉｎ）所致的细胞内储钙池－肌浆网的Ｃａ２＋释放作用逐渐减弱，直至消失；③血管紧张素Ⅱ（ＡＴ－Ⅱ）升高细胞内钙作用明显增强；④部分呈大红色细胞对多种缩血管物质敏感性增强。结果提示，ＨＰＨ大鼠的ＰＡＳＭＣ的内钙明显增加，其调节机制处于紊乱状态。

AQP1促进肺动脉平滑肌细胞的增殖与迁移

肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)的迁移和增殖是肺动脉重塑进而造成肺动脉高压的主要病理基础。水通道蛋白1(AQP1)具有促进上皮细胞、内皮细胞迁移的作用,但机制不清。由于AQP1也表达于血管平滑肌细胞,推测AQP1可能参与缺氧诱导的PASMCs增殖及迁移。通过PCR和免疫印迹分析,检测AQP的表达以及缺氧对AQP表达水平的影响,并通过细胞迁移以及增殖实验观察AQP1在缺氧诱导的PASMCs迁移与增殖中的作用。AQP1在PASMCs和主动脉平滑肌细胞(Ao SMCs)均表达,但缺氧只增加PASMCs中AQP1的表达,以及促进PASMCs的迁移与增殖。敲除AQP1可抑制PASMCs的增殖以及缺氧诱导的细胞增殖和迁移。过表达AQP1促进PASMCs的增殖和迁移。缺氧促进β联蛋白在PASMCs内的表达。敲除β联蛋白后,抑制Ad AQP1所介导的PASMCs迁移与增殖。这些结果表明,缺氧可促进AQP1在肺动脉内的表达,AQP1可通过β联蛋白对PASMCs的增殖和迁移进行调节。

miR-206在大鼠肺动脉高压模型中的表达和意义

目的探讨miR-206在大鼠肺动脉高压(pulmonary hypertension,PH)模型中的表达和意义。方法构建肺动脉高压大鼠模型,按缺氧暴露时间分别标记为(1、7、14、21和28 d)组,并将常压常氧(FIO2为0.21)作为对照组(n=5),提取大鼠右下肺叶组织及外周血,实时定量PCR检测miR-206表达;分离大鼠原代肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cell,PASMC),以miR-206 mimics转染细胞并进行缺氧暴露,检测细胞增殖能力。生物信息学分析发现并选择缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor,HIF)-1α作为miR-206的候选靶基因,以双荧光素酶报告实验验证miR-206是否可直接调控HIF-1α,共转染miR-206mimics与HIF-1α过表达质粒,检测PASMC细胞增殖能力变化。结果与对照组相比,大鼠肺组织中miR-206的表达在缺氧暴露后即可出现miR-206表达降低(P <0.05),大鼠血清miR-206亦明显降低(P <0.05);缺氧暴露后的大鼠肺组织分离培养的PASMC miR-206表达与对照组相比也明显降低(P <0.05),miR-206低表达时PASMC增殖能力明显增加(P <0.05);miR-206 mimics转染可拮抗因缺氧暴露引起的PASMC增殖能力增加(P <0.05)。生物信息学发现HIF-1α的3’非编码区(3’ untranslated region,3'UTR)具有miR-206的结合位点,用miR-206和HIF-1α(野生型3'UTR)共转染的PASMC中荧光素酶报告基因活性较对照组显著下调(P <0.05),而miR-206 mimics和HIF-1α(突变型3'UTR)共转染组则较对照组无明显统计学差异。共转染miR-206 mimics后,HIF-1α上调引起的细胞增殖被逆转(P <0.05)。结论缺氧诱导的miR-206下调通过靶向PASMC中的HIF-1α途径来促进PH,miR-206可能是缺氧诱导PH早期的触发因素。

NHE-1反义RNA对大鼠肺动脉平滑肌细胞凋亡的影响

目的 探讨NHE 1反义RNA对大鼠肺动脉平滑肌细胞 (PASMC)凋亡的影响。方法 构建NHE 1反义RNA逆转录病毒载体 ,转染体外培养的大鼠PASMC ,应用半定量RT PCR法 (sqRT PCR)测定细胞内NHE 1mRNA的表达、BCECF法测定pHi、流式细胞仪测细胞周期、电镜及原位细胞凋亡检测 (TUNEL法 )观察细胞凋亡情况。 结果 转染NHE 1反义RNA逆转录病毒载体的细胞 ,NHE 1mRNA表达量及pHi较空载体转染细胞及未转染细胞显著降低 ,细胞凋亡率显著增加 ,电镜示细胞凋亡 ,凋亡小体形成。结论 抑制NHE 1可通过引起细胞内酸化 ,诱导肺动脉平滑肌细胞凋亡。