SARS-CoV-2重组痘苗病毒疫苗rVTT△TK-RBD的构建、筛选及免疫原性研究

目的 构建重组痘苗病毒载体疫苗rVTT△TK-RBD,并评价其安全性和免疫原性。方法 参考严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)基因序列合成受体结合域(RBD)基因,并将其插入自主构建的重组质粒pSTKE的多克隆位点上,构建重组痘苗病毒穿梭载体pSTKE-RBD,并转染到预先感染天坛株痘苗病毒(VTT)的BHK-21细胞内,经多轮的荧光噬斑筛选成功获得重组痘苗病毒rVTT△TK-RBD;通过滴鼻方式免疫小鼠后,检测rVTT△TK-RBD对BALB/c小鼠体质量的影响;通过肌肉免疫小鼠后,分析rVTT△TK-RBD对BALB/c小鼠产生的特异性抗体和中和抗体的水平;通过流式细胞术检测rVTT△TK-RBD对BALB/c小鼠T细胞亚群的影响。结果 利用同源重组、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)筛选标记和多次荧光噬斑筛选,成功筛选获得了表达RBD的胸腺激酶(TK)基因缺失型重组痘苗病毒rVTT△TK-RBD,且PCR验证成功。BALB/c小鼠体内实验表明rVTT△TK-RBD具有较好的抗SARS-CoV-2的免疫原性且相比于亲本株VTT明显降低了对机体的毒性作用。结论 成功构建并获得SARS-CoV-2重组痘苗病毒疫苗rVTT△TK-RBD并通过各项试验证明其安全性和免疫原性。

猪伪狂犬病病毒gG、gE和TK基因多重PCR检测方法的建立及应用

建立准确鉴别猪群伪狂犬病病毒(Porcine pseudorabies virus,PRV)野毒株和基因缺失疫苗株高效多重PCR方法,对PRV gG、gE和TK基因保守区域设计合成特异性引物,优化反应体系和条件,建立多重PCR鉴别检测方法,对临床样品进行检测应用。结果成功建立了鉴别PRV gG、gE和TK基因缺失疫苗株和野毒株感染的多重PCR检测方法,该方法对PRV gG、gE和TK基因可进行特异性扩增,对猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒和猪副猪嗜血杆菌等相关病原均无扩增,对携带gG、gE和TK混合阳性质粒的最低检测限为2.5×10^(-5) ng/μL,具有良好的重复性。用该方法检测53份猪组织样品,检出PRV野毒感染的样品7份,与国标方法和单一PCR法检测结果符合率为100%。建立的猪伪狂犬病病毒野毒株和基因缺失疫苗株多重PCR鉴别检测方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性,在生产中可快速、高效鉴别猪群PRV野毒感染和基因缺失疫苗免疫,可为PRV的快速鉴别检测、流行病学调查和防控提供技术支持。

伪狂犬病病毒TK/gE/gI基因缺失株ZJ01R对仔猪毒力稳定性检测

旨在明确伪狂犬病病毒(PRV)TK/gE/gI基因缺失株ZJ01R对仔猪的安全性。试验选择21~28日龄PRV阴性健康仔猪,通过病毒接种感染试验,观察ZJ01R在仔猪体内的分布规律及不同代次病毒对仔猪致病性。试验结果显示,仔猪肌肉注射ZJ01R后无明显临床症状,鼻腔排毒3~6 d,免疫后7、14、21 d,猪脑组织检测到PRV,其他组织均无病毒。仔猪滴鼻和肌肉注射F5、F30和F35代次ZJ01R病毒液,体温正常,无明显临床症状和病理变化,无病毒血症,鼻腔排毒时间仅为6 d;仔猪接种后7和14 d,肝脏和肺脏组织病毒检测均阴性,脑组织病毒核酸阳性;感染仔猪血清PRV gB ELISA抗体阳性,gE ELISA抗体阴性,表明ZJ01R毒株35代内对仔猪无临床致病作用,病毒毒力稳定性较好。

HSV-tk基因和IL-12基因抑制VEGF的表达及对鼻咽癌荷瘤裸鼠模型放射增敏作用的实验研究

目的:研究HSV-tk基因和IL-12基因抑制血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达对鼻咽癌荷瘤裸鼠模型放射增敏作用。方法:建立鼻咽癌荷瘤裸鼠模型,将42只成瘤鼠随机分成IL-12组、IL-12+放射治疗组、HSV-tk/GCV组、HSV-tk/GCV+放射治疗组、IL-12+HSV-tk/GCV组、IL-12+HSV-tk/GCV+放射治疗组、空白对照组、每组6只。采用瘤内注射分别给予相对应的重组腺病毒液(AdKDR-tk)、重组逆转录腺病毒液IL-12及生理盐水,24 h后重复注射1次。次日起HSV-tk/GCV组、HSV-tk/GCV+放射治疗组、IL-12+HSV-tk/GCV组、IL-12+HSV-tk/GCV+放射治疗组连续10 d每天腹腔内注射GCV 100 mg/(kg·d),连续10 d。各放射治疗组第3周开始给予6MV-X照射,每天2 Gy,连续5 d。治疗结束后处死裸鼠,检测裸鼠肿瘤质量及肿瘤生长抑制率,免疫组织化学法检测肿瘤微血管密度及VEGF阳性细胞灰度值。结果:IL-12+HSV-tk/GCV+放射治疗组裸鼠瘤体质量明显低于IL-12组、IL-12+放射治疗组、HSV-tk/GCV组、HSV-tk/GCV+放射治疗组,差异均有统计学意义(P<0.05)。IL-12+HSV-tk/GCV+放射治疗组的肿瘤生长抑制率最高,达71.7%。IL-12+HSV-tk/GCV+放射治疗组微血管密度均低于其他各组,VEGF阳性细胞灰度值均高于其他各组(P<0.05)。结论:HSV-tk基因和IL-12基因联合应用在鼻咽癌荷瘤裸鼠模型放疗中可抑制移植瘤的生长,为鼻咽癌的放疗产生增敏作用。

鸡传染性喉气管炎病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

鸡传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)以往多感染蛋鸡,近年来在蛋种鸡、商品肉鸡中连续多发,表明该病毒感染谱有扩大风险,因此有必要加强对ILTV的监测。为建立高效、灵敏的ILTV检测方法,本研究以ILTV的TK基因为靶基因设计引物,扩增并构建pMD18-T-TK质粒标准品,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法和标准曲线,对其特异性、敏感性和重复性进行验证,并对临床疑似病例进行检测。结果发现,该检测方法特异性良好,与其他常见症状相似病原无交叉反应;最低检测浓度为1.55拷贝/μL,灵敏度是普通PCR方法的10倍;重复性好,批内、批间变异系数在0.79%~1.83%之间。表明本研究建立的ILTV实时荧光定量PCR方法特异性强、灵敏度高,可为ILTV的临床诊断和流行病学研究等提供有效的检测方法。

伪狂犬病病毒鄂A株TK^-/gG^-/LacZ^+突变株的构建

为了以国内地方分离株鄂A株为亲本构建伪狂犬病病毒双基因缺失株 ,采用外切酶Ⅲ和绿豆核酸酶酶切 ,构建了缺失主要毒力基因TK基因部分编码区的重组质粒 pSTK1-4 ,进一步改造成为转移质粒 pUCPB4。用HindⅢ将质粒pUCPB4线性化 ,然后与用EcoRI消化的伪狂犬病病毒鄂A株TK-/LacZ+ 突变株基因组DNA共转染PK- 15细胞 ,待完全病变后 ,收毒作空斑试验 ,PCR筛选TK缺失的重组病毒。重组病毒空斑纯化 3次 ,随机挑取空斑进行PCR扩增 ,证实所获得的病毒为均一的无TK-/LacZ+ 突变株污染的TK缺失的重组病毒。分别以TK缺失株病毒与鄂A野毒株为模板对TK基因进行PCR扩增 ,扩增产物经酶切分析和测序后发现 :TK缺失重组病毒的TK基因缺失了 2 0 5个碱基 ,XhoI和SalI位点消失 ,SmaI酶切片段发生变化。两种病毒在PK - 15细胞上形成空斑的大小和增殖的滴度无明显的差别。进一步提取TK缺失突变株基因组DNA ,与含gG -LacZ的转移质粒pUSKZ通过磷酸钙法共转染PK - 15细胞 ,待完全病变后 ,在X - gal存在下筛选蓝斑 ,将挑取的蓝斑纯化 3次后 ,对纯化的重组病毒进行TK、LacZ扩增 ,结果既能扩增出较以鄂A野毒株为模板扩增的要小的TK基因片段 ,同时又能扩增出LacZ基因 ,证实所得到的重组病毒为TK-/ gG-/LacZ+ 突变株。此双缺失突变株的构?

利用响应面法优化Bacillus natto TK-1产脂肽发酵培养基

用响应面法对Bacillus natto TK-1发酵产脂肽的培养基进行优化。首先用Plackett-Burman法筛选出三个影响较大的重要因素,分别为蛋白胨、酵母粉、CaCl2,然后进行最陡爬坡实验逼近最佳响应面区域,最后通过Box-Behnken设计,利用SAS软件进行回归分析,得到各因素的最佳浓度。在优化培养基条件下,发酵液的溶血圈直径较初始培养基提高了29.3%,脂肽的产量提高了约30%。

高效定向驯化人工窖泥功能菌群及机制的研究

窖泥的质量和窖龄密切相关,且显著影响基酒的品质和产率。窖泥中功能菌群的形成是一个非常缓慢的过程,因此缩短优质人工窖泥(artificial pit mud,APM)的生产周期迫在眉睫。挖掘优良窖泥功能菌群资源,优化窖泥培养工艺是攻克发展障碍的关键。研究了太空(taikong,TK)大曲对窖泥群落结构的影响特点,确定了百年窖龄泥是人工窖泥功能菌群的强化源。TK大曲驯化生产APM及发酵后窖泥(pit mud,PM)显著改善了窖泥群落结构及挥发性代谢组分,提高了细菌群落的α-多样性。浓香型白酒酿造功能菌梭状芽孢杆菌(Clostridium_sensu_stricto_12)和古菌,尤其是甲烷八叠球菌(Methanosarcinales)的丰度显著增高了2~4倍,其中己酸和己酸乙酯是关键代谢物。研究结果可为基于优质窖泥和大曲的人工窖泥培养技术开发提供理论与技术支撑。

Bacillus natto TK-1产脂肽的纯化、抑菌活性及其表面活性剂特性

利用酸沉、醇提和薄层层析等方法从Bacillus natto TK-1发酵液中分离得到脂肽。TLC结果表明,在迁移值Rf0.58～0.65处出现单一紫红色条带其为脂肽粗提物。脂肽的临界胶束浓度约115mg/L。在浓度为512mg/L时,脂肽能将水的表面张力显著地降低到30.1mN/m。同时,通过体外抗粘连实验表明,脂肽能显著抑制沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌对96孔板固体表面的粘附,其中,对沙门氏菌的抗粘连效果较为明显。通过平板扩散法考察脂肽抑菌活性,结果表明脂肽具有较广泛的抑菌谱,对灰霉和镰胞霉的抑菌能力较强。

伪狂犬病病毒鄂A株TK^-/gE^-/gI^-基因缺失疫苗的安全性和保护力研究

对PrVEaTK-/gE-/gI-基因缺失疫苗的安全性和保护力进行了系统的研究。试验表明,该基因缺失疫苗105 0TCID50和106 0TCID50病毒剂量对妊娠母猪、新生仔猪和育肥猪均是安全的,并可保护妊娠母猪抵抗107 1TCID50强毒的攻击。新生仔猪免疫30d后,gE鉴别ELISA试验表明,PrVEaTK-/gE-/gI-免疫猪不产生针对gE的抗体。育肥猪在二次免疫后中和抗体水平显著升高。以105 0TCID50和106 0TCID50疫苗病毒接种家兔、猫和奶山羊等非靶动物,结果非靶动物未出现精神异常或死亡现象,说明该基因缺失疫苗具有极高的生物安全性。

伪狂犬病病毒Ea株TK^-/gE^-/gp63^-突变株的构建及其生物学特性研究

Using pseudorabies virus Ea strain as material,we inserted LacZ gene expression cassette into gE gene.After blue plaque and plaque purification,a recombinant virus PRVEa TK+-/gE+-/LacZ++ generated.Utilizing EcoR I site in LacZ gene, digested PRVEa TK+-/gE+-/LacZ++ genome DNA was cotransfected into PK-15 cells with plasmid pFBBS,then PRVEa TK+-/gE+-/gp63+- generated after plaque purification.Four pairs of primers amplification demonstrated the virus was pure TK+-/gE+-/gp63+- mutant virus.PCR product sequence indicates there were 205bp deletion in TK gene;1247bp deletion in gE,gp63 and intergenic region of PRVEa TK+-/gE+-/gp63+- mutant virus genome DNA.Inoculation to Balb/C mice with PRVEa TK+-/gE+-/gp63+- indicates the virulence is reduced greatly.

表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5的重组伪狂犬病毒TK^-/gG^-/GP5^+的构建及其生物学特性初步探讨

以伪狂犬病毒基因缺失标志疫苗株TK-/gG-/LacZ+为亲本株,通过同源重组,构建了表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)主要免疫原性蛋白GP5的重组伪狂犬病毒TK-/gG-/GP5+。经PCR、Southern杂交、Westernblot证实构建正确,并能表达GP5。同时,对重组病毒在PK-15细胞中的增殖特性进行了检测,结果与亲本株相比,增殖滴度无显著性差异。将重组病毒免疫BALB/c小鼠,2次免疫后4周,50%(3/6)小鼠产生了低水平的GP5特异性ELISA抗体,但中和抗体均小于1:4。

应用Cre-loxP系统构建伪狂犬病病毒gE/TK双缺失株

为了构建无报告基因的猪伪狂犬病病毒(PRV)gE/TK双缺失株,以PRV-JSZ株为亲本毒株,增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因,先构建出带有loxP位点的rPRV-gE-/GFP,通过Cre重组酶处理后,获得剔除EG-FP的gE单缺失株rPRV-gE-;再以rPRV-gE-为母本,以相同方法构建gE/TK双缺失株rPRV-gE-/TK-。荧光检测和PCR结果显示成功构建了gE单缺失株和gE/TK双缺失株;病毒生长曲线测定可见rPRV-gE-在PK15细胞上的增殖速度与野生株相似,而rPRV-gE-/TK-较为缓慢;rPRV-gE-/TK-对小鼠的半数致死量大于1×105 TCID50,显著高于rPRV-gE-和野生株;缺失株免疫小鼠强毒攻击后能提供80%的保护。这些结果表明以Cre/loxP系统可重复使用构建伪狂犬病病毒多基因缺失株,为研制伪狂犬病病毒基因缺失苗和载体疫苗提供了快速筛选的技术平台。

TK/GCV系统对骨肉瘤MG-63细胞杀伤的体外实验研究

目的:探讨脂质体介导的TK/GCV系统对骨肉瘤MG-63细胞的杀伤作用以及所产生的旁观者效应。方法:脂质体介导TK基因体外转染骨肉瘤MG-63细胞,倒置荧光显微镜观察细胞转染是否成功,流式细胞仪检测转染细胞与未转染细胞的转染效率。将未转染的骨肉瘤MG-63细胞分为3组,实验1组用转染TK/GCV的细胞上清液与原培养液按1/10、1/7、1/5、1/2比例混和液培养;实验2组用0.22μm滤器过滤的转染后的细胞上清液与原培养液按1/10、1/7、1/5、1/2比例混和液培养;对照组用培养液培养,四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法分别测定各组细胞的生长抑制率及骨肉瘤细胞对TK/GCV系统的敏感性。结果:经TK基因转染的MG-63细胞,倒置荧光显微镜下有大量绿色荧光蛋白表达,流式细胞仪检测转染TK基因的细胞转染效率可达75.5%。6 d后MTT检测结果显示实验1组中各比例浓度的混合培养液对细胞的抑制率与对照组相比有统计学意义(P<0.05);实验2组中1/10、1/7比例浓度的混合培养液对细胞的抑制率与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。经TK基因转染的MG-63细胞随GCV浓度增加,细胞凋亡率增加。结论:脂质体介导的TK/GCV系统能够通过旁观者效应抑制骨肉瘤MG-63细胞的生长。

伪狂犬病病毒鄂A株TK^-/LacZ^+突变株的构建

本研究以地高辛标记的含TK基因的BamHI/KpnI片段为探针 ,通过Southern杂交确定伪狂犬病病毒鄂A株基因组中一大小约 5 9kb的KpnI片段中含有TK基因 ,回收该片段并克隆于pUC18的KpnI位点。然后进一步克隆其中含TK基因的PstI/KpnI片段 ,并将LacZ表达盒插入到该片段中的BamHI位点 ,构建转移质粒 pUEKPZ。将该质粒与伪狂犬病病毒鄂A株基因组共转染PK 15细胞 ,待完全病变后在X gal存在下筛选蓝斑 ,蓝斑纯化 3次后 ,经PCR扩增、Southern杂交证实获得的病毒为伪狂犬病病毒鄂A株TK- /LacZ+ 突变株。

鸭瘟病毒的分离鉴定及其UL2、TK基因序列分析

2015年,福建省福州地区2个鸭场(M18肉鸭场及蛋鸭场)发生大量鸭死亡,初诊疑似鸭瘟。为明确其病原,分别采集病死鸭肝脏、食道样品进行鸭瘟病毒特异性PCR检测和病毒分离,对获得的2株病毒分离株分别进行鸭已知病原的检测,确定均为鸭瘟病毒。对新分离鉴定的2株鸭瘟病毒株的UL2基因进行序列测定及分析发现,均具有强毒株的分子特征;经TK基因序列测定及分析表明,2株新分离的鸭瘟病毒株与强毒代表株、弱毒疫苗株的TK基因核苷酸同源性均高达98.7%。

TK基因联合mIL-2基因治疗胃癌的实验研究

目的通过转基因方法观察自杀基因 TK 对小鼠胃癌的杀伤作用,并联合 mIL-2基因,观察免疫反应在增强 TK 杀伤性中的作用.方法应用逆转录病毒方法转导自杀基因 TK,应用脂质体方法转导细胞因子基因 mIL-2.通过体外实验观察 TK 基因对小鼠胃癌 MFC 细胞的杀伤性和旁观者效应;体内实验中首先在615小鼠建立胃癌模型,然后分组将病毒上清注入瘤体内,并结合应用前药和 mIL-2基因,分别观察它们对肿瘤的杀伤作用.通过病理切片观察组织病理变化;应用免疫组化方法观察 T 淋巴细胞亚群在局部的聚集情况.结果 TK 基因在体外即显出明显的杀伤作用,20%的转基因细胞可以杀伤70%～80%以上的肿瘤细胞.体内实验表明 TK基因结合前药 GCV 可显著杀伤肿瘤,而 TK 基因本身并无杀伤作用(P=0.046).联合 mIL-2后抗肿瘤作用进一步加强,部分肿瘤完全消退(P=0.005).免疫组化显示 CD_4^+,CD_8^+细胞在局部聚集.结论自杀基因 TK 联合前药 GCV 对小鼠胃癌产生显著杀伤作用,不仅转基因细胞被杀死,而且通过旁观者效应杀伤大量周围细胞.细胞因子基因 mIL-2可增强 TK 的抗肿瘤作用.

山东省分离强毒株猪伪狂犬病病毒SA株TK基因结构与进化分析

对山东省分离强毒株猪伪狂犬病病毒SA株TK基因进行了克隆和部分序列测定,并分析比较了该序列与国内外主要流行毒株伪狂犬病病毒Ea株、Min-A株、LA株、Kroea株、Kaplan株、SH株的同源性。结果表明:核苷酸序列的同源性分别为99.0%、99.1%、98.9%、99.0%、98.3%和74.4%;氨基酸序列的同源性分别为98.7%、98.4%、98.4%、98.7%、98.3%和74.8%;猪伪狂犬病毒SA株TK基因具有疱疹病毒胸苷激酶催化结构域的保守氨基酸共有的对应于这两个亚结构域的特征基序,其蛋白的二级结构由α-螺旋(45.38%)、β-折叠(14.46%)、β-转角(6.02%)和无规则卷曲(34.14%)组成;将猪伪狂犬病毒TK基因与鸡、牛、猫科、马科、人类的胸苷激酶用DNASTAR绘制进化树进行分析,可知猪疱疹病毒Ⅰ型TK基因亲缘关系与哺乳动物的疱疹病毒较近,而与禽类的相对较远。

利用BrdU在CEF(TK^+)细胞中筛选TK^-重组鸡痘病毒

将新城疫病毒 (NDV)四平株 HN基因 ,插入不含报告基因、以 TK为侧翼的鸡痘病毒表达载体 p UTA- 2中的复合启动子下游 ,获得重组表达质粒 p UTA- 2 HN。将重组表达质粒转染鸡痘病毒 (FPV)感染的鸡胚成纤维细胞 (CEF) ,培养、收获病毒后 ,用含 40 m g/ L 5 -溴 - 2 -脱氧尿嘧啶 (Brd U )的培养液 ,在 CEF(TK+)细胞中筛选培养 2代 ,然后用不含 Brd U的培养液进行病毒蚀斑纯化 ,成功筛选出表达 NDV HN蛋白的

猪伪狂犬病毒的分离鉴定及其gE、TK全基因序列遗传变异分析

将分离到的8种PRV分离株的g E、TK基因与国内外的毒株进行核苷酸及氨基酸的序列同源性分析,结果发现,分离毒株的gE、TK基因与15株国内外已发表的代表毒株核苷酸及氨基酸的序列同源性分别为97.3%~99.9%、98.7%~99.9%;遗传进化分析结果表明,分离毒株与国内近年分离自不同省份的代表毒株亲缘关系较近,与国外分离的代表毒株亲缘关系较远;而对gE、TK基因氨基酸主要变异位点分析表明,gE和TK基因都有一些位点已经发生突变。结果表明猪PRV广东部分地区分离毒株已发生变异,为规模化猪场对猪伪狂犬病的净化以及疫苗的选择提供参考。