蛇床子素通过调控miR⁃26a表达对人牙周膜干细胞生物学特性的影响

目的探究蛇床子素通过调控miR-26a表达对人牙周膜干细胞(PDLSCs)生物学特性的影响及其相关机制。方法体外培养PDLSCs细胞,以不同浓度蛇床子素(0、1×10^(-4)、1×10^(-5)、1×10^(-6)、1×10^(-7)mol/L)进行干预,筛选适宜浓度;另将细胞分为蛇床子素(1×10^(-5)mol/L)+anti-miR-NC组、蛇床子素(1×10^(-5)mol/L)+anti-miR-26a组。采用甲基噻唑基四唑(MTT)法检测细胞活力和增殖能力,Transwell实验检测细胞迁移能力,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-26a表达,蛋白质印迹(Western blot)法检测细胞增殖核抗原Ki67(Ki-67)、增殖细胞核抗原(PCNA)、基质金属蛋白酶(MMP2)、基质金属蛋白酶(MMP9)蛋白表达。结果与对照组比较,1×10^(-5)mol/L蛇床子素组细胞OD值、迁移数、miR-26a表达和Ki-67、PCNA蛋白表达升高(P<0.05),MMP2、MMP9蛋白表达降低(P<0.05)。与蛇床子素+anti-miR-NC组比较,蛇床子素+anti-miR-26a组细胞OD值、迁移数、miR-26a表达和Ki-67、PCNA蛋白表达降低(P<0.05),MMP2、MMP9蛋白表达升高(P<0.05)。结论蛇床子素可能通过上调miR-26a表达促进PDLSCs细胞的增殖和迁移。

牙周膜干细胞用于犬牙槽嵴组织工程化增高的实验研究

目的:探讨牙周膜干细胞复合生物支架材料增高重建牙槽嵴效果,为缺牙后牙槽嵴重度萎缩的种植义齿修复奠定基础。方法:分离培养牙周膜干细胞(PDLSCs),将其分别与骨组织工程支架材料羟基磷灰石-磷酸三钙(HA/TCP)及附着龈组织工程材料脱细胞真皮基质(ADM)复合诱导后,植入犬双尖牙缺失致牙槽嵴缺损部位,PDLSCs-HA/TCP植入骨缺损区,PDLSCs-ADM植入粘骨膜缺损区。植入32周,大体测量植入前后增高牙槽嵴高度;X-线片显示牙槽嵴高度与密度变化;组织学观察边界区新生牙槽骨结构,未植入做对照。结果:细胞-材料复合体植入后牙槽嵴高度显著增高,由移植前4.15±0.20,增加到移植后9.30±0.15(P<0.05)。x-线显示邻牙标记部位冠方有类骨密度硬组织形成,牙槽嵴明显增高。组织学显示:与对照组比较,细胞材料移植组可见缺损区有新生骨样组织形成,可见骨陷窝和骨细胞样结构。结论:PDLSCs分别与骨及粘骨膜组织工程支架材料HA/TCP、ADM复合后体内移植,可显著增高牙槽嵴高度,是牙槽嵴增高重建、实现无牙合种植修复的有效途径。

牙周膜干细胞中乙酰基转移酶MORF调控成骨的研究

目的:比较正常与炎症来源牙周膜干细胞(H-PDLSCs与P-PDLSCs)中乙酰基转移酶MORF表达水平的差异及其对PDLSCs分化的调控。方法:有限稀释法培养H-PDLSCs与P-PDLSCs,LPS、TNF-α、IL-β及三者混合物体外模拟炎症微环境诱导H-PDLSCs(IP-PDLSCs);基因与蛋白检测方法对比2种来源PDLSCs中MORF的表达水平;蛋白检测方法检测IPPDLSCs中MORF的表达水平;基因、蛋白检测与茜素红染色方法对比H-PDLSCs及下调MORF基因后的PDLSCs成骨基因表达的差异。结果:与H-PDLSCs相比,P-PDLSCs中MORF的表达显著下降(P<0.05);IP-PDLSCs中MORF的表达下降;MORF基因被下调后,PDLSCs成骨能力下降(P<0.05)。结论:牙周炎及炎症微环境会导致PDLSCs中MORF表达的下降,从而使其成骨分化受到抑制。

miR-124靶向OSX对牙周膜干细胞成骨分化能力的调控作用

目的:探索miR-124对人牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)成骨分化能力的影响及调控机制。方法:分离、纯化培养人PDLSCs,检测牙PDLSCs成骨诱导前后miR-124和Osterix(OSX)的表达;转染miR-124沉默(inhibitor)及过表达模拟物(mimics);实时定量PCR(q PCR)检测miR-124和OSXm RNA水平的表达;Western blot检测OSX蛋白水平的变化,茜素红染色分析PDLSCs成骨分化能力的变化;生物信息学手段分析miR-124的靶基因,并通过双荧光素酶报告实验进行验证;共转染miR-124 inhibitor和OSX小干扰RNA(siRNA),检测共转染后对PDLSCs成骨分化能力及OSX表达的影响。结果:成骨分化诱导后PDLSCs中miR-124的表达明显下调,而OSX的表达则显著升高;过表达miR-124可明显抑制OSX的表达和PDLSCs的成骨分化能力,抑制miR-124的表达,则结果相反;生物信息学手段分析OSX为miR-124的潜在靶基因,双荧光素酶报告实验验证miR-124的靶基因为OSX;沉默OSX可逆转miR-124 inhibitor对PDLSCs成骨分化能力的促进作用。结论:miR-124可靶向调控OSX对PDLSCs成骨分化能力产生抑制作用,提示miR-124在PDLSCs组织修复再生过程中发挥重要作用。

牙周膜干细胞聚合体：一种潜在骨组织再生方法

目的:探索牙周膜干细胞的成骨能力。方法:体外培养牙周膜干细胞(PDLSCs),经体外鉴定、扩增构建PDLSCs细胞膜片(CS)和细胞聚合体(CP),通过大体观察、HE和免疫组化染色、扫描电镜进行形态学检测,实时定量PCR检测CS和CP成骨相关基因的表达水平,并观察裸鼠体内成骨能力。结果:成功分离、培养并鉴定PDLSCs后,构建PDLSCs CS和CP。组织学观察发现CP内细胞外基质丰富;免疫组化染色发现这些细胞外基质中骨涎蛋白(BSP)、碱性磷酸酶(ALP)和I型胶原表达呈阳性;CP上BSP、ALP和Runx2基因表达水平明显高于CS;体内实验发现CP组大量骨样组织形成,而CS组可见纤维样骨组织形成。结论:PDLSCs细胞聚合体技术为修复牙槽骨缺损提供了一种新的方法。

釉原蛋白对牙周膜干细胞迁移、黏附及增殖的影响

目的:检测釉原蛋白(amelogenin,AML)对牙周膜干细胞(PDLSCs)迁移、黏附和增殖的影响。方法:用0.25、50和100μg/ml的AML培养人PDLSCs。用划痕实验和transwell法检测AML对PDLSCs迁移的影响。用黏附实验检测AML对PDLSCs黏附的影响。用MTT法和计数法检测AML对PDLSCs增殖的影响。结果:AML可促进PDLSCs的迁移,而且呈剂量效应关系(P<0.05)。AML对PDLSCs迁移和黏附有促进作用(P<0.05),且随培养时间延长而增加。AML可促进PDLSCs的增殖,且呈剂量效应关系。结论:AML可促进PDLSCs的迁移、黏附和增殖。

TNF-α调控牙周膜干细胞骨向分化中LncRNA的差异表达

目的:探讨肿瘤坏死因子-α(TNF-α)对人牙周膜干细胞(PDLSCs)成骨作用的影响,以及其中长链非编码(LncRNA)的差异表达情况。方法:分离培养PDLSCs,对照组细胞用成骨诱导液培养,实验组细胞用成骨诱导液+10 ng/ml TNF-α培养。通过茜素红染色、RT-PCR和Western bolt检测两组细胞骨向分化,用高通量测序技术探究LncRNA的差异表达情况。结果:在TNF-α作用下,PDLSCs的骨向分化能力减弱;测序结果发现差异表达显著的长链非编码RNA上调的有57条,下调的有26条。结论:LncRNA可能与PDLSCs骨向分化的调控密切相关。

长链非编码RNAlinc-01135对静态牵张力作用下人炎症牙周膜干细胞成骨分化的影响

目的:研究长链非编码RNA linc-01135对12%静态牵张力(SMS)作用下人炎症牙周膜干细胞(P-PDLSCs)成骨分化的影响。方法:分离培养人正常牙周膜干细胞(H-PDLSCs)和P-PDLSCs,RT-PCR检测linc-01135的表达水平以及慢病毒上调及下调linc-01135表达后进行12%SMS加载的成骨基因变化,成骨诱导21 d茜素红染色检测成骨能力变化。结果:P-PDLSCs中linc-01135表达降低,利用慢病毒上调linc-01135的表达后进行12%SMS加载,RUNX2,ALP,OPG的表达明显上升(P<0.001);下调linc-01135的表达后,RUNX2、ALP、OPG的表达明显下降(P<0.001)。结论:inc-01135可以促进人炎症牙周膜干细胞在12%SMS作用下的成骨分化。

miR-20a对人炎症牙周膜干细胞成骨分化能力的影响

目的:研究miR-20a对人炎症牙周膜干细胞成骨分化能力的影响。方法:分离培养人牙周膜干细胞后用qRT-PCR检测miR-20a的表达,并且在瞬时转染miR-20a mimics和inhibitor后成骨诱导,用茜素红染色,Western Blot和PCR的方法检测成骨能力的改变。结果:人炎症牙周膜干细胞中miR-20a表达降低,转染mimics后成骨能力升高,转染inhibitor后成骨能力降低。结论:miR-20a可以促进人炎症牙周膜干细胞成骨分化。

LncRNA-7460调控炎症来源牙周膜干细胞成骨分化的研究

目的:探讨长链非编码RNA(lncRNA)在牙周膜干细胞成骨分化过程中的调控作用。方法:运用实时荧光定量聚合酶链反应实验(q PCR)观察表达量在成骨分化前后发生明显变化的lncRNA,筛选得到成骨相关的lncRNA-7460。运用慢病毒分别上调、下调炎症来源牙周膜间充质干细胞(PPDLSCs)内的lncRNA-7460,q PCR检测成骨相关基因mRNA的变化,用碱性磷酸酶(ALP)染色、ALP活性测定、茜素红染色等方法验证PPLDSCs成骨状态。数据进行统计学处理。结果:在PPDLSCs中上调lncRNA-7460引起成骨相关基因的表达上升,ALP活性增高,形成更多的钙结节;下调lncRNA-7460导致成骨相关基因表达下降,细胞ALP活性和成骨结节形成能力降低。结论:lncRNA-7460可以在体外培养中促进PPDLSCs的成骨分化能力。

釉基质蛋白诱导不同生理性根吸收期乳牙牙周膜干细胞向成牙骨质细胞方向分化的研究

目的:检测釉基质蛋白(EMD)诱导乳牙生理性根吸收不同时期的牙周膜干细胞(PDLSCs)向成牙骨质细胞方向分化的能力及矿化相关蛋白表达水平的变化。方法:选取根吸收早期(E组)、中晚期(M组)的乳牙和恒前磨牙(P组)作为组织来源,并分离培养其PDLSCs;然后再将各组PDLSCs分为2个亚组:实验组用含100 mg/mL EMD的DMEM诱导培养,对照组用DMEM培养;并于诱导7 d后检测各组细胞中CAP、CEMP-1及BSP、OCN、ALP、COL-1表达水平的差异。结果:各组细胞经EMD诱导培养7 d后,实时定量PCR检测结果显示,与对照组相比,各实验组PDLSCs中BSP、ALP、COL-1的表达水平均显著上调(P <0. 05),升高幅度为P组> E组> M组; P、E、M各实验组PDLSCs中CAP、CEMP-1 mRNA的表达水平为P组> E、M组(P <0. 05),E组与M组间无统计学差异(P> 0. 05); BSP、OCN的表达水平均为P组> E组> M组(P <0. 05); ALP的表达水平为P组> E、M组(P <0. 05),E组和M组间无统计学差异(P> 0. 05); COL-1的表达水平在各实验组间相比无统计学差异(P> 0. 05)。免疫组化染色结果显示,P、E、M各实验组PDLSCs中BSP、OCN、ALP、COL-1均呈阳性表达,对照组则显示染色不显著。结论:EMD可诱导乳牙PDLSCs向成牙骨质细胞方向分化。随着乳牙生理性根吸收的进行,乳牙PDLSCs向成牙骨质细胞方向分化的能力及矿化相关蛋白的表达水平均逐渐降低。