近平滑假丝酵母(R)-羰基还原酶在大肠杆菌中的外泌表达及高效转化(R)-苯基乙二醇

克隆了近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)(R)-羰基还原酶基因rcr,构建胞外表达工程茵Escherichia coli BL21(DE3)/pET20b-rcr,实现了(R)-羰基还原酶在大肠杆菌中高效外泌表达,周质空间和发酵液酶的比活力分别达0.68 U/mg和0.26 U/mg,与大肠杆菌的胞内体系重组酶相比,酶的比活力提高了近两倍。为了更好地促进该重组酶的外分泌于大肠杆菌细胞外,通过添加温和型化学渗透剂甘氨酸,改善细胞壁的透性,(R)-羰基还原酶的活力提高至1.99 U,与添加甘氨酸前相比,酶活力提高了12.4倍,比活提高了4.3倍。浓缩后的发酵液催化2-羟基苯乙酮,产生(R)-苯基乙二醇,产率为88.1%,e.e.值为93.9%。与胞内重组酶相比,产率和光学纯度分别提高了44.4%和15.9%。本研究通过构建(R)-羰基还原酶的大肠杆菌分泌表达体系,大幅度提高了(R)-羰基还原酶的比活和生物转化手性醇的效率。

mRNA翻译起始区二级结构优化提高(R)-羰基还原酶的表达及催化效率

为了提高近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis CCTCC M203011)的(R)-羰基还原酶在大肠杆菌中的表达水平及催化效率,对酶编码基因mRNA翻译起始区中+1～+78区进行二级结构的优化,并构建了相应的突变体。优化后mRNA翻译起始区的发夹结构明显减少,自由能显著下降(由原始的?9.5kcal/mol降至?5.0kcal/mol),使酶蛋白的表达水平及粗酶比活力分别比优化前提高了4～5倍和61.9%。在高底物浓度(5.0g/L2-羟基苯乙酮)下,优化突变株不对称转化效率较高,产物(R)-苯基乙二醇的光学纯度和产率分别为93.1%e.e.和81.8%,比优化前提高了27.5%和40.5%。研究结果表明:优化mRNA翻译起始区的二级结构,克服蛋白翻译启动的空间位阻,不仅能促进翻译的顺利进行,使目标蛋白得到高效表达,而且有利于蛋白空间结构的正确折叠,有效提高酶蛋白活力及生物催化功能。