绿色荧光蛋白(GFP)标记杧果细菌性角斑病病原菌及其定殖规律

为研究杧果细菌性角斑病病菌在杧果不同器官组织中的定殖规律。利用电击转化法将质粒pBBR1MCS2-Tac-EGFP导入野油菜黄单胞菌杧果致病变种(Xanthomonas citri pv.mangiferaeindicae)菌株Xcm003中,通过转化子生长表型和外源基因的PCR鉴定,成功获得带绿色荧光蛋白(GFP)标记的转化子Xcm003-EGFP,采用室内刺伤和盆栽苗灌根接种试验,结合组织学观察法,追踪该病原菌在不同杧果器官组织中的定殖规律。结果表明,病原菌通过伤口侵入杧果果实果皮外层细胞层,随着侵染时间推移,向内层果皮细胞层垂直扩散并定殖,后期病原菌在伤口处大量聚集,出现隆起开裂状病斑。在杧果叶片中,病原菌从伤口侵入叶片上表皮细胞层,随后迁移到叶肉细胞间隙,侵染后期,病原菌在气孔和伤口定殖,造成气孔和伤口堵塞,导致接种点出现黑褐色水浸病斑。盆栽苗灌根后发现,该病原菌可在土壤中定殖,入侵杧果根部,但并不扩散至其他杧果组织,不会为害整株幼苗。说明杧果细菌性角斑病病菌可在不同杧果组织中定殖,但仅表现为局部侵染特性。

面向视频侦查应用的退化人像GFP深度复原技术

在视频侦查工作中时常遇到视频人像质量过低难以辨识的情况,而GFP等人像深度复原方法只适用于单张人像的复原。为此,本文提出一种基于GFP的监控视频人像复原技术,将GFP方法扩展至视频侦查应用,便于及时锁定犯罪嫌疑人,提高破案效率。首先对监控视频进行视频分帧、人像裁剪对齐、倾斜透视校正等预处理操作,然后使用GFP方法对预处理后得到的人像进行深度复原,最后经过逆处理将复原人像整合成高质量人像视频。在大量经过预处理后的模拟退化人像和无参考退化人像测试集上进行对比实验,结果表明,GFP方法在主观视觉效果和FID、PSFR、SSIM、NIQE等客观量化指标上均优于其他人像深度复原方法,相较于其他人像深度复原方法,能够更有效地复原复杂应用场景下的低质量退化人像,更适用于视频侦查应用;通过使用YTF视频人像数据集进行对比测试实验,结果显示,本文所提出的添加预处理与逆处理过程的基于GFP的监控视频人像复原技术,对于低质量视频人像有更加优秀的复原效果。

基于CRISPR/Cas9基因编辑技术构建PD-L1-GFP报告基因HT29细胞株

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和同源重组技术在PD-L1基因的特定位置敲入绿色荧光蛋白(GFP)序列,构建含有PD-L1-GFP报告基因的结肠癌细胞(HT29)稳定细胞株。根据CRISPR-Cas9靶点设计原则,针对PD-L1基因终止密码子设计两对sgRNA,退火形成双链后连接至Lenti-V2空载质粒中,转化培养后提取质粒并测序验证。对于正确的Lenti-V2-sgRNA重组质粒,T7E1酶切验证其基因编辑效率。根据靶点位置设计左同源臂+GFP+右同源臂序列合成Donor片段,双酶切后连接至pUC19,重组载体转化扩增后同样进行质粒提取和测序验证。将验证成功的Lenti-V2-sgRNA和pUC19-donor-GFP共转染HT29细胞,荧光显微镜检测GFP表达情况,菌落PCR及基因测序验证GFP报告基因的靶向插入效果。经酶切和测序鉴定,靶向编辑PD-L1的Cas9载体Lenti-V2-gRNA和含GFP基因的Donor质粒pUC19-donor-GFP构建成功。两个重组质粒转染HT29细胞后,显微观察、多克隆验证、单克隆筛选及鉴定结果显示,GFP成功转入HT29细胞并进行了表达,经有限稀释法筛选出的单克隆细胞荧光均一,且与对照组相比,阳性细胞克隆的基因组PCR均检测到特异条带,表明在PD-L1终止密码子前成功插入了GFP片段,细胞株构建成功。通过基因编辑技术成功构建了稳定表达PD-L1-GFP报告基因的HT29结肠癌细胞株,建立了一个可以直观在细胞上观察PD-L1是否表达以及表达的强弱程度的系统,为后期体内外筛选调控PD-L1的上游新靶点及药物奠定了基础。

绿色荧光蛋白(GFP)研究进展

源于多管水母属 (AequoriaVictoria)等海洋无脊椎动物的绿色荧光蛋白 (Greenfluorescentprotein ,GFP)是一种极具潜力的标记物 。

GFP标记的球孢白僵菌在玉米中的定殖

为明确球孢白僵菌在玉米中的定殖分布规律以及不同施用方式和处理浓度对玉米生长发育的影响,本文利用绿色荧光蛋白(GFP)标记的球孢白僵菌,在激光扫描共聚焦显微镜下观测了球孢白僵菌在玉米根部、茎部和叶部的定殖情况,同时检测了不同接种方式在球孢白僵菌不同处理浓度下对玉米生长指标的影响。结果表明,球孢白僵菌在玉米不同组织部位上的定殖有着明显的差异,各球孢白僵菌接种处理中,均以叶部定殖的白僵菌孢子数最多,而茎部均未观测到孢子定殖;玉米根部仅在浸种和灌根处理中可见少量孢子。球孢白僵菌不同接种方式对其在玉米中定殖率的影响差异较大,灌根处理定殖率最高,为76.7%;其次为浸种处理,为73.3%;茎部注射处理及叶面喷施处理定殖率较低,分别为43.3%和36.7%。研究表明,不同施用方式及接种浓度球孢白僵菌孢悬液对玉米生长指标有一定的影响,球孢白僵菌可通过不同接种方式在玉米植株中定殖并扩散,对玉米的生长发育有一定的促进作用,其中以1×106～1×107孢子/mL球孢白僵菌孢悬液浸种或灌根,对玉米苗的促进生长作用最明显。

农杆菌介导稻瘟病菌绿色荧光蛋白(GFP)遗传转化研究

稻瘟病是水稻生产中的主要病害,抗病品种选育和利用是控制稻瘟病最有效措施。研究稻瘟病菌与水稻品种互作机制是培育抗病品种的基础。GFP(Green fluorescent protein)基因因其具有片段小、易与多种不同蛋白质N端或C端融合等特点,广泛应用于病菌与寄主植物互作研究中。研究以p BGg Hg作为转化载体,根癌农杆菌C58C1作为转化介体,转化稻瘟病菌的强致病菌株py1022。研究发现,250μg·m L-1潮霉素B能完全抑制稻瘟病菌生长,利用根癌农杆菌介导稻瘟病菌遗传转化的最佳条件为:稻瘟病菌分生孢子浓度为1×105个·m L-1,共培养时间为4 d,共培养AS浓度为200μmol·m L-1,共培养温度为28℃。随机挑取8个转化子分别进行PCR扩增后测序、荧光显微镜下观察、致病力及稳定性测定,结果表明GFP成功转化到稻瘟病菌中,可为稻瘟病菌与水稻品种的互作机制研究提供技术支撑。

生防菌ZJY-1及ZJY-116的GFP标记及其在黄瓜根围的生态适应性

将具有绿色荧光蛋白(GFP)标记和氯霉素抗性的重组质粒pRP22-GFP导入生防菌BrevibacillusbrevisZJY-1和Bacillus subtilisZJY-116中,用这些标记菌株处理黄瓜种子,出苗后通过定期分离计数具有上述表型的转化子,研究了2株生防菌在黄瓜根围的定殖规律.结果表明,在整个生育期2株生防菌株均能在黄瓜根围有效定殖,并在黄瓜盛花期和盛果期出现数量高峰.盆栽试验发现,引入黄瓜根围的2株生防菌有向周边杂草迁移的特性,且在前一季寄主植物死亡后,菌株可在下一季植株根围增殖.

慢病毒介导的GFP转染对小鼠骨髓间充质干细胞表型、增殖和分化能力的影响

运用慢病毒(Lentivirus)载体构建绿色荧光蛋白(GFP)在小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)中的转染体系,检测转染后MSCs的表型和增殖能力,并诱导其向成肌细胞分化,检测此转染体系对MSCs细胞表型、增殖和分化能力的影响.骨髓细胞悬液破红后贴壁法培养MSCs,采用流式细胞术鉴定细胞表面标记,鉴定MSCs纯度;Lentivirus-GFP以1、10、50和100的感染复数(MOI)转染MSCs,作用48h后流式细胞术及免疫荧光法检测转染效率和表达的荧光强度;MTT法检测转染后MSCs的细胞活力.诱导MSCs-GFP向成肌细胞分化,蛋白印记法(WB)检测成肌细胞特异性蛋白desmin和α-SMA的表达.流式细胞术检测结果显示,培养的MSCs表达CD44、CD90和CD105,不表达CD34、CD45和CD188,符合干细胞特性.MOI为1、10、50和100的转染效率分别为23.45%、93.51%、95.44%和95.55%,MOI为10时,转染效率较高,且对MSCs活力无明显影响.MSCs-GFP体外经成肌细胞诱导分化后,表达特异性抗原desmin和α-SMA.表明本研究成功构建了小鼠骨髓来源MSCs的Lentivirus-GFP转染体系,有效标记了MSCs细胞,且此标记对MSCs的表型、增殖和分化能力等细胞生物学特性无明显影响.

GFP基因在软枣猕猴桃愈伤组织原生质体中瞬间表达的初步研究

用PEG介导法对游离出来的软枣猕猴桃原生质体进行遗传转化,成功地将绿色荧光蛋白(GFP)基因导入了原生质体,并获得了瞬间表达.结果表明,影响GFP基因转化的因素主要是材料的生理状态,PEG的种类和浓度;适宜的转化条件和方法为,将从白色、较为疏松愈伤组织中游离的原生质体,悬浮到质量分数为13%甘露醇的洗液(CPW13)中,置于45℃水浴中热激5min,再放在冰浴中迅速冷却;加入质粒,轻轻混匀后静止10min;逐滴加入质量分数40%PEG6000介导转化,终浓度为100g·L-1,在室温下放置20min;逐滴加入CPW13稀释转化后的原生质体,以避免PEG浓度剧烈变化造成细胞膜破裂.

用gfp基因标记法研究大豆根瘤菌在大豆根部定殖结瘤情况

采用三亲本杂交的方法,将绿色荧光蛋白基因(gfp)转入高效、抗逆、广适应性的快生大豆根瘤菌Sinorhizobium frediiCCBAU 01287中,获得含gfp基因的转基因菌株CBAU 01287(G);平板传代和共生检测表明:外源质粒在CCBAU 01287中能够自我复制,稳定遗传。进一步研究表明,gfp标记菌CCBAU 01287(G)可用于实时监测根瘤菌在大豆根部的早期定殖情况和定殖密度的测定;标记菌株对大豆的生长及生物量的积累与出发菌株的效果无显著差异。

GFP标记溶磷草木樨中华根瘤菌CHW10B及其定殖

【目的】为有效利用草木樨中华根瘤菌CHW10B菌株,对绿色荧光蛋白（GFP）标记的菌株在南方红豆杉根际及其根部的定殖进行研究。【方法】采用修改的反复冻融转化方法,将穿梭载体p GFP4412质粒转化进入草木樨中华根瘤菌CHW10B细胞,对该菌株进行GFP标记,筛选荧光表达强烈且稳定遗传的转化子,对转化子的细胞及菌落形态特征进行观察,并采用钼锑抗比色法对其溶磷能力进行测定。在此基础上,以GFP基因标记和抗性标记作为示踪手段,将GFP标记的CHW10B菌株接种到南方红豆杉1年生盆栽实生苗根表面,借助荧光显微镜及稀释涂布技术,对根际土壤中GFP标记菌株进行定期回收检测。【结果】成功获得CHW10B菌株荧光表达强烈且稳定遗传的GFP转化子,该转化子及野生菌株均为革兰氏阴性（G-）,短杆菌,但二者在LB固体平板上的菌落形态有一定差别。野生菌株菌落呈圆形、边缘整齐,表面湿润黏稠,为乳白色;而标记菌株CHW10B-GFP2菌落表面为浅棕色,其他一致;标记菌株溶磷能力与野生菌株接近,发酵液上清液中可溶性磷含量分别为639.12和656.57 mg·L-1。GFP标记菌株在南方红豆杉根际的数量变化幅度较大,接种1天根际土壤中CHW10B转化子菌数为6.08×107cfu·g-1,随后细菌数量迅速减少,15天后标记细菌数量开始增多,25~40天菌体数量升高并呈平稳趋势。用荧光显微镜对接种40天后南方红豆杉的根部进行观察,发现在根系表面及其内部有大量发绿色荧光的GFP标记细胞存在。【结论】GFP基因标记的CHW10B菌株在南方红豆杉幼苗根际土壤中具有持久性定殖的能力;另外,该标记菌株能在根表面和内部定殖,具有内生性。

利用GFP和抗性双类型标记监测联合固氮菌在玉米根际的定殖

将来自质粒pKRP10、pKRP11和pKRP12的氯霉素、卡那霉素和四环素抗性基因分别插入质粒GFPmut2中gfp基因下游的PstI位点 ,得到gfp和不同抗性基因共存的重组质粒 ,转化Enterobactergergoviae 5 7- 7野生型菌株和耐铵工程菌E7后 ,得到既有抗生素抗性又在蓝光下呈现亮绿荧光的菌株 .用它们接种玉米后 ,利用这两种选择标记双重筛选重新分离到的细菌确定了接种菌在玉米幼苗根表面的定殖数目 ,同时用荧光显微镜观测了它们在玉米根表和土壤中的分布 .确证了GFP与抗生素抗性双标记定量环境中微生物的可靠性和GFP标记用于原位监测细菌分布的优越性 .图版 1图 1表 2参

绿色荧光蛋白(GFP)在真菌研究中的应用

绿色荧光蛋白 (greenfluorescentprotein ,GFP)来源于海洋生物水母 (Aequoreavictoria) ,由于其具有荧光性质稳定、直观、操作方便和不需添加外源底物就可以在活细胞中直接检测等无可比拟的优点 ,以GFP为报告基因已经被广泛地应用于真菌的分子生物学研究中。GFP基因通过随机插入真菌基因组的方法 ,已经被成功地用来研究真菌的生态、生防菌对病原菌的侵染模式及病原菌与其寄主的关系等 ;GFP基因通过与目标基因融合的方法 ,则被广泛地用于真菌的基因转录规则、蛋白质及细胞器定位。

α-synuclein-EGFP在体外培养SH-SY5Y细胞中过表达对包涵体形成及线粒体结构改变的影响

为了观察 α-synuclein-p EGFP真核载体在 SH-SY5 Y细胞内表达状况及其对细胞的影响 ,本研究用 L ipofect AMINE法转染 SH-SY5 Y细胞 ,用荧光显微镜检测报告基因表达产物 EGFP,用荧光免疫细胞化学法检测α-synuclein蛋白表达以及用 H-E染色、光学显微镜观察转基因表达产物在细胞内的积聚 ,电镜观察转基因细胞超微结构形态学变化 ,rhodamine12 3染色、荧光显微镜检测线粒体跨膜电位变化。结果证明 ,该载体转染 SH-SY5 Y细胞后 ,在细胞内同时表达报告基因和目的基因 ;外源基因的表达产物可在细胞内积聚形成包涵体并引起线粒体结构和功能改变。本研究结果提示 ,本实验获得的细胞模型可模拟 Parkinson病发生过程中一些基本的神经病理学特点 ,可为进一步探讨

BrdU,CFSE和GFP标记大鼠间充质干细胞的比较

目的:研究BrdU,CFSE和GFP作为大鼠间充质干细胞标记物的可行性.方法:分别用上述三种标记物标记大鼠间充质干细胞,检测即时、15和30d的标记率,通过检测细胞周期、凋亡率和描绘生长曲线,来明确标记物对体外培养大鼠间充质干细胞生长特性的影响;通过流式细胞仪检测标记物对细胞表面标志(CD29,CD34,CD44,CD45)表达的影响.结果:BrdU,CFSE,GFP的即时标记率为77.0%,99.4%,89.7%,1mo后分别下降至51.9%,77.5%,82.9%.三者对体外培养的大鼠间充质干细胞的生长特性和表面标志的表达均无明显影响.结论:GFP,BrdU和CFSE均可以作为大鼠间充质干细胞的标记物.

GAD67-GFP精神分裂症小鼠行为学改变及海马齿状回颗粒细胞层GABA能神经元的表达

目的:探讨谷氨酸脱羧酶67-绿色荧光蛋白(GAD67-GFP)基因敲入小鼠制备精神分裂症模型后学习与记忆功能的改变及海马齿状回颗粒细胞层GABA能神经元的表达。方法:利用聚合酶链式反应(PCR)鉴定GAD67-GFP基因敲入小鼠,MK-801连续腹腔注射2周制备精神分裂症动物模型,通过悬尾实验、Morris水迷宫实验、免疫荧光标记技术等,观察GAD67-GFP基因敲入小鼠的学习与记忆功能的改变及GABA能神经元在海马齿状回颗粒细胞层的表达。结果:停药后实验组与对照组比较:(1)实验组体重增加明显低于对照组(P<0.05);(2)行为学改变:1悬尾实验:实验组不动时间明显小于对照组(P<0.05);2Morris水迷宫实验:定位航行实验中实验组逃避潜伏期,游泳总路程明显长于对照组(P<0.05),而其平均游泳速度与对照组没有明显差异(P>0.05);空间探查实验中实验组经过平台所在点的次数和在平台所在象限的时间明显小于对照组(P<0.05);(3)在海马齿状回颗粒细胞层中实验组的GFP阳性细胞明显多于对照组(P<0.05)。结论:通过对GAD67-GFP基因敲入小鼠进行腹腔注射MK-801制备精神分裂症模型后,其学习与记忆功能显著下降,且海马齿状回颗粒细胞层GABA能神经元明显增加。提示精神分裂症后学习记忆功能减退可能与GABA能神经元的表达有关。

根癌农杆菌介导苎麻转绿色荧光蛋白(GFP)基因植株再生

以苎麻优良品系"5041-3"子叶作为受体,利用根癌农杆菌介导法进行了绿色荧光蛋白基因的遗传转化研究,农杆菌菌株为EHA105,重组质粒为pBINm-GFP5-ER。经农杆菌浸染后的子叶外植体经过共培养、选择培养、伸长培养和生根培养后再生出抗性植株,对抗性植株的再生过程进行了GFP荧光检测,结果表明,GFP基因能在苎麻中强烈表达,证明GFP基因能够在苎麻遗传转化中得到应用。对抗性植株的Southern杂交检测证实外源基因已整合到苎麻基因组中。

GFP基因在新疆小拟南芥和拟南芥中的表达分析

以质粒pMCB30为模板,扩增GFP基因,连接到载体pCMBIA2300-35S-OCS上,构建过量表达载体p35S:GFP,将其转入农杆菌GV3101.通过农杆菌介导法将p35S:GFP载体分别转入新疆特色植物小拟南芥和拟南芥中.T0代经含有卡那霉素的1/2MS培养基筛选,获得了T1代转基因小拟南芥2株,T1代转基因拟南芥9株.通过激光共聚焦显微镜观察,在转基因小拟南芥和拟南芥的根尖细胞中均可检测到GFP绿色荧光蛋白;对转基因植株进行PCR扩增,均可检测到GFP基因,表明GFP基因已成功转入小拟南芥和拟南芥中.该研究建立了小拟南芥的遗传转化体系,为进一步利用GFP基因和进一步研究小拟南芥的功能基因奠定基础.

利用GAD67-GFP基因敲入方法显示小鼠脊髓内表达GFP的GABA能神经元的分布(英文)

γ-氨基丁酸 (GABA)是脊髓背角、前角内主要的抑制性神经递质。为了更好地观察脊髓背角内 GABA能神经元的形态和功能 ,本研究使用了两种谷氨酸脱羧酶 67-绿色荧光蛋白 (GAD67-GFP)基因敲入小鼠 ,并观察了敲入小鼠脊髓内的 GFP表达状况。用免疫荧光组织化学双标记方法显示脊髓内所有的 GF P阳性神经元基本上都呈 GAD67和 GABA阳性 ;GFP阳性神经元在脊髓背角的 ～ 层最为密集 ,背角深层内侧部及中央管周围呈中等密度分布 ,而在脊髓背角其它部位及前角则呈散在分布。脊髓内 GFP阳性神经元的分布与 GABA能神经元的分布一致。本文作者等还进一步在 GAD67-GFP敲入小鼠中观察了 GFP和神经元标志物神经元核蛋白 (Neu N )的共存状况。脊髓背角内 GFP阳性神经元分别占 、 和 层的 Neu N阳性神经元的 3 1.5 %、3 3 .3 %和 44 .7% ,与以往的 GABA免疫组化研究结果基本一致。本研究表明 GAD67-GFP基因敲入小鼠脊髓内的 GFP在GAD67启动子的调节下正确地表达于 GABA能神经元 ,该基因敲入小鼠可用于脊髓

PTD-GFP融合蛋白的纯化及其转导效率测定

为了纯化PTD-GFP融合蛋白,测定融合蛋白转导效率,研究融合蛋白在He La细胞中的转导效率与浓度的关系,试验诱导表达军事兽医研究所六室保存的含有p ET-20b-PTD-GFP重组质粒的BL21表达菌,超声破碎,取上清液通过多个层析介质得到高纯度融合蛋白,将纯化的蛋白加入到体外培养的He La细胞中,在荧光显微镜下观察PTD-GFP的转导情况,用InfiniteF500多功能酶标仪检测荧光强度,分析融合蛋白浓度对转导效率的影响。结果表明:纯化的重组蛋白纯度达到90%。原浓度蛋白和1/2原蛋白浓度24 h后转导效率都达到100%。通过统计学软件得到转导效率与PTD-GFP融合蛋白浓度之间的线性关系,回归系数为0.151 456,相关系数为0.954。说明融合蛋白纯度较高,其转导效率对蛋白浓度具有依赖性,在一定浓度范围内随着浓度增加转导效率增加。