(S)-羰基还原酶Ⅱ与葡萄糖脱氢酶共催化高效合成(S)-苯乙二醇

【目的】通过优化获得最佳酶活配比,设计近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)CCTCC M203011的(S)-羰基还原酶Ⅱ与枯草芽孢杆菌(Bacillus sp.)YX-1葡萄糖脱氢酶在大肠杆菌中的共表达体系,实现重组菌高效催化2-羟基苯乙酮,合成(S)-苯乙二醇。【方法】分别从重组大肠杆菌中纯化了(S)-羰基还原酶Ⅱ和葡萄糖脱氢酶,研究了2种酶共催化2-羟基苯乙酮的最佳酶活比例,最适催化温度和pH,由此构建(S)-羰基还原酶Ⅱ和葡萄糖脱氢酶的共表达体系。【结果】(S)-羰基还原酶Ⅱ的比酶活力为1.3 U/mg,葡萄糖脱氢酶的比酶活力为13.5 U/mg。在总酶活力为1 U时,(S)-羰基还原酶Ⅱ和葡萄糖脱氢酶共催化体系中,确定了2种酶的最佳比例在1∶1到5∶1(U/U)之间,最适反应温度为30℃,pH为7.0。在此基础上构建了(S)-羰基还原酶Ⅱ和葡萄糖脱氢酶基因比为1∶1的共表达体系,共表达重组菌破碎上清液中(S)-羰基还原酶Ⅱ和葡萄糖脱氢酶酶活分别为0.76 U/mg和0.73 U/mg,两者的酶活比例为1∶1。在上述确定的最适催化条件下,其催化10 g/L 2-羟基苯乙酮,产物(S)-苯乙二醇的光学纯度和得率均高达99%以上。与仅含有(S)-羰基还原酶Ⅱ的重组大肠杆菌相比,共表达体系转化产物(S)-苯乙二醇的得率明显提高,且转化时间由原来的24 h缩短为13 h。【结论】通过确定(S)-羰基还原酶Ⅱ和葡萄糖脱氢酶最佳酶活配比,为构建手性催化的靶酶和辅酶再生酶共表达体系,为实现手性化合物的高效制备提供了研究基础。

(S)-羰基还原酶II于酿酒酵母孢子中表达与功能

【目的】使近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis CCTCC M203011)的(S)-羰基还原酶II表达并包埋于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae AN120)孢子中,实现了重组酶高效催化生产(S)-苯基乙二醇的转化过程。【方法】采用PCR扩增技术,从近平滑假丝酵母基因组中克隆(S)-羰基还原酶II基因,于酿酒酵母AN120中表达,以醋酸钾为唯一碳源诱导培养产生孢子,包埋(S)-羰基还原酶II。以该孢子为生物催化剂,2-羟基苯乙酮为底物进行生物转化反应,经HPLC分析,计算产物的光学纯度和得率。考察了孢子催化转化反应的最适温度和p H值,温度和p H稳定性以及多批次使用性能。【结果】在最适反应温度40℃和p H6.0条件下,10%(W/V)子囊孢子催化6 g/L 2-羟基苯乙酮,产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度和得率均高达99%以上。与重组大肠杆菌相比较,重组孢子合成(S)-苯基乙二醇的得率由89.7%提高到99.0%,反应时间由48h缩短为4 h;连续使用10批次后,其催化产物的光学纯度几乎不变,得率保持在85%以上。【结论】该研究首次实现了氧化还原酶在酵母孢子内的异源表达,为手性化合物的高效制备奠定了坚实的研究基础。

多酶融合表达体系以木聚糖为辅助底物高效合成(S)-苯乙二醇

【目的】利用木聚糖为辅助底物加强手性催化反应中的辅酶循环,构建来源于近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis) CCTCC M203011的(S)-羰基还原酶Ⅱ(SCRⅡ)、枯草芽孢杆菌(Bacillus sp.) YX-1葡萄糖脱氢酶突变体Ala258Phe/GDH和里氏木霉(Trichoderma reesei)RutC-30木聚糖酶(XYN2)在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)中的融合表达体系,高效合成(S)-苯乙二醇。【方法】调节3种酶编码基因在pET-28a载体上的位置,运用重叠延伸PCR技术,构建了E.coli/pET-SCRⅡ-A258F-XYN2和E. coli/pET-A258F-SCRⅡ-XYN2两种重组菌,研究了其合成(S)-苯乙二醇的最适反应条件。【结果】重组菌株E.coli/pET-SCRⅡ-A258F-XYN2在底物2-羟基苯乙酮与辅助底物木聚糖的比例为1:1、35℃、pH为7.0条件下,(S)-苯乙二醇的产率达98.8%(W/W);而重组菌株E. coli/pET-A258F-SCRⅡ-XYN2在底物与辅助底物的比例为2:1、35℃、pH为7.0条件下,(S)-苯乙二醇的产率达95.6%(W/W),两者合成产物的光学纯度均>99%。【结论】通过构建3种酶的融合表达体系,成功将木聚糖酶和葡萄糖脱氢酶突变体介导的辅酶再生循环体系引入不对称生物合成反应,提高了手性转化效率,为将大自然中丰富的木聚糖用于手性催化奠定了较扎实的研究基础。