昆虫杆状病毒表达的猪圆环病毒2d型Cap蛋白-VLP对仔猪的免疫保护效果

猪圆环病毒2d基因型(Porcine circovirus type 2d,PCV2d)为猪场当前流行的PCV2优势基因型,为了研究针对PCV2d基因型的病毒样颗粒(Virus-like particle,VLP)疫苗,提高猪圆环病毒病的防控效果。本研究利用杆状病毒表达系统表达了能够自组装为VLP的PCV2d-Cap蛋白,然后将9头21日龄健康仔猪随机分为VLP组、攻毒对照组和空白对照组(n=3)。VLP组的每头仔猪经颈部肌肉注射400μg Cap蛋白-佐剂复合物(PCV2d-VLP),攻毒组注射等体积的PBS与佐剂混合物,空白组注射等体积的PBS。共接种2次,每次间隔14 d。于第2次免疫后21 d,VLP组和攻毒对照组的仔猪通过鼻腔感染PCV2 HBDX-2018株(106TCID50/头),评价PCV2d-VLP诱导的免疫效果。结果表明PCV2d-VLP能够诱导仔猪产生高水平的特异性IgG抗体和中和抗体,刺激IFN-γ水平升高,引起外周血淋巴细胞增殖能力增强,降低病毒经鼻腔和直肠的排毒率及病毒血症阳性率,减轻腹股沟淋巴结和脾脏的病理损伤,降低组织中的病毒载量。上述研究表明,应用杆状病毒表达的PCV2d-Cap蛋白能自组装为VLP,并能诱导仔猪产生良好的免疫保护效应,具有进一步开发为PCV2d-VLP疫苗的潜力。

密码子优化的RHDV2双VP60基因重组杆状病毒构建及表达蛋白免疫原性分析

[目的]试验旨在优化兔出血症病毒2型(Rabbit hemorrhagic disease virus 2,RHDV2)病毒样颗粒(virus-like particle, VLP)疫苗的制备策略,探究RHDV2 VLP疫苗对家兔的免疫原性,为低成本、高产量RHDV2新型疫苗研发提供新思路。[方法]根据昆虫细胞的密码子偏好性优化合成RHDV2 VP60全基因,将双VP60基因插入真核载体pFastBacTMDual,转化携带Bacmid质粒的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,构建含双VP60基因的重组杆粒Bacmid-VP60-VP60,转染Sf9昆虫细胞,通过Western blotting、间接免疫荧光试验(IFA)及透射电镜对重组杆状病毒Bacmid-VP60-VP60进行表达验证;将优化策略制备的重组蛋白抗原与氢氧化铝佐剂按照9∶1比例制备VLP灭活疫苗,通过安全性检验、最小免疫剂量、免疫持续期等评估优化策略制备的RHDV2 VLP疫苗的保护效果。[结果]试验成功构建重组杆粒Bacmid-VP60-VP60。Western blotting鉴定结果显示,重组杆状病毒转染Sf9细胞表达出大小约60 ku的RHDV2 VP60蛋白。IFA鉴定结果显示,感染重组杆状病毒的Sf9细胞产生了大量的黄绿色荧光,表明重组杆状病毒在Sf9细胞中大量表达VP60蛋白。透射电镜观察结果显示,VP60蛋白折叠成VLP,大小为40 nm左右,呈现球形结构,表面光滑。优化策略制备的RHDV2 VLP疫苗对家兔具有良好的安全性和免疫原性,最小免疫剂量为0.5 mL/只,免疫持续期可达210 d以上。[结论]试验构建了含有密码子优化的双VP60基因的重组杆状病毒,并在昆虫细胞中成功表达RHDV2 VP60蛋白,该蛋白制备的VLP疫苗对家兔具有良好的免疫原性。

融合自监督和多层交叉注意力的多模态情感分析网络

针对多模态情感分析任务中模态内信息不完整、模态间交互能力差和难以训练的问题,将视觉语言预训练(VLP)模型应用于多模态情感分析领域,提出一种融合自监督和多层交叉注意力的多模态情感分析网络(MSSM)。通过自监督学习强化视觉编码器模块,并加入多层交叉注意力以更好地建模文本和视觉特征,使模态内部信息更丰富完整,同时使模态间的信息交互更充分。此外,通过具有感知意识的快速、内存效率高的精确注意力FlashAttention解决Transformer中注意力计算高复杂度的问题。实验结果表明,与目前主流的基于对比文本-图像对的模型(CLIP)相比,MSSM在处理后的MVSA-S数据集上的准确率提高3.6个百分点,在MVSA-M数据集上的准确率提高2.2个百分点,验证所提网络能在降低运算成本的同时有效提高多模态信息融合的完整性。

生长温度对Si基Ge量子点VLP-CVD自组织生长的影响

对利用超低压化学气相淀积 (VLP CVD)技术在Si上自组织生长Ge量子点的特征进行了研究 ,发现生长温度对Ge量子点尺寸分布和密度的影响不同于分子束外延 (MBE)的结果 ,这种现象与VLP CVD表面控制反应模式有关。实验表明 。

VLP/CVD低温硅外延

研究了 VLP/ CVD低温硅外延生长技术。利用自制的 VLP/ CVD设备 ,在低温条件下 ,成功地研制出晶格结构完好的硅同质结外延材料。扩展电阻、X射线衍射谱和电化学分布研究表明 ,在低温下 (T<80 0°C)应用 VLP/ CVD技术 ,可以生长结构完好的硅外延材料 ;

利用重组HPV16L1抗原检测宫颈癌抗L1或VLP抗体的对比

为了评价重组大肠杆菌表达的HPV16L1蛋白和重组腺病毒表达的HPV16L1 VLP两种抗原在检测宫颈癌抗 16L1或VLP抗体及在宫颈癌血清学诊断意义上的差别 ,应用PCR技术从宫颈癌组织的DNA中扩增出全长15 35bp的HPV16L1基因片段 ,克隆至 pUC18 T载体中 ,进行DNA测序鉴定。然后 ,将HPV16L1基因克隆至pGEX 2T表达载体中 ,并诱导表达HPV16L1融合蛋白 ,分子量为 83kD ,能被HPV16L1单克隆抗体所识别。经GST柱层析法纯化后 ,与重组腺病毒表达的HPV16L1 VLP分别经酶联免疫吸附 (ELISA)法检测 12份宫颈癌患者和 35份献血员血清。 12例宫颈癌血清标本中 ,抗HPV16L1蛋白的抗体阳性率为 7例 (占 5 8.3% ) ;抗HPV16L1 VLP的抗体阳性率为 8例 (占 6 6 .7% )。经大肠杆菌表达的重组抗原HPV16L1检测为HPV16抗体IgG(+)的 7份患者血清 ,利用HPV16L1 VLP试剂盒检测均阳性 ;经大肠杆菌表达的重组抗原检测为HPV16抗体IgG( )的 5份患者血清 ,利用HPV16L1 VLP试剂盒检测有 1份阳性。两者对HPV16抗体的阳性检出率并无显著差异 (P >0 .0 5 )。本实验结果说明HPV16与宫颈癌高度相关 ,利用大肠杆菌表达的重组抗原HPV16L1和HPV16L1 VLP重组抗原检测抗体的敏感性并不受影响。利用重组抗原HPV16L1对宫颈癌的抗体进行定性。

铝佐剂对HBoV1 VP2 VLPs诱导小鼠免疫应答的影响

目的:探讨铝佐剂对HBoV1 VP2 VLPs诱导小鼠免疫应答的影响。方法:BABL/c小鼠随机分为VLPs实验组、明矾佐剂实验组、PBS对照组和明矾佐剂对照组。实验组小鼠分别采用HBoV1 VP2 VLPs和HBoV1 VP2 VLPs加明矾佐剂肌肉注射免疫,对照组小鼠同期注射等量明矾佐剂或PBS缓冲液;实验8周后ELISA检测两实验组特异性Ig G抗体效价和活性,ELIspot检测两实验组特异性细胞免疫反应强度,从细胞免疫和体液免疫强度探讨铝佐剂对HBoV1 VP2 VLPs诱导小鼠免疫应答的影响。结果:明矾佐剂降低HBoV1 VP2 VLPs诱导细胞免疫反应强度(P<0.001),增强HBoV1 VP2 VLPs诱导的血清Ig G效价(P<0.01)和Ig G活性(P<0.05)。结论:明矾佐剂使HBoV1 VP2 VLPs诱导的体液免疫反应增强而细胞免疫反应减弱。HBoV1 VP2 VLPs作为预防性疫苗使用时应添加明矾佐剂,作为治疗性疫苗使用时应不加明矾佐剂。

RHDV VLPs单克隆抗体的制备及其识别表位的初步定位

为了筛选兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白(VP60)的特异性单抗,并进一步分析单抗识别表位的分布情况,将重组杆状病毒r Ac V-Bac-VP60接种Sf9昆虫细胞,收获细胞培养物,电镜观察显示重组VP60蛋白获得有效表达,并可组装成病毒样粒子(VLPs)。将RHDV VLPs作为免疫原与等量弗氏佐剂乳化,免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经3次亚克隆后,获得11株能稳定分泌抗RHDV VLPs抗体的阳性杂交瘤细胞株。间接ELISA、IFA和Western Blot鉴定结果表明,这11株单克隆抗体均能够特异地识别RHDV VLPs和天然RHDV。11株单抗均为Ig G1,其中1D4和3F7的轻链为Lambda型,其余均为Kappa型。截短表达结果显示,单抗5A3针对RHDV VP60的NTA区,5F3针对RHDV VP60的S区,单抗1B8、1D4、3D11、3F7、4C2、4G2、5G2、5H3和6B2针对RHDV VP60的P区。研究为RHDV VLPs抗原表位的鉴定和RHDV结构功能的研究奠定了基础,同时为RHDV的检测和新型疫苗研究提供物质基础。

多LED可见光定位通信一体化稳健功率分配

为了实现可见光定位(VLP)与可见光通信(VLC)一体化信号传输,保证稳健通信和有效定位,该文提出一种基于频分复用(FDM)的可见光定位通信一体化(VLPC)信号传输方案,并设计了一种多LED VLPC稳健功率分配方案。首先提出了一种基于频分复用的VLPC传输方案,实现两种信号一体化传输,频谱资源独立分配,从而降低传输时延,提高定位实时性;然后基于定位结果进行可见光信道估计,揭示了信道估计误差、通信速率与实际定位误差之间耦合关系与统计特性;更进一步,基于所得到的耦合关系,研究了多LED VLPC联合功率分配问题,从而最小化定位误差克拉默-拉奥下界(CRLB),并满足功率约束和通信速率中断概率约束,并利用半正定松弛、最差情况条件风险值和连续凸近似等方法,将难以求解的非凸问题转化为一系列凸半正定规划问题进行迭代求解,并获得高质量可行解;最后,经过数值仿真验证,所提出的方案能够同时实现稳健通信和有效定位。稳健传输速率超过350 Mbit/s,并且当最小速率门限为200 Mbit/s,最大中断概率门限为0.01时,在直射路径加散射路径场景中,可以实现厘米级定位。

VP2蛋白Cys-402、Cys-214对猪细小病毒VLPs影响的初步研究

试验以猪细小病毒VP2 Cys-402（A）、Cys-214（B）定点突变体为基础，将突变体真核表达载体转染COS-7细胞及核酸免疫猪细小病毒抗体阴性的小白鼠，通过电镜技术和流式细胞仪技术探讨突变Cys-402、Cys-214对猪细小病毒病毒样颗粒的影响，旨在寻找利于外源基因插入的病毒样颗粒内部位点。电镜和小白鼠核酸免疫试验结果表明：Cys-214对病毒样颗粒的组装和免疫原性的发挥是必需的，其突变后不能促使VP2形成病毒样颗粒，更不能在免疫后的小白鼠血清中监测出相应抗体的存在；而Cys-402的突变并不干扰病毒样颗粒的形成和免疫原性的发挥。由此可以推测Cys-402及其附近可能存在利于外源基因插入的位点。

Her2/ECD-sf162/TM嵌合VLPs的制备及抗肿瘤免疫效果研究

目的:成功制备Her2胞外段基因与猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus,SIV)包膜蛋白sf162跨膜区基因融合的Her2/ECD-sf162/TM病毒样颗粒(VLPs),并在小鼠体内进行初步的抗肿瘤免疫效果研究。方法:利用前期构建好的Her2/neu与SIV-gag嵌合的表达载体Her2/ECD-sf162/TM,制备Her2/neu与SIV-gag嵌合型VLPs疫苗,并用该疫苗免疫小鼠。结果:VLPs可成功激发小鼠体内免疫应答反应,产生血清抗VLPs的抗体;VLP免疫后接种Her2/neu+小鼠乳腺癌细胞EMT6,结果显示该疫苗可有效抑制肿瘤生长;同时,VLP对荷瘤鼠治疗结果也显示,该疫苗可在一定程度上抑制肿瘤生长。结论:VLPs疫苗具有良好的免疫原性,且免疫后对肿瘤攻击具有保护作用。

肠道病毒EV71新型VLPs疫苗的制备及鉴定

目的制备肠道病毒71型(EV71)的新型病毒样颗粒(VLPs)疫苗,为手足口病防治奠定基础。方法应用分子克隆技术构建外壳蛋白VP1融合基因cVP1,免疫细胞化学及Western Blot测定该融合基因在HeLa细胞表达情况;将cVP1克隆于杆状病毒表达载体pFastbac1,应用昆虫细胞TN5制备重组杆状病毒cVP1 rBV,再将此重组病毒与本室保存的gag rBV以不同MOI比例共感染昆虫细胞TN5,得到含有VP1的重组嵌合病毒样颗粒cVP1 VLPs,最后以Westem Blot及电镜进行鉴定。结果免疫细胞化学及Western Blot结果显示构建的融合基因cVP1可在真核细胞内表达,并成功制备成cVP1 rBV,该重组杆状病毒和gag rBV共感染昆虫细胞制备的VLPs结构完整。结论成功制备了EV71的新型VLPs疫苗,为后续研究打下了基础。

CDSN网月带VLP地震数据解调

中国数字地震台网（即ＣＤＳＮ）自１９８６年１０月起，记录了大量的超长周期（ＶＬＰ）地震数据，这些ＶＬＰ地震数据以同月带记录形式存放。网月带中，数据格式有ＡＳＣⅡ码、ＢＣＤ码和二进制数据３种形式。本文提出了ＣＤＳＮ同月带ＶＬＰ地震数据的解调方法，分析了网月带的数据结构，输出ＶＬＰ地震数据文件。同时，编制了配套的《ＣＤＳＮ超长周期地震记录处理软件》。《软件》使用ＴｕｒｂｏＣ和ＱｕｉｃｋＢＡＳＩＣ两种语言编制，其中数据解调和图形回放等功能模块由ＴｕｒｂｏＣ语言完成，管理程序由ＱｕｉｃｋＢＡＳＩＣ语言实现。

T7噬菌体p10融合蛋白表达及自组装VLP观察

原核表达T7噬菌体p10融合蛋白,PCR扩增p10基因并在基因下游连接口蹄疫病毒(FMDV)VP1抗原表位基因;将融合基因插入p ET-28a载体,构建重组质粒;用IPTG诱导重组菌表达目标蛋白,通过电镜观察病毒样颗粒(VLP)的形成。结果成功构建了p ET-p10-VP1表达菌株。SDS-PAGE、Western-blot检测显示目标蛋白高效表达并与VP1特异性抗体产生免疫反应。回收p10-VP1蛋白样品经透射电镜观察,有40 nm VLP生成。表明T7噬菌体p10蛋白具有良好的VLP自组装功能,并可用于抗原表位的表面展示。

加热法促进猪圆环病毒2型病毒样颗粒的高效组装

为了提高猪圆环病毒2型(PCV2)衣壳(Cap)蛋白病毒样颗粒(VLPs)的产量,本试验探索了采用加热法促进杆状病毒-昆虫细胞表达的Cap蛋白体外组装的可行性,通过高效液相尺寸排阻色谱法定量PCV2 Cap VLPs,分析4~56℃加热0~10 h对细胞培养液上清中PCV2 Cap VLPs浓度的影响,并采用透射电子显微镜(TEM)验证;通过监测45℃加热6 h后的细胞培养液上清在4℃放置6个月中PCV2 Cap VLPs的浓度变化,验证PCV2 Cap VLPs的稳定性;通过全能核酸酶消化试验验证宿主核酸对PCV2 Cap VLPs组装的作用;对比加热与未加热工艺的PCV2 Cap VLPs纯化收率,并通过高效液相尺寸排阻色谱偶联多角度激光散射、圆二色光谱、差示扫描量热法和微量热泳动分析2种工艺所得PCV2 Cap VLPs表征的一致性。结果显示,细胞培养液上清中PCV2 Cap VLPs浓度随着温度和时间的延长逐渐升高,其中45℃加热6 h后PCV2 Cap VLPs浓度为未加热的3.77倍,TEM观察进一步验证PCV2 Cap VLPs浓度增加。加热后形成的PCV2 Cap VLPs在4℃储存6个月浓度稳定,未出现解聚现象。全能核酸酶消化试验显示,加热过程中宿主核酸的作用并非关键因素。采用45℃加热6 h后再进行纯化,PCV2 Cap VLPs纯化收率是未加热工艺的2.9倍。经分析,加热与未加热工艺所得PCV2 Cap VLPs具有一致的分子量(2.385×10^(6)和2.361×10^(6) Da)、水力学半径(10.1和10.2 nm)、热转变温度Tm(67.22和66.92℃)、二级结构和特异性抗体亲和力(49.0和76.5 pmol/L),表明两者具有相近结构。本试验为PCV2 Cap VLPs的生产探索了一个提高产量的新方法,为兽用疫苗的研发提供了在抗原性质分析方法上的借鉴。

病毒样颗粒疫苗研究进展

病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)是含有某种病毒一个或多个结构蛋白的空心颗粒形态,结构上类似完整病毒,具有与完整病毒相似的免疫原性并通过激活抗原提呈细胞诱导免疫应答,由于不含有完整的病毒基因组,因此适合用于开发更安全、成本更低的候选疫苗。系统阐述了VLPs的分类、表征、优势及表达系统,回顾了VLPs疫苗的发展历程,并汇总了已上市的疫苗品种。同时,介绍了部分在研的预防性或治疗性VLPs疫苗,并探讨了新的开发策略,进一步拓宽了VLPs疫苗的研发领域,为未来的研究与应用提供了更广阔的前景。

促吞噬肽功能化的HBc VLPs纳米载体的制备

促吞噬肽(Tuftsin)是机体脾组织产生的生理活性肽,具有强大的免疫调节和免疫治疗潜力。乙型肝炎病毒核心蛋白病毒样颗粒(hepatitis B virus core protein virus-like particles, HBc VLPs)是由HBc自组装形成的空心纳米颗粒,其不仅能应用于药物的递送,还能应用于外源蛋白质的显示。因此,Tuftsin功能化HBc VLPs载体的研究在免疫治疗、分子递送等方面具有重要意义。本研究选用PET43.1-a质粒作为Tuftsin-HBc VLP的表达载体,以大肠杆菌BL21 (DE3)为工程菌进行诱导表达,通过盐析、分子筛层析和离子交换层析技术纯化生产Tuftsin-HBc VLP。利用Western印迹和ELISA分别对Tuftsin-HBc VLP上HBc和Tuftsin进行定性分析。结果显示,Tuftsin-HBc VLP可与抗HBc抗体和抗Tuftsin抗体发生特异性结合。透射电镜观察结果显示,Tuftsin-HBc VLP呈大小均一的球形结构,粒度分析仪测得Tuftsin-HBc VLP的直径约为30 nm。CCK8法显示,Tuftsin-HBc VLP在0~480μg/mL范围内,细胞增殖未见显著变化。上述结果表明,本研究成功制备了可以在原核系统中高效表达且安全有效的Tuftsin-HBc VLP生物纳米递送载体。

兔抗O型口蹄疫VLPs酶标抗体的制备及初步应用

为制备兔抗O型口蹄疫病毒样颗粒(VLPs)的酶标抗体,进一步建立O型口蹄疫病毒的ELISA检测方法,通过原核表达、体外纯化和组装O型口蹄疫VLPs,免疫家兔制备兔抗O型口蹄疫VLPs高免血清,并采用亲和层析法纯化IgG,改良过碘酸钠法制备兔抗O型口蹄疫VLPs的酶标抗体(rabbit anti-type O foot-and-mouth disease IgG-HRP)。结果显示,兔抗O型口蹄疫VLPs高免血清效价达1∶4 096,纯化后的IgG纯度达90%,效价达1∶512 000。表明获得了高纯度的兔抗O型口蹄疫VLP的酶标抗体,可用于O型口蹄疫的ELISA检测。

PCV2-VLP和SVV全病毒灭活的组合物对小鼠的免疫原性研究

为评价猪圆环病毒2型病毒样颗粒(PCV2-VLP)和塞内卡病毒(SVV)全病毒灭活组合物的免疫效果。本研究首先通过透射电镜对PCV2-VLP的完整性进行鉴定,结果显示,PCV2-VLP颗粒完整,大小均一,直径为17 nm~20 nm。表明PCV2-VLP完整性良好,可以用于后续研究。然后将PCV2-VLP与SVV全病毒灭活病毒液等体积混合,制备二联组合物。将二联组合物、PCV2-VLP和SVV全病毒灭活病毒液分别以603和卡波姆作为佐剂两次免疫小鼠,并设立对照组。初免后每周采血,通过ELISA检测PCV2特异性抗体水平及IL-4和IFN-γ的分泌水平,通过中和试验检测小鼠血清针对PCV2和SVV的中和抗体。结果显示,相比卡波姆佐剂,二联组合物、PCV2-VLP和SVV全病毒灭活病毒液配合603佐剂免疫均能够诱导小鼠产生更高的特异性抗体及中和抗体。在相同佐剂下,二联组合物免疫小鼠产生的PCV2抗体与PCV2-VLP组相当,产生的SVV中和抗体则高于SVV单独免疫组(p<0.05)。各免疫组小鼠产生的细胞因子含量相当。表明,603佐剂优于卡波姆佐剂;二联组合物可以刺激小鼠产生针对PCV2和SVV的高水平中和抗体,具有良好的免疫原性。本研究首次将PCV2-VLP与SVV全病毒灭活病毒液进行联合免疫,在小鼠上证明具有良好的免疫原性,具有很大的参考价值,为进一步猪的免疫实验提供参考依据。

C-端嵌合PRRSV T细胞抗原表位对PCV2 VLPs稳定性的影响

【目的】利用大肠杆菌原核表达系统表达猪圆环病毒2型Cap蛋白及在其C-端嵌合PRRSV T细胞抗原表位的Cap嵌合蛋白,对Cap蛋白形成的病毒样颗粒(VLPs)的稳定性、免疫原性以及C-端嵌合PRRSV T细胞抗原表位VLPs的热稳定性进行研究,为猪圆环病毒2型(PCV2)VLPs疫苗的高效制备及基于Cap VLPs纳米骨架展示技术嵌合疫苗的开发奠定基础。【方法】采用分子生物学方法合成PCV2b型强毒株ZJ的cap基因,在其C-端插入PRRSV T细胞抗原表位T1、T2、T3、T4、T5,构建cap-T1~cap-T5基因;将cap及cap-T1~cap-T5基因与pET28a表达载体连接,构建重组表达载体,转染大肠杆菌ClearColi^(TM) BL21(DE3)进行诱导表达,并对表达产物的热稳定性及免疫效果进行检测。【结果】实现了Cap蛋白及其C-端嵌合PRRSV T细胞抗原表位的Cap-T1、Cap-T2、Cap-T3、Cap-T4和Cap-T5嵌合蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达,并成功观察到了VLPs;表达产物热稳定性分析显示,在60℃处理30 min条件下,Cap VLPs保持稳定,而C-端嵌合PRRSV T细胞抗原表位的VLPs热稳定性大幅下降;小鼠免疫效果检测显示,Cap VLPs诱导产生了高水平特异性抗体,其中VLPs+佐剂S350组效果最好。【结论】利用大肠杆菌表达系统表达的PCV2 Cap蛋白可高效自组装成耐热和高免疫原性的VLPs,但在Cap蛋白C-端嵌合PRRSV T细胞抗原表位后的嵌合VLPs组装效果和稳定性急剧下降,提示PCV2 VLPs作为纳米骨架用于传染病疫苗研发仍有较大局限性。