猪食道口线虫ITS-1和ITS-2rDNA的PCR-SSCP分析

以采自我国不同地区猪体的食道口线虫虫株为研究对象,PCR扩增出ITS-1和ITS-2序列片段,然后采用单链构象多态性(SSCP)方法分析PCR产物,对不同地区食道口线虫进行分子鉴定。所有样品经SSCP分析显示两种带型,第一种为有齿食道口线虫带型,另一种为未定种食道口线虫带型。代表性样品的测序结果表明,未定种食道口线虫带型的样品为四棘食道口线虫。本研究在国际上首次报道了中国猪四棘食道口线虫的ITS序列,并建立了区分有齿食道口线虫和四棘食道口线虫的PCR-SSCP方法,从而为食道口线虫的分子生物学的进一步研究奠定了基础。

绵羊线粒体DNA控制区5’端序列PCR-SSCP与序列分析

通过绵羊线粒体ＤＮＡ控制区左功能域（５’端序列）ＰＣＲ－ＳＳＣＰ和序列分析，发现小尾寒 羊、乌珠穆沁羊、湖羊、萨福克羊和夏洛来羊以及多赛特公羊与小尾寒羊杂交家系共２０２只绵羊 可归纳为两种类型：突变型和野生型，提示现代绵羊品种在起源上存在两种主要的进化途径。

猪雌激素受体基因(ESR)点突变的PCR-SSCP检测

雌激素受体基因(ESR)是控制猪高产仔数的主效基因之一,具有明显的基因效应:BB型比AA型母猪胎总产仔数和产活仔数分别高出1 40～3 37和0 63～3 58头,是目前商品猪育种和生产中重点检测的主要基因之一。常规采用PCR -RFLPs方法区分该基因由点突变造成的3种不同的基因型。本研究建立1种基于PCR的SSCP(single-strand edconformationpolymorphism)方法对猪ESR该位置的点突变进行检测,具有操作简便、灵敏度高和不需要酶切等优点 。

松材线虫rDNA的测序和 PCR-SSCP分析

本文为克服形态鉴定的不足 ,用分子生物学的方法鉴别松材线虫。线虫核糖体 DNA(r DNA)的内部转录间隔区 (ITS1)区 (约 30 8bp)的测序结果显示 :松材线虫种内区别很小 ,不超过 1bp;拟松材线虫种内区别较大 ,最大达 7bp;这 2种线虫的种间区别为 32～ 39bp。根据以上测序结果 ,本文结合单条线虫 DNA的提取技术 ,对 14个松材线虫和拟松材线虫样本进行了单链构象多态性 (PCR-SSCP)分析 ,结果表明 PCR- SSCP分析技术可明确区分这 2种线虫 ,该技术可为单条松材线虫的鉴定提供一套灵敏而可靠的方法。

两种龟类Sox基因的PCR扩增及SSCP分析的研究

采用ＰＣＲ技术，扩增了平胸龟、黄缘盒龟的Ｓｏｘ基因，扩增产物与人ｐＹ５３．３ＳＲＹ基因探针进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交，证实了扩增产物是人ＳＲＹ基因的同源片段；采用ＳＣＰ分析技术，显示龟类该基因片段的序列与人有较大差异，而龟类种间差异则较小，种内雌雄个体间则无差异．本文结果支持Ｓｏｘ基因在系统演化上十分保守的结论．

山羊生长分化因子9基因外显子2的PCR-SSCP分析

目的寻找与产羔数相关的遗传标记,为山羊高繁殖力的标记辅助选择提供科学依据。方法以控制Belclare绵羊和Cambridge绵羊高繁殖力的生长分化因子9(growthdifferentiationfactor9,GDF9)基因为候选基因,根据绵羊GDF9基因序列设计4对引物,采用PCR-SSCP技术检测GDF9基因外显子2在高繁殖力山羊品种(济宁青山羊)以及低繁殖力山羊品种(波尔山羊、文登奶山羊、辽宁绒山羊、北京本地山羊)中的单核苷酸多态性,同时研究该基因对济宁青山羊高繁殖力的影响。结果山羊与绵羊的GDF9基因外显子2核苷酸序列同源性为99%(955/965)。引物1和引物4存在多态性。对于引物1扩增片段,5个山羊品种均检测到AA、AB和BB3种基因型,测序分析发现外显子2第26bp处有1个G→A的单碱基突变,但没有引起氨基酸改变;济宁青山羊A等位基因频率为0.9128,B等位基因频率为0.0872;AA基因型济宁青山羊产羔数最小二乘均值比AB基因型的多0.54只(P<0.01),比BB基因型的多0.63只(P<0.01)。对于引物4扩增片段,5个山羊品种均检测到CC、CD和DD3种基因型,测序分析发现外显子2第792bp处有1个G→A的单碱基突变并且导致缬氨酸改变为异亮氨酸;济宁青山羊C等位基因频率为0.9266,D等位基因频率为0.0734;CC基因型济宁青山羊产羔数最小二乘均值比CD基因型的多0.57只(P<0.01),比DD基因型的多0.62只(P<0.01)。结论初步表明GDF9基因可能是控制济宁青山羊多胎性能的一个主效基因或是与之存在紧密遗传连锁的分子标记。

浓香型大曲真核微生物群落的PCR-SSCP解析

通过PCR-SSCP分析了浓香型大曲发酵过程中7个曲样中真核微生物群落的变化情况,结果表明:在大曲发酵过程中,微生物群落结构复杂,变化多样,不同微生物群落具有协同和制约的复杂生态学效应,并与外界因素相互作用,共同对大曲发酵过程产生影响。大曲发酵过程中温度的升高,对真核微生物多样性的影响较大。

FSHβ基因PCR-SSCP多态性及其与济宁青山羊高繁殖力关系的研究

采用PCR-SSCP技术检测促卵泡素β亚基(follicle-stimulatinghormoneβ,FSHβ)基因5′调控区、外显子1和外显子2在高繁殖力山羊品种(济宁青山羊)和低繁殖力山羊品种(辽宁绒山羊、波尔山羊、安哥拉山羊)中的单核苷酸多态性,同时研究该基因对济宁青山羊高繁殖力的影响。结果表明:山羊与绵羊的FSH基因该段核苷酸序列同源性为98%。9对引物中,只有P9的扩增片段存在多态性。P9的扩增片段在济宁青山羊和辽宁绒山羊中检测到AA、AB和AC3种基因型;在波尔山羊中检测到AA、CC和AC3种基因型;在安哥拉山羊中检测到AA、BB、CC、AB、AC和BC共6种基因型。测序分析发现BB型与AA型相比在外显子2的第94bp处有G→A突变,并引起氨基酸改变(丙氨酸→苏氨酸);CC型与AA型相比在外显子2的第174bp有一处C→T沉默突变。济宁青山羊AA、AB和AC基因型频率分别为0.686、0.137和0.177。AA基因型济宁青山羊产羔数最小二乘均值比AB基因型的多0.78只(P<0.05),比AC基因型的多0.64只(P<0.05)。

瘢痕疙瘩Fas基因突变的银染PCR-SSCP检测

以前的研究提示：瘢痕疙瘩成纤维细胞的Ｆａｓ 受体可能处于无功能状态。进一步探讨导致无功能Ｆａｓ分子的可能机制。取瘢痕疙瘩、增生性瘢痕患者的组织及外周血标本，ＰＣＲ特异性扩增Ｆａｓ 分子外显子９ 的编码区，扩增产物经银染ＳＳＣＰ筛选，最后可疑阳性的ＰＣＲ样本进行ＤＮＡ 测序。经ＰＣＲ－ＳＳＣＰ检测，２０％ （２／１０）的瘢痕疙瘩组织中发现异常电泳带，经ＤＮＡ 测序证实，这２ 例突变均为位于Ｆａｓ ｃＤＮＡ的７５５ｂｐ 处的“Ａ”缺失而导致的移码突变。结果提示：编码Ｆａｓ分子死亡域结构基因的移码突变可能导致Ｆａｓ受体功能丧失，从而导致成纤维细胞的凋亡异常；该研究从基因水平阐述了瘢痕疙瘩发生的分子机制。

民猪PRLR基因PCR-SSCP多态性与产仔数关联分析

【目的】研究民猪促乳素受体基因PRLR的多态性与母猪产仔数的相关性。【方法】采用PCR-SSCP技术检测民猪PRLR基因多态性,最小二乘法分析其多态性对母猪产仔数影响的遗传效应。【结果】PRLR基因在民猪中存在多态性,B等位基因为优势等位基因;在PRLR-1座位,对于初产母猪,BB基因型母猪的TNB和NBA比AA基因型母猪分别多0.93头和0.78头(P<0.05);对于经产母猪,BB基因型母猪的TNB和NBA比AA基因型母猪分别多0.62头和0.74头(P<0.05)。在PRLR-2座位,对于初产和经产母猪,3种基因型个体的TNB之间和NBA之间差异不显著(P>0.05)。在民猪群中这两个座位均处于Hardy-Weinberg平衡状态。【结论】PRLR基因B等位基因对民猪产仔数性状有显著影响。

绵羊催乳素受体基因PCR-SSCP分析

采用PCR-SSCP技术分析了催乳素受体基因(PRLR)在小尾寒羊、萨福克羊、多赛特羊、多赛特公羊×小尾寒羊母羊F1代杂种羊4个绵羊群体中的多态性。结果表明:PRLR基因在3对引物扩增片段中均存在PCR-SS-CP多态性。对于引物1,4个绵羊群体均检测到AA基因型,AB基因型只出现在小尾寒羊、多赛特羊和萨福克羊中,仅在多赛特羊中检测到BB基因型。对于引物2,4个绵羊群体均检测到AA和AB基因型,只有萨福克羊没有BB型。对于引物3,4个绵羊群体均检测到AA、AB和BB基因型。在4个绵羊群体中,A等位基因频率均明显高于B等位基因频率。

鸡AMPD1基因PCR-SSCP分析与相关性状的研究

5′-磷酸腺苷脱氨酶1(AMPD1)是嘌呤代谢中的一种重要酶类,它的功能是催化AMP(一磷酸腺苷)脱氨,生成肌苷酸(IMP),从而影响肉质风味。试验采用单链构象多态性(PCR-SSCP)技术,以隐性白羽肉鸡、白来航蛋鸡和两个地方品种(北京油鸡、三黄胡须鸡)纯系鸡为试验材料,对AMPD1基因进行SNPs检测和基因类型判别。卡方检验结果表明: 除三黄胡须鸡和隐性白羽肉鸡、北京油鸡和白来航鸡间差异不显著(P>0.05)外,其他各品种间差异极显著(P<0.01)。AMPD1基因多态性与北京油鸡生产和屠体性状(活重、胸肌率、肌苷酸含量等)相关分析结果表明:肌苷酸含量在三种基因型间差异显著(P<0.05)。初步推断AMPD1可能为影响鸡肉中肌苷酸生成的主效基因或与主效基因相连锁。

小麦SSCP分子标记体系的优化

SSCP技术易受上样缓冲液、变性的时间及温度、电泳条件等诸多因素的影响。本研究对上样缓冲液、变性的时间及温度、电泳条件等影响因素进行了研究,结果显示:上样缓冲液中不添加甘油、用量为PCR产物体积的1.5～3倍、变性温度98℃、变性时间10～15min、电泳缓冲液为0.5×TBE,常温下恒功率80W(2.67W/cm)电泳2 h左右,单链DNA条带清晰,易于识别。

秦川牛和中国荷斯坦奶牛FSHβ基因SSCP多态性分析

利用SSCP分子标记对秦川牛和中国荷斯坦奶牛的FSHβ基因5’侧翼区进行了多态性分析。结果表明:在秦川牛中检测的FSHβ基因5’侧翼区有AA型、BB型和AB型三种基因型,在中国荷斯坦奶牛中只有AA型。秦川牛中AA基因型的频率为0.395,BB基因型的频率为0.026,AB基因型的频率为0.579,中国荷斯坦奶牛的AA型的频率为1。秦川牛中A的基因频率为0.6842,B的基因频率为0.3158,中国荷斯坦奶牛A的基因频率为1.0。秦川牛群体中多态信息含量为0.3389,多态性高,遗传变异大。

中国人CTLA-4基因的PCR-SSCP和DNA序列分析

ＣＴＬＡ４是主要表达于成熟Ｔ细胞表面的蛋白分子，与Ｔ细胞参与的免疫应答负调控有关，目前有关ＣＴＬＡ４的分子生物学资料多为外国提供，为了掌握中国人ＣＴＬＡ４基因的第一手资料，我们对５０例中国人（其中２５例为正常人，２５例为类风湿性关节炎患者）的ＣＴＬＡ４基因Ｖ区进行了ＰＣＲ扩增，并对其中４例正常人进行了ＤＮＡ序列分析，结果显示中国人ＣＴＬＡ４Ｖ区的ＤＮＡ序列与国外报道有两个位点存在差异，其中第５４位密码子处中国人为ＡＴＧ（甲硫氨酸），第１１０位密码子处为ＡＣＣ（苏氨酸），进一步对正常人和类风湿性关节炎病人进行ＰＣＲＳＳＣＰ分析，结果显示在所分析的人群中不存在多态性，表明ＣＴＬＡ４分子具有高度保守性。

五指山猪近交系群体中DRA和DRB基因的SSCP检测

为确定五指山猪(WZSP)近交系群体SLA!ⅡDRA、DRB基因的等位基因数及其特性,利用PCR扩增SLA!ⅡDRA、DRB基因的第2外显子序列,经单链构象多态性即SSCP检测其等位基因数,选择纯合子个体的PCR产物直接测序。对所获得的序列与Genbank中所有相应的序列进行比对和聚类分析,特别是SLA!DRB!C、SLA!DRB!D、HLA!DRB*09012、HLA!DRB*1201、HLA!DRA*0101等位基因。结果表明:在WZSP近交系群体中,DRA、DRB各有2个等位基因且发现1个DRB新等位基因。DRA第2外显子有很强的保守性,而DRB基因呈现出高度的多态性,在核苷酸水平同源性为85%以上,氨基酸水平同源性为70%以上。该试验成功地检测了WZSP近交系SLA!DRA、DRB基因的等位基因及其特性,为建立WZSPSLA!DR基因抗原的分子分型及特异单倍型猪的培育研究奠定基础。

PCR-SSCP技术的研究及应用进展

阐述了SSCP技术的建立与发展过程;概述了PCR-SSCP技术的原理、方法、优缺点及突变技术研究进展;总结了PCR-SSCP技术在多个领域中(动物育种、基因突变、基因诊断、基因图谱和连锁分析等)的应用情况;分析了PCR-SSCP技术在分子生物学研究领域中的作用。

绵羊GDF9基因PCR-SSCP分析

生长分化因子 9(GDF9)是由卵母细胞分泌的一种生长因子 ,它对早期卵泡的生长和分化起重要的调节作用。采用PCR SSCP技术分析了GDF9基因在小尾寒羊、湖羊、多赛特羊和萨福克羊 4个绵羊品种的多态性。结果表明 :GDF9基因在两对引物扩增片段中均存在PCR SSCP多态性。对于引物 1扩增片段 ,4个绵羊品种均检测到AA基因型 ,AB基因型只出现在湖羊、多赛特羊和萨福克羊中 ,仅在萨福克羊中检测到BB基因型 ;在 4个绵羊品种中 ,A等位基因频率明显高于B等位基因频率。对于引物 2扩增片段 ,4个绵羊品种均检测到AA基因型 ,AB基因型只出现在湖羊、多赛特羊和萨福克羊中 ,4个绵羊品种均没有检测到BB基因型 ;在 4个绵羊品种中 ,AA基因型频率最高 ,A等位基因频率明显高于B等位基因频率。引物 1的多态性片段测序分析表明 :位于GDF9基因cDNA第15 2处发生了单碱基的改变 (A→G) ,并导致了氨基酸的改变 (天冬酰胺→天冬氨酸 )。

采用UPPCR-SSCP技术快速鉴定水产养殖病原性弧菌的研究

采用通用引物PCR配合SSCP分析即UPPCR SSCP技术 ,对弧菌科弧菌属中的副溶血弧菌、溶藻酸弧菌、费尼斯弧菌、鳗弧菌、哈维氏弧菌的 1 6S RNA基因进行检测。结果发现 ,UPPCR SSCP技术能较好地鉴别细菌的不同种 ,但对同种不同株细菌的区分较困难。认为PCR SSCP是将病原菌判定至种的有力工具。此研究对水产养殖病原菌的快速诊断与及时防治有重要意义。

SSCP方法的条件优化与榨菜低盐腌制微生物多样性分析

应用单链构象多态性(SSCP)方法研究榨菜低盐腌制条件下的微生物群落结构与变化。研究了凝胶质量浓度、电泳前处理、银染操作条件对SSCP分析方法的影响。结果表明,在凝胶质量浓度为22 g/dL、丙烯酰胺与双丙烯酰胺质量比为29∶1,并加入体积分数6%的甘油,4℃条件下1×TBE缓冲液中250 V电泳18 h,通过强碱性显影液和甲醛作还原剂的银染方法显色,可以获得理想的SSCP图谱。对榨菜低盐腌制不同时期样品的SSCP图谱分析结果,发现在榨菜腌制初期优势菌群为肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides),随后转变为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和短乳杆菌(Lactobacillus brevis)占优势;腌制后期主要存在的优势菌群为植物乳杆菌和Lactobacillus versmoldensis,结合感官分析证实这些优势乳酸菌对保持制品高品质具有功能作用。