富含γ-氨基丁酸的萌发红小豆对T2DM小鼠肠道菌群的影响

为了研究富含GABA萌发红小豆对2型糖尿病(Diabetes Mellitus Type 2,T2DM)小鼠血糖水平及肠道菌群的影响,采用C57BL/6J小鼠为研究对象,通过高脂膳食+链脲菌素(Streptozocin,STZ)注射构建T2DM模型,选择不同剂量的富含GABA萌发红小豆对T2DM小鼠连续膳食干预6周,并利用16S rRNA测序技术对T2DM小鼠盲肠内容物的菌群结构和分布进行鉴定。结果显示:不同剂量富含GABA红小豆膳食干预可使T2DM小鼠FBG值明显下降,其中高剂量富含GABA红小豆(TF3)组FBG值为8.36±0.78 mmol/L,相比模型组(M)下降54.09%,干预效果最好。此外,TF3膳食可引起T2DM小鼠肠道菌群丰度发生显著(P<0.05)改变,门水平上Firmicutes丰度为35.96%,比M模型组下降53.17%,并可显著上调Bacteroidetes、Verrucomicrobia的菌群丰度(P<0.05)。表明TF3膳食改善糖脂代谢与Bacteroidetes、Verrucomicrobia优势菌丰度呈正相关,暗示高剂量富含GABA红小豆膳食可通过增加有益菌来缓解T2DM小鼠高血糖症状,为进一步解释T2DM与肠道菌群的关系提供参考。

富含γ-氨基丁酸红小豆对2型糖尿病小鼠糖脂代谢的调节作用

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)是世界范围内最普遍代谢性疾病,已成为全球流行的健康问题。豆类为基础的饮食有助于预防和控制T2DM发生及发展。为了研究富含γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)红小豆的健康效应,该研究构建T2DM模型,对富含GABA红小豆膳食干预的小鼠糖脂代谢水平、肝功能相关指标进行分析。结果显示,高剂量富含GABA红小豆组(TF3)对抵抗超重具有一定效果,且可显著降低空腹血糖水平(P<0.05),恢复机体对血糖的调节能力,减轻胰岛素抵抗。与M组相比,各处理组不同程度降低T2DM小鼠血清中总胆固醇、甘油三酯、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素和肌酐水平,其中TF3及阳性对照组平衡血糖及调节T2DM小鼠肝肾损伤效果更好,同时可缓解高脂饮食造成的肝脏、胰腺和盲肠组织病理性损伤。表明富含GABA红小豆膳食可改善T2DM小鼠糖脂代谢水平,并可缓解肝脏、胰腺和盲肠组织病理性损伤。该研究为富含GABA功能食品研发及应用提供理论依据。

响应面法优化屎肠球菌T2-2产γ-氨基丁酸的发酵条件

从传统腌制芥菜中筛选获得高产γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)的屎肠球菌T2-2为研究对象,通过单因素实验和响应面法优化菌株发酵条件,提高GABA产量。结果表明:屎肠球菌T2-2产GABA最佳发酵条件为:温度30℃,屎肠球菌T2-2添加量7.50%,L-谷氨酸钠添加量18.93 g/L,pH 6.0,时间1 d,此时菌体生长量为0.338,酶活为3.177μg/mL,GABA产量为1.190 mg/mL,较优化前提高63.01%。本研究为提高乳酸菌产GABA含量提供一定的理论依据。

植物乳植杆菌BXM2产γ-氨基丁酸的发酵条件优化及特性研究

为了得到较高产量的γ-氨基丁酸(Gamma-Aminobutyric Acid,GABA)发酵工艺,采用单因素实验和响应面优化法对植物乳植杆菌BXM2产GABA的发酵条件进行优化,并分析菌株BXM2的耐酸、耐胆盐能力。实验结果表明,产GABA最优发酵条件为菌种接种量3.7%、发酵温度37℃、发酵时间32.2 h,在该发酵条件下,菌株BXM2产GABA含量高达479.23μg·g^(-1)。耐酸、耐胆盐实验结果表明,在不同pH值和含有不同浓度胆盐的MRS培养基中培养2 h,其活菌数均超过1×10^(5)CFU·mL^(-1)。菌株BXM2具有较强的耐胆盐、耐酸能力,在优化发酵条件下可高产GABA,对开发GABA功能性食品具有重要意义。

设计改造羧酸还原酶合成医药中间体(S)-2-氨基丁醇

(S)-2-氨基丁醇同时具有羟基及氨基官能团,是多种重要药物分子的关键手性中间体,生物合成(S)-2-氨基丁醇尚缺少有效的酶元件。以塞格尼氏菌(Segniliparus rugosus)来源的羧酸还原酶SrCAR为研究对象,通过对实验室已有SrCAR突变文库进行筛选测试,结合活性位点共进化分析,同时利用组合活性中心饱和突变策略(Combinatorial active-site saturation test,CAST)构建新的突变体文库,经测试最终获得优势突变体XH7(G430V/E533F/A627N)。该突变体催化底物N-Boc-(S)-2-氨基丁酸到醛产物的活性(kcat/Km)较野生型SrCAR提高2.1倍,热熔值(Tm)提升2.3℃。进一步通过引入荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)来源的醇脱氢酶PfADH,可还原N-Boc-(S)-2-氨基丁醛到醇产物。XH7和PfADH的双酶共表达体系反应5 h即可将20 mmol/L底物实现几乎完全转化,转化率达到99%,并经脱Boc保护与分离纯化获得终产物(S)-2-氨基丁醇,得率为60%。通过分子动力学模拟解析最优突变体活性及热稳定性提高的分子机制,为SrCAR酶设计改造提供新的研究思路,拓展酶法合成(S)-2氨基丁醇的生物酶工具箱,可为类似高附加值医药中间体的生物合成提供理论和实践指导。

过量表达甲酸脱氢酶提高大肠杆菌合成L-2-氨基丁酸的效率

为了实现L-2-氨基丁酸(L-ABA)的高效生物合成,借助pACYCDuet-1和pET28a共表达系统,构建了携带L-苏氨酸脱氨酶(L-TD)、L-亮氨酸脱氢酶(L-L-DH)和不同活性甲酸脱氢酶(FDH)编码基因的重组大肠杆菌,分别命名为:E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-Ec TD-Es LeuDH:pET28a-Cb FDH和E.coli BL21(DE3)/p ACYCDuet-1-Ec TD-Es Leu DH:p ET28a-Cb FDH^(M)。经诱导表达后,L-苏氨酸脱氨酶和L-亮氨酸脱氢酶在两个重组大肠杆菌中的表达水平基本一致,而后者的甲酸脱氢酶酶活表达水平为(342.00±9.40)IU/mL,显著高于前者的(196.00±6.20)IU/mL。在50 mL反应体系中,200 mmol/L L-苏氨酸经220 r/min、30℃下反应6 h时,前者L-ABA得率为71%,后者为85%。结果表明,提高甲酸脱氢酶的表达水平可以显著提高L-ABA的合成效率。此外,优化反应温度后,在35℃下反应6 h时,L-ABA的得率可达90%。

γ-氨基丁酸B型受体活性对慢性应激大鼠下丘脑神经元超微结构的影响

目的:观察γ-氨基丁酸B型受体(GABA_(B)R)活性对慢性应激大鼠下丘脑神经元超微结构的影响。方法:Wistar大鼠60只,分为对照组(control)、应激组(stress)、应激结合2-羟基萨氯酚(2-OH-saclofen)给药组(stress+2-OH-saclofen)、应激结合氯苯氨丁酸(baclofen)给药组(stress+baclofen)。采用间歇低频电击大鼠足底并联合噪声的方式建立应激大鼠模型,同时2-羟基萨氯酚(100μg/kg)或氯苯氨丁酸(0.04 g/kg)分别经大鼠腹腔注射。应激40 d后,对处于不同应激阶段的大鼠进行取材。在透射电镜下观察下丘脑神经元超微结构的变化;用高效液相色谱法(HPLC)检测大鼠下丘脑内NE和DA含量的变化。结果:在透射电镜下观察发现,单纯应激组、应激结合氯苯氨丁酸给药组与正常对照组相比较,大鼠下丘脑神经元的超微结构出现不同程度的退行性变化;相反应激结合2-羟基萨氯酚给药组下丘脑神经元超微结构则未出现退行性改变。用(HPLC)检测大鼠下丘脑内NE和DA含量发现,与正常对照组相比,单纯应激组NE含量明显升高但呈现下降趋势,DA含量则呈上升趋势(P<0.05)。应激结合氯苯氨丁酸给药组NE和DA含量呈上升趋势(P<0.05)。应激结合2-羟基萨氯酚给药组NE和DA含量却接近正常水平。结论:GABA B受体抑制剂2-羟基萨氯酚对慢性应激大鼠下丘脑神经元有保护作用,而GABA B受体激动剂氯苯氨丁酸则有损害作用。

2-氨基丁酸的酶拆分

为了得到右旋的2-氨基丁酸，对2-氨基丁酸的拆分进行了研究．通过从猪肾中提取的氨基酰化酶选择性地水解（R，S）-2-N-乙酰氨基丁酸，得到了（S）-2-氨基丁酸，旋光度=＋21．58℃（C=2，5mol／LHCl），收率为71．8％．试验结果表明最佳拆分条件为：底物浓度为0．1mol／L；底物与酶质量比为100：1；pH6．8～7．0；温度为37℃；反应时间为24h．

安神补脑软胶囊对老年失眠模型大鼠下丘脑5-羟色胺1a、5-羟色胺2a、γ-氨基丁酸表达量的影响

目的观察安神补脑软胶囊对失眠大鼠下丘脑5-羟色胺(5-HT)1a、5-HT2a、γ-氨基丁酸(GABA)含量的影响。方法采用腹腔注射对氯苯丙氨酸(PCPA)法造模。造模成功后,随机将动物分为老年模型组(模型组)、安神补脑软胶囊高中低组(安神高中低组)、地西泮组;另设青年对照组(对照组)。分别给予安神补脑软胶囊(24、12、6 g生药/kg)、地西泮(0.525 mg/kg),对照组、模型组给予相应容量的蒸馏水,连续给药7 d,荧光定量PCR检测下丘脑内5-HT1a、5-HT2a受体mRNA的表达,酶联免疫法、免疫组化法检测GABA含量。结果与模型组相比,各给药组下丘脑5-HT1a表达量明显升高,5-HT2a表达量明显降低,GABA蛋白的表达明显增多(均P<0.05)。结论安神补脑软胶囊通过调节失眠模型大鼠下丘脑中5-HT1a、5-HT2a、GABA的表达发挥治疗作用。

流动注射能量转移化学发光法测定2-氨基丁酸

在碱性条件下 ,N 溴代琥珀酰亚胺 (NBS)氧化 2 氨基丁酸 ,反应能量激发共存的荧光物质 ,产生化学发光。基于此 ,建立了一种测定痕量 2 氨基丁酸的流动注射化学发光分析方法。 2 氨基丁酸浓度在 3.0×1 0 -4～ 0 .1g/L范围内与化学发光强度呈良好的线性关系 ;对 5mg/L的 2 氨基丁酸进行 1 1次平行测定 ,相对标准偏差 (RSD)为 2 .0 % ;根据IUPAC建议 ,计算出 2 氨基丁酸检出限 (3σ)为 8× 1 0 -5g/L。将本法用于化学去龋剂中 2 氨基丁酸含量的测定 。

2-氨基丁酸的合成研究

以正丁酸和溴为原料,分别采用PB r3路线和PPA路线合成了2-溴丁酸,通过对比发现PPA路线总体优于PB r3路线,2-溴丁酸的收率为84.5%,且其最佳投料比(溴与正丁酸的摩尔比)为1.17∶1.再分别以2-溴丁酸与氨气,2-溴丁酸与氨水为起始原料制备了2-氨基丁酸,前者2-氨基丁酸的收率仅为23.2%,且难以达到反应所需条件;后者所得2-氨基丁酸经用乙醇的水溶液(水与乙醇的体积比为1∶3)重结晶,其收率为62.5%.并采用红外(IR)和核磁(1HNM R)对产品的结构进行了表征.

γ-氨基丁酸对肝癌细胞株HepG-2恶性表型的影响

目的:研究γ-氨基丁酸(GABA)对肝癌细胞株HepG-2增殖能力及恶性表型的影响。方法:用不同浓度的GABA与人肝癌细胞HepG-2作用后,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞生长速度,并测定其倍增时间,流式细胞仪检测细胞周期的改变,软琼脂细胞集落形式实验和裸鼠成瘤实验检测细胞的恶性表型。结果:MTT实验结果表明实验组细胞的生长速度明显快于对照组细胞的生长速度,且呈剂量依赖性,其细胞周期分布也发生改变,G1期细胞减少,S期细胞增多;对照组细胞和各浓度组细胞的平均倍增时间分别为39.0,30.6,30.0,27.3,26.6和38.2 h,软琼脂细胞集落形成率依次为3.2%,4.2%,5.4%,6.6%,6.5%,3.5%,Balb/c裸鼠成瘤实验显示,对照组和实验组的肿瘤平均质量依次为0.285和1.382 g,其差异有统计学意义(P<0.01)。结论:GABA能促进细胞增殖,并引起细胞恶化改变。

点饱和突变提高腈水解酶不对称合成L-2-氨基丁酸的酶活

为了提高腈水解酶催化外消旋2-氨基丁腈不对称合成L-2-氨基丁酸的能力,首先从实验室的腈水解重组大肠杆菌中筛选获得了一株立体选择性较高的菌株E.coli BL21(DE3)/p ET-28bbll6402。通过对其腈水解酶Nitbll6402进行三维结构同源模建和"热点"氨基酸分析,选择了6个位于"疏水口袋"附近的氨基酸残基(Y198、P239、P272、K251、E240和M234)进行点饱和突变,得到酶活力明显提高的突变型腈水解酶E240G和K251C。在60 mmol/L底物下,生成的L-2-氨基丁酸的e.e值均为100%,浓度分别为5.43 g/L和5.29 g/L,比原始酶分别提高了63%和59%。此结果表明,E240G或K251C的单点突变均能在不影响立体选择性的前提下不同程度的提高腈水解酶Nitbll6402合成L-2-氨基丁酸的能力,这将为利用腈水解酶催化合成L-2-氨基丁酸的进一步研究奠定重要的理论基础。

白细胞介素-2对大鼠海马谷氨酸能神经元和γ-氨基丁酸能神经元的影响———免疫组织化学和狭线杂交研究

本研究应用免疫组织化学（ＰＡＰ法）的方法，观察到侧脑室内注射白细胞介素２（ＩＬ２）后，大鼠海马回和齿状回内谷氨酸（Ｇｌｕ）免疫反应阳性神经元的数量明显减少、胞体皱缩、突起及其分支减少；γ氨基丁酸（ＧＡＢＡ）免疫反应阳性神经元的数量、突起及其分支皆减少。用３２Ｐ标记的ＧＡＢＡＴｃＤＮＡ探针对大鼠海马组织的ＧＡＢＡＴｍＲＮＡ进行狭线杂交结果显示：实验组大鼠海马组织的ＧＡＢＡＴｍＲＮＡ的含量明显增多。由于ＧＡＢＡ在ＧＡＢＡＴ的作用下，可转变为Ｇｌｕ，因此，以上结果表明ＩＬ２不仅可影响海马神经元合成和释放Ｇｌｕ和ＧＡＢＡ，而且还使Ｇｌｕ的释放量大于其合成量。

氯硝西泮预处理对癫痫大鼠海马区γ-氨基丁酸A受体γ2亚单位表达的影响

目的探讨氯硝西泮预处理对癫痫大鼠海马区γ-氨基丁酸A受体γ2亚单位(GABAARγ2)表达的影响。方法 60只健康雄性SD大鼠随机分为假手术组、癫痫组和氯硝西泮预处理组;癫痫组再分为6h、12 h、1 d、3 d、7 d、15 d和30 d 7个亚组;药物预处理组再分为假预处理组、预处理6 h、12 h和1 d亚组。药物预处理组给予氯硝西泮6 mg/(kg.d)分2次灌胃,连续5 d;然后癫痫组和预处理组通过向大鼠海马C3区注射海人酸建立颞叶癫痫模型;采用免疫组化法在相应时点检测各组大鼠海马区GABAARγ2的表达。结果与假手术组比较,癫痫组CA1区癫痫发作1 d后、CA3区癫痫发作后各时间点GABAARγ2表达明显下降(P<0.05～0.01)。与癫痫组相应亚组比较,预处理6 h、12 h亚组海马CA3区及预处理1 d亚组海马CA1区及CA3区GABAARγ2的表达明显增高(P<0.05～0.01)。结论氯硝西泮预处理可上调癫痫大鼠海马区GABAARγ2的表达。

新生期大鼠反复惊厥后海马区γ-氨基丁酸A受体α1和γ2亚单位表达的改变及其意义

目的 探讨新生期大鼠反复惊厥后海马区γ-氨基丁酸（GABA）A受体（GABAA R） α1和γ2亚单位表达的改变及其意义.方法 72只健康新生大鼠随机分为反复惊厥组（RS组）和对照组（CONT组）,两组又随机分为10日龄、35日龄、70日龄亚组,各亚组12只大鼠.通过三氟乙醚吸入诱导建立新生期大鼠反复惊厥动物模型.采用Western blot法及逆转录-PCR法检测大鼠海马区GABAAR α1和γ2亚单位蛋白及mRNA的表达.结果 与CONT组比较,RS组大鼠10日龄亚组海马区GABAARγ2亚单位蛋白表达明显降低（P ＜0.01）;35日龄亚组和70日龄亚组海马区GABAAR α1和γ2亚单位蛋白表达均明显降低（均P＜0.05）.与CONT组比较,RS组大鼠10日龄亚组、35日龄亚组和70日龄时亚组海马区GABAAR α1和γ2亚单位mRNA表达均明显降低（P ＜0.05～0.01）.结论 新生期大鼠反复惊厥后海马区GABAAR α1和γ2亚单位表达明显降低,这可能在发育期反复惊厥所致的远期GABA介导的抑制功能下降中起重要作用.

L-4-溴-2-氨基丁酸的“两锅法”合成

L-蛋氨酸经过甲基化、水解和脱水关环3步"一锅法"反应得到中间体L-α-氨基-γ-丁内酯盐酸盐,收率69.0%。再与33.7%的溴化氢乙酸溶液在耐压瓶中于70℃反应9h,得到目标化合物,收率86.2%。用核磁共振氢谱和比旋光度分析对中间产物和目标产物进行了表征,还探讨了目标化合物在室温下的不稳定性及其转化机理。

γ-氨基丁酸能去抑制对脊髓细胞外信号调节激酶2的激动作用

目的探讨脊髓γ-氨基丁酸(GABA)能去抑制对细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)活性的影响及其与痛行为改变的关系。方法正常小鼠鞘内注射(ith)比扣扣灵碱(荷包牡丹碱,bicuculline)50 ng.g-1(5μl)模拟GABA能去抑制,左后足底sc给予弗氏完全佐剂制备炎性疼痛模型,小鼠ith给予GABAA受体激动剂地西泮0.5μg.g-1(5μl)或ERK1/2抑制剂PD-98059 0.25μg.g-1(5μl)后,测定ERK1/2活性和小鼠缩足阈值。结果与正常对照组的缩足阈值(1.24±0.07)g相比,正常小鼠ith给予比扣扣灵碱50 ng.g-1的缩足阈值显著降低〔(0.42±0.17)g,P<0.05〕,给予PD-98059 0.25μg.g-1后缩足阈值显著升高〔(1.29±0.37)g,P<0.05〕。与炎性疼痛模型组的缩足阈值(0.28±0.06)g相比,炎症小鼠ith给予地西泮0.5μg.g-1的缩足阈值显著升高〔(0.99±0.12)g,P<0.05〕,且给予PD-98059 0.25μg.g-1后缩足阈值也显著升高〔(0.97±0.17)g,P<0.05〕。Western免疫印迹结果显示,与正常对照组相比,比扣扣灵碱显著提高ERK2的磷酸化水平〔(152±24)%,P<0.05〕。并且弗氏完全佐剂也可提高小鼠脊髓ERK2的磷酸化水平〔(163±42)%,P<0.05〕,ith给予地西泮0.5μg.g-1,则显著降低CFA诱发的小鼠脊髓ERK2的磷酸化水平〔(91±34)%,P<0.05〕,同时地西泮和PD-98059有效缓解炎性疼痛症状。结论 GABA能去抑制对脊髓背角ERK2有激活作用,并与炎性疼痛的形成有关。

雌激素对戊四唑致痫大鼠海马内γ-氨基丁酸和微管相关蛋白2的影响

目的分析月经性癫痫中,雌激素对大鼠海马内γ-氨基丁酸(γ-amiobutyric acid,GABA)和微管相关蛋白2(microtubule associated protein 2,MAP2)的影响。方法利用去卵巢SD大鼠,雌激素替代疗法后戊四唑致痫,对大鼠背侧海马区GABA和MAP2的免疫反应产物逆行观察。结果①实验对照组与空白对照组相比及实验给药组与实验对照组相比,背侧海马门区内GABA免疫反应阳性神经元数目均显著性减少。②海马CA1区辐射层:锥体细胞的树突的MAP2免疫活性产物粗大,垂直走行。实验给药组与实验对照组相比,阳性树突伸长、增粗、更加密集。结论雌激素使海马门区GABA含量减少,降低GABA对癫痫发作的抑制作用,增强癫痫发作的敏感性;雌激素可调节MAP2免疫活性的表达,增强海马内神经元可塑性变化,使海马内的兴奋性增强。

神经病理性疼痛大鼠脊髓背角小胶质细胞和γ-氨基丁酸B型受体2的表达

目的探讨小胶质细胞和γ-氨基丁酸B型受体2(GABABR2)在神经病理性疼痛中的作用及其可能的机制。方法选择健康雄性Sprague-Dawley大鼠48只,随机分入4组,每组12只:假手术+鞘内注射0.9%氯化钠溶液组(假手术对照组),假手术+鞘内注射米诺环素组(假手术药物组),手术+鞘内注射0.9%氯化钠溶液组(手术对照组),手术+鞘内注射米诺环素组(手术药物组)。手术对照组和手术药物组大鼠结扎L5的神经根建立神经病理性疼痛模型,假手术对照组和假手术药物组大鼠仅暴露但不结扎L5的神经根。4组大鼠按组别每天2次鞘内注射米诺环素或0.9%氯化钠溶液,通过测定大鼠各时间点的50%机械缩足阈值评价大鼠的机械痛敏,并在术后8d采用免疫荧光方法测定大鼠脊髓背角小胶质细胞和背角神经元GABABR2的表达情况。结果手术对照组和手术药物组大鼠术后1d神经根结扎侧即表现为机械异常性疼痛,术后1、3、8、16d的50%机械缩足阈值均显著低于同组术前(P值均<0.01)。手术对照组术后1、3、8、16d的50%机械缩足阈值均显著低于假手术对照组同时间点(P值均<0.01)。手术药物组术后1、3、8、16d的50%机械缩足阈值虽显著低于假手术药物组同时间点(P值均<0.05),但显著高于手术对照组同时间点(P值均<0.05)。小胶质细胞主要分布在脊髓背角浅层Ⅰ至Ⅳ层。术后8d,手术对照组大鼠术侧脊髓背角小胶质细胞平均光密度值显著高于同组健侧和假手术对照组术侧(P值均<0.01);手术药物组大鼠术侧脊髓背角小胶质细胞平均光密度值虽显著高于假手术药物组术侧和同组健侧(P值均<0.01),但显著低于手术对照组术侧(P<0.01)。GABABR2受体在脊髓背角的各层都有表达,以脊髓背角Ⅰ至Ⅲ层表达最多,主要位于神经元包膜和细胞质中。术后8d,手术对照组大鼠术侧脊髓背角GABABR2免疫阳性产物平均光密度值显著低于同组健侧和假手术对照组术侧(P值均<0.01);手术药物组大鼠术侧脊髓背角GABABR2免疫阳性产物平均光密度值虽显著低于假手术药物组术侧和同组健侧(P值均<0.01),但显著高于手术对照组术侧(P<0.05)。结论鞘内注射小胶质细胞特异抑制剂米诺环素可以明显抑制脊神经结扎大鼠的机械痛敏,并引起脊髓背角神经元上GABAR2的表达变化,表明小胶质细胞和GABABR2均参与神经病理性疼痛的形成和发展,并提示GABABR2可能作为小胶质细胞的下游机制参与了神经病理性疼痛的发生、发展过程。