聚苯乙烯-二乙烯苯接枝聚乙二醇催化合成对硝基苯甲醚

探素了诸因素对制备催化剂过程的影响，合成出了聚苯乙烯－二乙烯苯接枝PEG－400并以此为三相转移催化剂。研究了对硝基苯甲醚的合成工艺，考察了催化剂，氢氧化钠、甲醇用量等对反应转化率的影响，建立了较佳合成工艺条件，即:n(PNCB):n(CH3OH):n(NaOH):n(PEG-400)=1:3:3:0.03-0.05,反应温度－80℃，反应时间9－10h。该条件下，对硝基氯苯转化率＞99．5％，以对硝基氯苯计，对硝基苯甲醚收率＞95％，气相色谱分析产品纯度99．7％。聚苯乙烯－二乙烯苯接枝PEG－400催化剂可重复使用5次以上，母液除盐后用于配碱对反应无不良影响。

羰基还原酶与甲酸脱氢酶偶联催化制备(R)-苯基乙二醇

以重组菌E.coli Rosetta/pETDuet-rcr-fdh全细胞为催化剂,2-羟基苯乙酮和甲酸钠为双底物,研究了生物催化反应体系中温度、pH值、底物2-羟基苯乙酮的初始浓度、反应时间、细胞浓度和状态等对产物(R)-苯基乙二醇生成效率的影响规律.结果表明,在温度35℃和pH7.0、底物初始浓度6g/L、时间36h、湿细胞浓度10%(ω)的条件下,产物的光学纯度高达98.37%e.e.,得率达79.14%.在上述反应体系中添加5mmol/LZnSO4后,重组菌催化的不对称还原反应效率显著提高,产物(R)-苯基乙二醇光学纯度达到100%e.e.,得率高达86.3%.

1(R),2(R)-二(2-苯并咪唑)乙二醇四核铜(Ⅱ)配合物的合成与晶体结构

合成了一种新配合物1(R),2(R)-二(2-苯并咪唑)乙二醇四核铜犤Cu4(bbmed)4Cl2L2犦·Cl2(CH3OH)5(H2O)2(L=MeOH或H2O,Hbbmed=1(R),2(R)-二(2-苯并咪唑)乙二醇,bbmed表示去质子后的配体)(简称Cu?-bbmed)。该晶体经X-射线衍射确定为正交晶系,空间群C2221(20),晶胞参数a=1.7424(5),b=2.4942(7),c=3.8887(11)nm,V=16.900(8)nm3,Z=4,Dc=1.427g·cm-3,F(000)=7472。并对它进行了元素分析、IR、1HNMR及ESR表征。

伴有辅酶原位再生的胞外酶耦合法制备(R)-苯基乙二醇

经5轮诱变筛选,从近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis CICC1676)中分离得到产NADH依赖型羰基还原酶(Carbonyl reductase,CR)菌株CP-9。所产羰基还原酶(CRCp-9)经两步快速纯化获得纯化倍数为11.5倍,比活力为1.84 U/mg的酶液,其还原反应的最适pH值为6.5,最适温度为40℃。该酶转化β-羟基苯乙酮制备手性化合物(R)-苯基乙二醇,因此是(R)-专一性羰基还原酶。该酶与NADH普适性再生酶-甲酸脱氢酶(Formate dehydrogenase,FDH)在胞外相耦联,构建伴有辅酶再生与反复利用的CR/FDH双酶催化制备立体醇体系,底物β-羟基苯乙酮转化率达95.4%,产物(R)-苯基乙二醇得率为93%,辅酶的总转化数(Total turn number,TTN)达267,产物e.e.值为98.6%,批次耦合反应生产能力达0.8 g/L/h,较单酶催化有较大提高,与细胞转化法相比也具有较好的生产能力。因此,伴有辅酶再生的胞外酶耦合催化具有潜在的制备手性醇化合物的工业应用价值。

绿豆环氧水解酶催化对硝基苯乙烯氧化物的对映归一性水解

利用绿豆环氧水解酶催化(R,S)-对硝基苯乙烯氧化物水解,产物(R)-对硝基苯乙二醇的产率超过常规酶促拆分的极限产率(50%),表明发生了对映体会聚.采用绿豆粉剂和粗酶制剂考察了不同条件下的生物催化反应,结果表明,添加吐温-80作为分散剂对反应有促进作用.对该酶的固定化进行了初步研究,发现酶经硅藻土吸附固定化后稳定性显著增加.在克级规模制备实验中,产物的总产率达73.3%;产物经一步重结晶,得到了光学纯度大于99%的(R)-对硝基苯乙二醇.

相转移催化合成2，4－二硝基苯磺酸钠

本文以ＰＥＧ作相转移催化剂，在碱性水溶液中，以亚硫酸钠为磺化剂，对２，４－二硝基氯苯进行磺化，收率达８７％，与目前广泛采用的氧化镁催化磺化法相比，提高收率４０％左右。

含咪唑的手型二苯基乙二醇衍生物的合成及其在不对称催化中的应用

以光学纯的(1R,2R)-1,2-二苯基乙二醇和1-甲基-2-氯甲基咪唑盐酸盐为原料,通过醚化保护、取代、脱保护等一系列反应,合成了一种新颖的含氮、氧的手性配体(1R,2R)-2-((1-甲基咪唑基)甲氧基)-1,2-二苯基乙醇,并将其应用于二乙基锌对苯甲醛不对称加成反应中,所得产物e.e.值38%。

纳米粒子固定化双酶耦合体系连续催化制备(R)-苯基乙二醇

将活化醇盐水解法制备的SiO2纳米粒子分别与羰基还原酶（CR）和甲酸脱氢酶（FDH）进行共价固定化,固定化CR与FDH耦合,连续催化转化b-羟基苯乙酮制备（R）-苯基乙二醇,考察了NADH的再生与循环利用性.结果表明,纳米粒子固定化CR和FDH酶载量分别为3.32和5.55 mg/g,催化活性为游离酶的50%～60%,最适反应p H值分别为6.5和8.5,最适反应温度分别为40和45℃.耦合体系进行12批次反应,产物（R）-苯基乙二醇累积量达35.6 g/L,纳米粒子生产能力达178 g/g.纳米粒子固定化酶经简单离心收集后可重复利用.

源于红豆的羰基还原酶在(R)-苯基乙二醇制备中的应用

采取研磨、离心分离、多层过滤和丙酮沉析等步骤,从红豆中提取具有不对称还原芳香酮能力的羰基还原酶(CR),经快速分离纯化获得了纯化倍数为5.8倍的红豆源CRrb酶液,考察了其酶学特性,与微生物源CR的酶学特性进行比较,将CRrb与甲酸脱氢酶(FDH)耦合构建CRrb/FDH双酶体系连续催化β-羟基苯乙酮制备(R)-苯基乙二醇.结果表明,源于红豆的CRrb最适反应pH值为6.0,最适反应温度为45℃,在40～60℃范围内耐热性好于一般微生物源CR.CRrb的米氏常数Km=5.68 mmol/L,最大反应速率Vmax=20.21μmol/(min·m L),对底物的亲和力和催化效率比微生物源CR好.底物较佳耐受浓度为60 mmol/L,较微生物源的CR高.CRrb/FDH酶活比为1:1.5时耦合体系反应效率最佳,批次反应转化1 mol辅酶可获得产物的量由266 mol提高到365 mol.

一株高效不对称还原产生(R)-苯基乙二醇的菌株筛选、鉴定及全细胞催化体系

R）-苯基乙二醇是合成许多光学活性药物的重要手性中间体，其制备具有重要的现实意义. 以α-羟基苯乙酮为底物，从土壤中筛选得到一株能够立体选择性催化α-羟基苯乙酮产生（R）-苯基乙二醇的细菌菌株HBU-SI7. 经形态学观察和16S rDNA序列分析，鉴定此转化菌株为红球菌属菌株Rhodococcus sp. 菌株全细胞催化体系研究表明在邻苯二甲酸二丁酯-磷酸盐缓冲液（V：V = 1：3）的两相催化体系下，菌体转化α-羟基苯乙酮的最优浓度为3.0 g/L，转化率高达96.2%，e.e值为99.3%. 本研究建立的红球菌全细胞催化还原体系对（R）-苯基乙二醇的高效制备具有潜在的研究和应用价值. （图6 表2 参20）

mRNA翻译起始区二级结构优化提高(R)-羰基还原酶的表达及催化效率

为了提高近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis CCTCC M203011)的(R)-羰基还原酶在大肠杆菌中的表达水平及催化效率,对酶编码基因mRNA翻译起始区中+1～+78区进行二级结构的优化,并构建了相应的突变体。优化后mRNA翻译起始区的发夹结构明显减少,自由能显著下降(由原始的?9.5kcal/mol降至?5.0kcal/mol),使酶蛋白的表达水平及粗酶比活力分别比优化前提高了4～5倍和61.9%。在高底物浓度(5.0g/L2-羟基苯乙酮)下,优化突变株不对称转化效率较高,产物(R)-苯基乙二醇的光学纯度和产率分别为93.1%e.e.和81.8%,比优化前提高了27.5%和40.5%。研究结果表明:优化mRNA翻译起始区的二级结构,克服蛋白翻译启动的空间位阻,不仅能促进翻译的顺利进行,使目标蛋白得到高效表达,而且有利于蛋白空间结构的正确折叠,有效提高酶蛋白活力及生物催化功能。

一种新的高立体选择性羰基还原酶的性质及分离

从近平滑假丝酵母(CandidaparapsilosisCCTCC203011)中分离得到了新的NADPH依赖型羰基还原酶。粗酶经硫铵分级沉淀、DEAESepharose离子交换层析、Phenyl-sepharoseFF疏水层析、BlueSepharoseFF亲和层析后在SDS-PAGE上显示为单一条带,其酶蛋白的相对分子质量为30kD。该酶还原反应的最适pH值为4.5,最适温度为35℃,Cu2+对羰基还原酶有强烈的抑制作用。该酶具有较高的底物专一性和立体选择性,对α-羟基苯乙酮和4-氯乙酰乙酸乙酯具有较高的不对称还原活力,其产物分别为(S)-苯基乙二醇和(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯,e.e值分别为100%和94.3%。因此该酶蛋白是不对称合成手性醇有效的生物催化剂之一。经LC-MASS-MASS分析得到了酶蛋白中一个肽段的氨基酸序列,通过比对发现该酶与假定蛋白(hypotheticalproteinCaO19.10414)具有一定的同源性。

米拉贝隆的合成研究

对硝基苯乙腈分别经过硝基还原、腈基还原,再与(R)-氧化苯乙烯加成反应得到米拉贝隆的关键中间体(R)-2-((4-氨基苯乙基)氨基)-1-苯乙醇,(R)-2-((4-氨基苯乙基)氨基)-1-苯乙醇在2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)和N,N-二异丙基乙胺(DIEA)作用下与2-氨基噻唑-4-乙酸缩合得到治疗膀胱过度活动症药物米拉贝隆,总收率为67%。

一种新的手性多齿配体的合成

以反-1,2-二苯乙烯、叔丁基二甲基氯硅烷和溴代二甘醇单甲醚为原料,经保护、醚化、去保护、取代等反应合成了一种新的手性多齿配体(1R,2R)-1,2-二苯基-2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基乙基-2-吡啶甲酸酯,并通过NMR、LCMS和元素分析测试技术对目标化合物的结构进行了表征。

一种新的具有C_2对称轴的含N,O的手性多齿配体的合成

以(1R,2R)-1,2-二苯基乙二醇和2-甲氧基-4,6-二氯-1,3,5-三嗪为原料,经保护、取代和去保护反应合成了一种新的手性多齿配体——2-甲氧基-4,6-二[(1R,2R)-1,2-二苯基-2-羟基乙氧基]-1,3,5-三嗪,其结构经1HNMR,13CNMR,IR及LC-MS表征。

新型手性多齿配体的合成

以氰脲酰氯和(1R,2R)-1,2二-苯基乙二醇为原料,通过醚化、保护、取代、脱保护等一系列反应,合成了3种新颖的的含氮手性配体,并通过了IR、LCMS、1HNMR、13CNMR的结构表征。该类反应具有条件温和、后处理简单、产率较高等优点。

新型含氮手性配体的合成

以氰尿酰氯和(1R,2R)-1,2-二苯基乙二醇为原料,采用威廉姆森醚化法,合成了几种新颖的含氮手性配体。该类反应具有后处理简单、条件温和、产率高等优点。产物用1HNMR、13CNMR、MS进行了结构表征。

一种含三嗪单元多齿手性配体的合成

以(R,R)-1,2-二苯基乙二醇和氰尿酰氯为原料,经保护、醚化、去保护、取代等反应合成了一种新的手性多齿配体2-乙氧基-4-(2-甲氧基-乙氧基)-6-((1R,2R)-1,2-二苯基-2-甲氧基-乙氧基)-1,3,5-三嗪,并通过1H NMR、LCMS和元素分析测试技术对目标化合物的结构进行了表征。

有机溶剂/缓冲液双相体系中绿豆环氧化物水解酶催化环氧苯乙烯不对称水解反应

研究了有机溶剂/缓冲液双相体系中绿豆环氧化物水解酶高立体选择性地催化外消旋环氧苯乙烯水解生成(R)-苯基乙二醇反应.结果表明,与单水相反应体系相比,有机溶剂/缓冲液双相反应体系不仅有效地抑制环氧苯乙烯的非酶水解反应,而且明显提高底物的浓度,产物的收率和ee值更高.在所考察的不同有机溶剂中,正己烷不仅能较好地溶解底物,而且对酶的毒性较小,从而导致反应的初速率较快,产物的收率和ee值较高,是最适宜有机相.在两相体积比(正己烷/缓冲液)为1:1,底物浓度为20mmol/L,缓冲液pH=6.5以及35oC的最适反应条件下,反应的初速率、产物的收率和ee值分别为5.42mmol/(L·h),49.2%和94.3%.