苯乙酮转化为(S)-a-苯乙醇的工程菌构建

【背景】(S)-a-苯乙醇是一种重要的药物合成中间体,利用工程菌将苯乙酮转化为(S)-a-苯乙醇的方法具有立体选择性强、转化条件温和等优势,该研究对未来绿色工业化生产有重要意义。【目的】构建能将苯乙酮转化为(S)-a-苯乙醇的工程菌并对其转化条件进行研究。【方法】分别从红平红球菌(Rhodococcuserythropolis)和博伊丁假丝酵母(Candidaboidinii)中克隆得到羰基还原酶基因ReADH以及甲酸脱氢酶基因FDH,构建pRSFDuet-ReADH-FDH(R1F2)和pRSFDuet-FDH-ReADH (F1R2)两个共表达载体,分别在大肠杆菌中表达。测定R1F2和F1R2中ReADH和FDH酶活性及其催化反应的最适反应条件。对利用全细胞转化苯乙酮为(S)-a-苯乙醇反应条件进行研究。【结果】构建了R1F2和F1R2两个共表达载体,其中R1F2中ReADH和FDH的酶活性分别为6.7 U/mL和7.6 U/mL,对苯乙酮有更强的催化还原能力。R1F2中ReADH和FDH的最适pH分别为6.0和8.5,最适温度分别为40°C和35°C。R1F2全细胞转化苯乙酮反应的最适pH和温度分别为7.5和30°C,对高底物有较强耐受性,对400 mmol/L苯乙酮转化率大于98%,产物(S)-α-苯乙醇的光学纯度大于99%。【结论】研究获得的工程菌及其全细胞转化条件为工业应用奠定了基础。

树脂吸附对红酵母催化苯乙酮不对称还原反应的促进作用

以红酵母静息细胞催化苯乙酮不对称还原合成(S)-α-苯乙醇为模型反应,研究了在反应体系中加入吸附树脂对反应的影响.结果表明,水相中较高浓度(>50mmol/L)的苯乙酮对红酵母细胞具有显著毒性;加入适量的吸附树脂可以降低水相中苯乙酮的浓度从而减小对细胞的毒害作用.考察了3种不同极性的吸附树脂(HZ-801,HZ-806和HZ-816)对底物和产物的吸附能力,发现在3种树脂中疏水性最强的HZ-816树脂对反应底物和产物具有相对较高的吸附能力.进一步研究结果表明,当底物浓度为100mmol/L,细胞湿重为500g/L时,与不加树脂的对照实验相比,加入100g/LHZ-816树脂后,使得48h的反应转化率从54%提高到91%,与此同时细胞的死亡率从99%下降为10%.含有产物的树脂经乙醇解吸后即可循环使用.