长白与青海八眉“二元杂交”猪种群PERV亚型分析

目的研究长白与青海八眉"二元杂交"猪种群携带的内源性逆转录病毒(porcine endogenous retrovirus,PERV)亚型,为评价从猪到人异种移植的生物安全性提供依据。方法从长白与青海八眉"二元杂交"猪种群中随机采集33头个体外周血,应用PCR和RT-PCR技术分别检测PERV前病毒DNA和mRNA,研究该种群携带PERV的亚型,并对PCR扩增的灵敏性进行评估。克隆测序该猪种PERVenv基因,结果用NCBI中的BLAST软件进行分析。结果所检测的33头个体均带有PERV前病毒DNA,外周血中均有PERV mRNA表达,其中,69.7%(23/33)个体携带env-A,env-B和env-C三种囊膜蛋白基因,而其余的30.3%(10/33)个体只带有env-A和env-B两种囊膜蛋白基因,env-C基因缺失。灵敏性分析实验结果表明,PCR扩增PERV时,DNA模板不能少于15ng。克隆env-A,env-B和env-C基因,结果提交GenBank(GenBank登录号分别为DQ856326、DQ856327、DQ856328)。生物信息分析结果表明,该猪种env基因与GenBank登录其他猪种序列相比存在差异,其中env-A、env-B基因发生移码突变,蛋白合成提前终止。结论长白与青海八眉"二元杂交"猪种群携带PERV,69.7%个体为PERV-ABC亚型;缺失突变使PERVenv-A,env-B基因阅读框发生改变,有可能影响其感染特性,从生物安全性方面综合考虑,该猪种不宜作为异种移植供体。

广西巴马小型猪PERV-env基因克隆及其组织表达谱分析

目的克隆广西巴马小型猪PERV-env部分基因,并研究其在不同组织中的表达差异。方法利用RT-PCR方法从巴马小型猪外周血白细胞中扩增PERV-env基因,并与部分国内外已发表的PERV-env基因序列进行同源性及遗传进化分析。以扩增获得的广西巴马小型猪PERV-env基因为模板设计引物,利用半定量RT-PCR的方法对广西巴马小型猪不同组织中PERV mRNA表达情况进行分析。结果在所检测的9个组织样品中PERV mRNA相对表达水平存在差异,肾及外周血淋巴细胞中PERV mRNA丰度最高,肺、心、肝、脾、胸腺、卵巢次之,且表达丰度差异不显著(P>0.05),胰腺PERV mRNA表达丰度最低。结论以巴马小型猪胰岛细胞进行异种移植发生PERV感染的潜在危险性可能要低于其它器官,但仍需进一步研究证实。

PERV病毒在异种移植中的感染风险及预防对策

猪与人体在器官结构、生理解剖上相似性高,被认为是最佳的异种移植供体,能够有效解决人类供体器官短缺的问题。猪内源性逆转录病毒(porcine endogenous retrovirus, PERV)是一种C型逆转录病毒,以一种前病毒DNA的形式整合在猪的细胞基因组中,随细胞染色体的复制而复制,无法通过无特定病原体(specific pathogen-free, SPF)培育消除,其在异种移植中具有潜在的感染风险。了解PERV的特性,探索PERV预防策略,将有助于猪作为异种移植供体在临床的应用。

PERV的整合对HEK293细胞中HERV-W mRNA表达的影响

目的明确PERV的整合是否影响HEK293细胞中HERV-W各基因表达水平。方法根据GenBank中登录的基因序列,分别设计HERV-W gag、HERV-W pol、HERV-Wenv、syncytin-1和humanβ-actin引物,并分别建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法,用于检测HEK293、HEK293-PERV中各基因mRNA的表达。结果本研究建立的检测方法均具有良好的特异性、敏感性和稳定性,标准曲线的相关系数大于0.99,扩增效率介于95%~110%,可用于检测。结论检测结果经2^(-△△Ct)分析后,发现与对照相比,PERV整合后的HEK293-PERV中HERV-Wgag、HERV-Wpol、HERV-Wenv和syncytin-1 mRNA相对表达量分别升高37.08倍、42.56倍、2.49倍和13.17倍,为进一步明确PERV在异种移植中的安全性提供参考。

湖南沙子岭猪内源性逆转录病毒的研究

为评价从猪到人异种移植的生物安全性提供依据,从湖南沙子岭猪的保种群内随机采集31头个体的耳样组织,应用PCR和RT-PCR技术分别检测这些组织中内源性逆转录病毒(porcine endogenous retrovirus,PERV)的前病毒DNA和mRNA,并对PCR扩增的灵敏性进行评估。多组织RT-PCR检测3头沙子岭猪肾、心、肝、肺、脾等组织中PERV的表达情况,了解其在各组织中的分布情况;最后,扩增、测序该猪种的env基因,结果用NCBI中的BLAST软件进行分析。PCR和RT-PCR结果表明,所检测的31头沙子岭猪均带有PERV前病毒DNA,耳样组织中均有PERV mRNA表达,其中有2头个体携带env-A、env-B、env-C3种囊膜蛋白基因,而其余的29头个体只带有env-Ae、nv-B两种囊膜蛋白基因,未检测到env-C基因。多组织RT-PCR扩增结果表明,3头沙子岭猪的肾、心、肝、肺、脾等组织中,pol、gage、nv-A、env-B基因均有表达,未检测到env-C基因表达。测序沙子岭猪的env基因,结果发现,沙子岭猪env-B和env-C基因与其他猪种序列比较分别存在2和10个碱基的差异,而env-A基因序列没有差异,说明不同的猪种之间env基因存在多态性。以上结果表明,沙子岭猪种群携带PERV,其亚型主要以PERV-A,B为主;PERV在该猪种肾、心、肝、肺、脾等多种组织中的分布没有明显组织特异性,且93.5%(29/31)个体表现为env-C基因缺失,提示沙子岭猪作为候选猪种可能在异种移植中具有较好的应用前景。

内源性逆转录病毒在五指山小型猪体内存在状况的分子微生物学调查

根据猪内源性逆转录病毒(PERV)的核心蛋白(gag)基因、多聚酶(pol)基因、囊膜(env)基因和β-肌动素(β-actin)基因核酸序列设计并筛选特异性引物6对,利用PCR方法对五指山小型猪PERVgag、pol和env基因存在情况进行系统检测;利用半定量RT-PCR方法对五指山小型猪PERVgag、pol和env基因在心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉7个组织中的表达情况进行系统检测与分析。结果显示,在202个被检样品中,gag、pol基因和envB基因亚型均存在,envA基因亚型仅3个样品未发现,envC基因亚型共检出34个,检出率为16.8%。所测试的7个组织均表达gag、pol和env基因序列,但envC仅在1头个体的组织中表达。各组织gag mRNA丰度以肾脏为最高,其次为肺、心、肝、脾,脑和肌肉组织的丰度最低。各组织pol mRNA丰度以肾脏为最高,其次为脾、肺、肝、心,肌肉和脑组织的丰度最低。各组织envA、envB mRNA丰度信号强度分布与gag、pol信号类似,亦以肾脏为最高,脑和肌肉组织的丰度最低。各组织envC mRNA的信号强度明显低于envA、envB。以上结果表明,在五指山小型猪中存在PERV,且在各组织中的表达量有差异。

广西巴马小型猪内源性反转录病毒进化年代分析

【目的】确定广西巴马小型猪内源性反转录病毒(PERV-BM)的进化年代。【方法】对先前扩增、测序获得的9个PERV-BM的LTRs,一个PERV-BM全长基因组序列,登录号为HM159246及Gen Bank上发表的所有背景清楚的猪内源性反转录病毒(PERV)的LTRs及env序列进行分析。首先利用DAMBE软件对上述序列比对分析,合并同源性较高的,筛选有差异代表性的核酸序列的数据集。然后利用MEGA5.2软件Neighbor-Joining方法计算PERV-BM遗传进化关系。利用DAMBE软件对上述筛选的序列集进行替换饱和度计算,分析核酸进化速率的稳定性;利用MEGA5.2软件,通过最大相似法对筛选数据制作的遗传进化树进行分子钟行为分析。最后对广西封闭群内的广西巴马小型猪3′-LTR序列进行替代饱和度及分子钟分析,对符合分子钟行为的LTRs序列,以假设的恒定进化速率计算PERV-BM的进化年代。【结果】经过DAMBE软件分析后,选出80多个Gen Bank上发表的有代表性的env、LTRs序列数据集。对PERV-BM(HM159246)序列全长遗传进化分析显示,PERV-BM与中国的PERV核酸序列EF133960和GU980187,荷兰的AF356697亲缘关系较近,与韩国的HQ540595和美国的AF038600和NC_003059亲缘关系则较远。利用DAMBE软件对筛选数据集替换饱和度检测结果显示,S和V值随PERV序列之间进化分歧的增加呈线性的增加。LTRs序列数据集替换饱和曲线呈线性关系,没有替换饱和现象发生,LTRs的进化随时间持续且稳定。数据集env序列替换饱和曲线不完全呈线性关系,表明env序列集进化速率不稳定。利用MEGA5.2的最大相似法对LTRs和env数据集的进化树进行分子钟行为检测结果显示,LTRs序列集接受分子钟假说,env进化不符合分子钟行为,这和不饱和度检测的结果一致。因此可用LTRs进化的近分子钟行为进行PERV进化年代的计算。利用DAMBE软件对广西封闭群内的广西巴马小型猪3′-LTR序列进行替代饱和度及分子钟分析结果显示,3′-LTR的进化符合分子钟行为可用于进化年代计算。假设以灵长类ERV的积累突变率,每个核苷酸每年的替换率2.3×10-9—5.0×10-9,计算PERV-BM约进化于3.3×106—7.1×106年前。【结论】PERV-BM进化年代与欧洲小型猪PERV进化时间7.6×106年前相近。

猪内源性反转录病毒5′端非编码区的克隆及结构分析

通过五指山猪内源性反转录病毒5′端非编码区(5′UTR)cDNA的克隆,分析其一级结构和调控元件,为进一步研究其在PERV复制、转录中的调控机制奠定基础。本研究采用cDNA末端快速扩增技术(RACE)获得全长约1035bp的PERV 5′UTR。通过NCBI公共数据库BLASTn序列进行同源性分析,并应用KEGG数据库对该转录调控区进行顺式作用元件定位分析,结果发现PERV 5′UTR与GenBank公布的部分PERV 5′UTR相比较,同源性在82.6~94.8%之间。一级结构分析发现PERV 5′UTR由U3、R、U5区、引物结合区(PBS)及前导序列组成,可能的核心启动子序列与具有增强子作用的39bp重复序列分别位于U3区的-67^+1与-97^-59区段。在5′UTR转录调控区(-428^+507)鉴定出31个有效的顺式作用元件位点,其中NF-Y、TBP、Oct-1、HSF、GATA-1和GATA-2等与PERV的转录、调控密切相关。

四种小型猪内源性逆转录病毒基因研究

目的检测四种小型猪在内源性逆转录病毒基因(PERV)拷贝数上的差异,试图找出不含或含有较低拷贝数的个体或品种。方法采用半定量PCR方法检测了我国四种小型猪内源性逆转录病毒基因的拷贝数。结果贵州小型猪、五指山猪、西藏小型猪、巴马小型猪的PERV的拷贝数分别是34.12±16.96,29.38±13.83,28.71±14.11,27.12±14.43(F=0.614,P=0.609),EnvA的拷贝数分别是9.78±5.48,10.06±5.34,10.23±5.71,10.51±6.23(F=0.044,P=0.988),EnvB的拷贝数分别是24.14±11.26,20.72±8.36,18.35±8.50,17.60±8.65(F=1.512,P=0.221)。尚不能认为四个猪种间PERV、EnvA、EnvB的拷贝数之间的差异具有统计学意义。结论四种常用的小型猪内源病毒负载量较低,表明其用于异种器官移植研究的可行性。

异种器官移植:前景如何?

目前异种器官移植在进入临床的过程中存在两大难题———免疫排斥和病原微生物感染 .人类为防止免疫排斥而采取的措施使超急性排斥得到了很大程度的避免 ,但大大增加了器官移植受体感染病原微生物的机会 .猪作为人类理想的器官供体 ,却有多种内源性病毒 ,其中猪内源性逆转录病毒 (PERV)引起了人类较大的关注 .PERV的跨种感染存在正、反两方面的证据 。

超高压脱细胞组织工程血管支架的实验研究

目的采用新的更安全的抗原去除技术-超高压脱细胞方法处理同种异体血管,观察该方法的脱细胞效果以及猪内源性逆转录病毒(PERV)的去除情况。方法无菌条件下取出猪降主动脉血管,用10 000atm超高静水压(4℃冷方压)将供体来源细胞压碎,结合酶的消化作用,PBS的搅拌洗涤,脱去细胞残片形成血管生物支架。对该支架脱细胞效果进行组织学评估、超微结构观察、检测DNA含量同时检测PERV。结果组织学显示超高压脱细胞方法可完全除去血管支架内的供体细胞成分,经超高压脱细胞处理后DNA含量显著降低(p<0．0001)、PERV被成功灭活。结论超高压脱细胞方法可为我们提供更安全可靠的组织工程血管支架。

中国版纳微型猪近交系内源性逆转录病毒酶活性的定量检测

采用 Roche公司的 RT(Reverse transcriptase,RT)检测试剂盒 ,按其操作步骤进行 ,用 HIV- 1作为试剂盒的阳性参照绘制标准曲线 ,PK15作为猪内源性逆转录病毒 (Porcine endogenous retrovirus,PERV)的阳性对照 ,定量检测 34头中国版纳微型猪近交系 (Banna minipig inbreed,BMI)血浆中表达的 PERV的逆转录酶。各猪RT结果均于 4 0 5 nm处测定 OD值 ,用 HIV- 1的实测标准曲线进行定量 (pg/ m l)。检测结果表明全部 34头猪均为阳性反应 ,但各猪血浆中有活性的酶远低于 HIV- 1,也弱于

猪内源性逆转录病毒基因在版纳微型猪近交系骨髓间充质干细胞永生细胞系的整合和表达研究

目的检测猪内源性逆转录病毒(PERV)在猪细胞长期传代过程中的基因整合和表达。方法通过提取已建立的版纳微型猪近交系(BM I)骨髓间充质干细胞(M SC s)永生细胞系的DNA及细胞总RNA,用PCR、RT-PCR方法检测PERV前病毒gag、po l和env基因的整合和表达,并对PERV的亚型进行鉴定。结果从原代BM I-M SC s至连续传代到150、180代的BM I-M SC s细胞基因组中都检测到了PERV前病毒DNA的整合及其mRNA的表达,PERV亚型为PERV-A、B型。结论PERV在BM I近交过程中及猪细胞体外长期传代过程中均未消失,PERV基因已经整合入其天然宿主的基因组内并能稳定表达。

应用PCR和RT-PCR检测猪内源性逆转录病毒及其意义

目的 观察猪内源性逆转录病毒 (Porcineendogenousretrovirus ,PERV)在中国实验小型猪的感染情况。方法 针对PREVgag区的序列 ,选用特异性引物 ,采用PCR方法检测猪肝脏、皮肤前病毒序列 ;以及RT PCR方法检测血清中PERV RNA序列。结果 该法在猪肝脏组织中可检测出PERV前病毒序列 ;此外 ,在猪血清标本亦检测出病毒序列 ,而其它 2份HBV、HCV阳性血清及 2份其它动物血清 (大鼠、兔 )检测结果均为阴性 ,说明该方法特异性较高。结论 中国实验小型猪均携带该病毒 ,并可以释放到血清中 ;采用该法具有特异、简便的特点 。

多基因编辑猪-猴心脏、肝脏、肾脏移植临床前研究初步报道

目的探讨目前国际上基因改造程度最大的基因编辑猪在临床前异种器官移植中的应用前景。方法将1只猪内源性逆转录病毒(PERV)敲除联合3种主要异种抗原基因敲除以及抑制补体活化、调节凝血紊乱、抗炎抗吞噬的9种人源化基因转入猪(PERV-KO/3-KO/9-TG)作为供体,获取其心脏、肝脏和肾脏,分别移植给3只恒河猴受体,建立猪-猴异种器官移植临床前研究模型。观察血流重建后各移植物的功能状态并总结受体存活情况;监测移植物的血流动力学情况;比较各器官移植受体的血液学指标变化;观察移植物组织病理学表现。结果血流重建后各移植器官颜色红润、质地柔软、血流灌注状态良好。术后1 d,移植心脏、肝脏和肾脏均表现为动、静脉血流状态充盈,灌注情况良好。心脏、肝脏和肾脏移植受体的术后存活时间分别为7 d、26 d和1 d。心脏移植受体术后1 d肌酸激酶、肌酸激酶同工酶以及乳酸脱氢酶水平均升高,至术后6 d逐渐恢复至接近正常水平。术后7 d各项指标均急剧升高。肝脏移植受体术后2 d天冬氨酸转氨酶水平升高,术后10 d转氨酶基本恢复正常,但总胆红素持续升高。术后12 d天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶水平均出现升高,至术后15 d达到高峰。肾脏移植受体术后1 d出现轻微蛋白尿,后因突发严重心律失常死亡。组织病理学显示心脏和肾脏移植物组织结构接近正常,移植肝脏表现为片状坏死,肝组织结构出现紊乱,并伴有炎症损伤、间质出血和血栓性微血管病形成。结论PERV-KO/3-KO/9-TG猪在克服超急性排斥反应、缓解体液性排斥反应及凝血紊乱方面具有一定优势,但其能否作为临床异种器官移植潜在供体需进一步评估。

猪逆转录病毒与生物人工肝及细胞移植

生物人工肝是近年国内外治疗重型肝炎及肝脏功能衰竭的研究热点,猪肝细胞因其来源广泛、功能稳定、解剖及生理与人相近、不易患病等优点成为目前生物人工肝及细胞移植使用较多的生物材料之一,但自报道猪内源性逆转录病毒(porcineendogenousretrovirus熏PERV)感染体外培养人细胞以来,跨种族间感染越来越引起人们的重视。本文拟就该病毒在生物人工肝及细胞移植中的研究进展综述如下。

五指山小型猪近交系异种移植产业化研发进展

为了早日实现五指山小型猪(WZSP)近交系异种移植产业化目标,努力推进近交繁育获得近交系,同时开展克服异种移植免疫排斥和猪内源性逆转录病毒(PERV)传染生物安全性两大难题的研发内容。本文从WZSP近交系双基因敲除克隆猪繁育成功、猪-猴异种角膜内皮移植取得突破性进展、WZSP近交系PERV无传染性群体建立、WZSP近交系是理想的动物模型和异种移植供体等方面,介绍WZSP近交系异种移植产业化的研发进展。

中国两头乌猪品种内源性逆转录病毒基因研究

目的对5个中国两头乌猪品种(通城猪、东山猪、沙子岭猪、赣西两头乌猪和金华猪)及3个国外品种(大白猪、长白猪和杜洛克猪)猪内源性逆转录病毒(PERV)的核心蛋白(gag)基因、多聚酶(pol)基因、囊膜(env)基因的3个亚型A、B、C,分别从DNA和RNA水平上进行研究,以发现中国两头乌猪品种在异种器官移植中的资源优势。方法利用PCR方法在DNA水平上对PERV基因的三个亚型进行鉴定,并通过半定量PCR方法在RNA水平上检测通城猪和大白猪PERV各亚型在心、肝、脾、肺、肾、肌肉、脂肪、淋巴和脑组织中的表达谱。结果4个华中两头乌猪种中env-AB型为主要PERV亚型,分别占被测总数的92%～100%。在这4个品种中均没有检测到C亚型,金华猪以及3个国外猪种中均检测到了C亚型,病毒亚型种类也更丰富。半定量PCR实验结果显示gag、pol基因在两个品种9个组织中广泛表达,env-A在通城猪的心、肝、肺、脂肪和淋巴组织中表达量较低,env-B在通城猪的心脏和淋巴组织中表达量较低,而env-B在大白猪的肾脏中表达很低,其他所测8个组织中表达量都较高。结论通城猪、东山猪、赣西两头乌猪和沙子岭猪可以做为较佳的异种移植候选供体,具有良好的应用前景。

上海梅山猪封闭群内源性逆转录病毒的检测及亚型分析

为检测分析上海梅山猪携带猪内源性逆转录病毒(porcine endogenous retrovirus,PERV)的情况,为该猪种作为器官移植供体的生物安全性提供现实依据,笔者从上海嘉定区梅山猪育种中心的梅山猪封闭群内随机采集45头猪的耳组织,并构建耳成纤维细胞系,利用PCR检测PERV前病毒核心蛋白基因(gag)、多聚酶基因(pol)以及囊膜基因(env)的基因组DNA,利用RT-PCR的方法检测m RNA表达状况。结果发现被检测的45份样品均携带完整的3种亚型的PERV前病毒DNA;RT-PCR结果显示,45份样品中有40份同时有PERV-A和PERV-B两种亚型的表达,还有5份样品仅检测到PERV-B亚型的表达,未检测到PERV-C亚型的表达。鉴于生物安全性方面的考虑,该猪种能否作为人异种移植的供体仍有待进一步商榷。

猪内源性逆转录病毒对异种组织器官移植影响的研究进展

猪内源性逆转录病毒(Porcine en-dogenous retrovirus,PERV)是新发现的对人细胞具有感染性的且存在于正常猪体内的病毒,在异种组织器官移植过程中可能向人传播,直接威胁到接受移植者的健康甚至生命,这是异种组织器官移植首要克服的难题。由于PERV近年来才受到广泛关注,所以人们对PERV的分类,对人类和其他动物的危害性及病原的检测均不能完全确定。文章旨在提供上述几方面的研究现状,以期为PERV的深入研究奠定基础。PERV能影响移植受体的生殖,抑制受体免疫体系;对其他物种的细胞或活体都可能产生体外和体内感染性;目前有多种PERV检测方法,为受体和供体的病毒监控提供了依据。