使用TALENs技术构建丁酰胆碱酯酶敲除小鼠模型研究

为了使用转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)技术构建丁酰胆碱酯酶(BChE)敲除小鼠模型,试验设计多对TALENs组合,合成相应的载体,并通过3T3细胞系对这些载体的活性进行检测,选择出活性最高的组合进行体外转录获得TALENs mRNA,并注射入小鼠受精卵中,对子代小鼠进行基因测序并筛选,最终获得BChE基因敲除小鼠。结果表明:针对4个基因位点设计并构建了30对TALENs组合,选择最优3L3-3R1组合进行体外转录并注射入小鼠受精卵,获得4只携带突变的F0代嵌合体小鼠;通过杂交及筛选,最终获得4只携带移码突变的F1代小鼠,可用于交配繁殖。说明通过TALENs技术可以稳定可靠地制备BChE基因敲除小鼠,并用于后续BChE功能的研究。

基因编辑技术的研究进展

功能缺失(loss of function)是研究基因功能及其相关表型最重要、最直接的方法和策略。基因编辑技术从开始的RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术到近年发展起来的高效酶技术都得到了广泛的应用。这些高效酶技术包括锌指核酸酶(zinc finger nuclease,ZFN)技术、转录激活样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENs)技术和成簇的规律间隔的短回文重复序列系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9 system,CRISPR/Cas9)。除此之外,还有2016年发表的Ng Ago(Natronobacterium gregoryi Argonaute)编辑技术。近十年来,以CRISPR/Cas9为代表的基因编辑技术已经广泛应用于细胞水平和个体水平的基因功能敲除的研究。现就以上基因编辑技术的原理及最新进展进行综述,并重点介绍CRISPR/Cas9的技术原理以及该技术在建立基因敲除动物模型中的最新进展。

利用结构优化的TALE-TF高效诱导MEF细胞内源基因Oct4的表达（英文）

转录激活子样效应因子核酸酶(TALENs)已用于基因组编辑,而TALE转录激活因子(TALE-TFs)可用于内源基因的调控。通过修饰的TALE蛋白与内源基因的启动子特异性结合来激活或抑制基因的表达。但是,对于截短了N端的TALE是否会影响TALENs的效率还不确定。本文设计了不同长度N端的TALENs哺乳动物及酵母表达载体,对应哺乳动物绿色荧光报告载体及酵母报告载体。分别在哺乳动物细胞和酵母细胞上对不同长度N端TALENs的活性进行了检测。检测结果发现,含120个氨基酸N端的TALEN在酵母AH109细胞中的活性最高,N端长度为153个氨基酸的TALENs在293T细胞中表现最高的活性,但N端长度为153、140和160个氨基酸的TALENs的活性差异不显著(P>0.05)。随后,将结构优化了的TALE-TF用于小鼠胎儿成纤维细胞中激活Oct4基因。相对阴性对照组,TALE-TF将Oct4基因表达量上调了418倍。本研究结果表明,在哺乳动物细胞和酵母细胞中,具有最高活性TALENs的N端长度是不同的。本研究用结构优化的TALE-TF诱导内源基因高水平的表达,为从体细胞中获得iP S细胞提供了研究策略。

基因组编辑脱靶研究进展

近年各种基因组编辑技术的成功研发为人类疾病的治疗与预防谱写了新的篇章,这些技术对应的基因组编辑工具主要包括锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活子样效应因子核酸酶(TALENs)和最近发现的规律成簇间隔短回文重复(CRISPR)/Cas系统。这些工具相应的脱靶问题目前是制约基因组编辑技术介导人类疾病治疗的重要瓶颈。本文将分别从基因组编辑工具的介绍、脱靶的现状、解决优化的方案和检测方法进行总结与探讨,通过比较,进一步了解基因组编辑工具的优缺点及相关脱靶检测方法的适用性。

新型靶向基因组编辑技术研究进展

传统的靶向基因组编辑技术改造基因效率非常低,严重制约了基础研究和临床应用。因此,新的靶向基因组编辑工具的研究显得非常重要,以此来提高基因原位修复、定点整合及高通量基因敲除的效率。主要论述了近年来发现的新型靶向基因组编辑技术即锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应因子核酸酶(TALENs)、规律成簇间隔短回文重复(CRISPR)/Cas系统。从它们的发现、结构和研究进展及应用前景等方面进行了总结;通过比较三者的优缺点,发现规律成簇间隔短回文重复(CRISPRs)具有明显的优点。

类转录激活样因子效应物核酸酶技术的原理及应用

类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENs)是近年兴起的一种基因定点编辑技术,由特异性DNA结合结构域TALE和DNA切割结构域Fok I核酸内切酶组成。由于TALEN能对基因组中特异性基因进行识别和定点剪切,导致基因DNA双链断裂,进一步诱导DNA损伤后修复,可对基因组中的特定位点进行高效遗传操作,如基因的敲入、敲除和修复等。TALEN技术以其设计简单、特异性高、毒性低及靶点选择灵活等特点成为目前应用最为广泛的基因定点编辑技术。本文将就TALEN的原理、研究进展以及临床应用展望作一综述。