GSTP1通过调控STAT3信号通路促进乳腺癌细胞增殖与阿霉素耐药

目的 探讨谷胱甘肽S-转移酶P1(GSTP1)对人乳腺癌MCF-7细胞增殖与阿霉素耐药性的影响及其作用机制。方法 Western blotting检测野生型乳腺癌细胞MCF-7和阿霉素耐药乳腺癌细胞MCF-7/ADR中的GSTP1表达量,通过在MCF-7细胞中转染Flag-GSTP1质粒过表达GSTP1,在MCF-7/ADR细胞中转染GSTP1敲低慢病毒(shGSTP1)干扰GSTP1表达;平板克隆形成实验、CCK-8法和流式细胞术检测转染后乳腺癌细胞的增殖能力、阿霉素耐药性及凋亡水平的变化。Western blotting检测GSTP1表达水平的变化对STAT3通路激活的影响。结果 GSTP1在MCF-7细胞中表达量极低,且显著低于MCF-7/ADR细胞系。GSTP1过表达的MCF-7/ADR细胞克隆形成数量显著多于野生型MCF-7细胞(P<0.05)。过表达GSTP1显著提升了MCF-7细胞的增殖能力,而在MCF-7/ADR细胞系干扰GSTP1表达水平后显著抑制了细胞增殖能力(P<0.05)。CCK-8结果显示,在0.1、1、10、50μmol/ml不同浓度的阿霉素处理下,GSTP1表达水平与MCF-7细胞对阿霉素的耐药性呈正相关(P<0.05)。流式细胞术检测结果显示,GSTP1过表达组(Flag-GSTP1)和对照组(Flag)的凋亡率分别为(11.41±1.16)%和(21.1±1.72)%,GSTP1过表达显著抑制了阿霉素诱导的细胞凋亡(P<0.05)。Western blotting检测结果显示,GSTP1的过表达激活了STAT3信号通路,同时在MCF-7/ADR细胞系中抑制STAT3显著降低了GSTP1的表达水平(P<0.05)。结论 GSTP1通过上调STAT3表达调节乳腺癌细胞MCF-7的增殖能力和对阿霉素的耐药性。

狂犬病病毒突变株rRC-HL(GX074P1M1)的构建及其生物学特性

【目的】构建狂犬病病毒(RABV)突变株r RC-HL(GX074P1M1)并探究其生物学特性,分析磷蛋白(P)与基质蛋白(M)部分区域联合突变对RABV转录和复制水平的影响,以了解RABV的致病机制,为靶点预防与治疗提供理论依据。【方法】通过反向遗传学技术,将RABV街毒株GX074的P蛋白P1区域(第48~78位氨基酸)与M蛋白M1区域(第1~22位氨基酸)联合嵌入弱毒株RC-HL相应位置,通过间接免疫荧光试验(IFA)、实时荧光定量PCR和Western blotting分别测定突变毒株和对照毒株[RC-HL、GX074、r RC-HL(GX074PM)和CVS-11]感染细胞BSR/T7-9后的病毒滴度与核蛋白(N)基因、P基因和M基因及其蛋白相对表达量。【结果】通过病毒拯救成功获得突变毒株rRC-HL(GX074P1M1)。病毒多步生长曲线测定结果显示,感染BSR/T7-9细胞24~96 h内,突变毒株rRC-HL(GX074P1M1)的病毒滴度均高于亲本毒株RC-HL和GX074。通过实时荧光定量PCR检测发现,突变毒株rRC-HL(GX074P1M1)在感染24和48 h时,N基因、P基因和M基因的相对表达量均显著(P<0.05)或极显著(P<0.01,下同)高于亲本毒株RC-HL和GX074。Western blotting检测结果显示,在感染24 h时,与亲本毒株RC-HL相比,突变毒株rRC-HL(GX074P1M1)的N蛋白、P蛋白和M蛋白相对表达量均小幅上升;在感染48 h时,突变毒株rRC-HL(GX074P1M1)的N蛋白、P蛋白和M蛋白相对表达量均极显著高于亲本毒株RC-HL与GX074。【结论】RABV街毒株GX074的P1和M1区域联合嵌入弱毒株RC-HL获得的突变毒株r RC-HL(GX074P1M1)复制及转录水平比亲本毒株高,在细胞内具有更强的增殖能力,表明街毒株GX074的P蛋白P1区域和M蛋白M1区域在促进病毒转录及复制中发挥协同作用。

CC类趋化因子22、叉头框蛋白P1在急性髓系白血病外周血中的表达及对预后的预测价值

目的探讨急性髓系白血病(AML)病人外周血中CC类趋化因子22(CCL22)、叉头框蛋白P1(FOXP1)表达水平及其预后预测价值。方法选择2018年5月至2019年5月在孝感市中心医院、华中科技大学医学院附属同济医院及咸宁市中心医院确诊的68例AML病人设为观察组,另取同期健康体检者68例作为对照组,采用酶联免疫法测定外周血CCL22,FOXP1表达水平,分析其与临床特征的关系;采用Pearson法分析AML病人外周血中CCL22,FOXP1表达的相关性;采用Kaplan-Meier生存分析法分析CCL22,FOXP1表达与总体生存时间(OS)的关系;采用Cox比例风险回归模型分析病人预后死亡的影响因素。结果与对照组相比,观察组CCL22[(600.27±62.89)ng/L比(756.84±100.86)ng/L],FOXP1[(56.02±13.68)ng/L比(103.06±22.16)ng/L]表达均明显升高(t=10.86,14.90,均P<0.05);CCL22,FOXP1表达水平与AML病人年龄、性别、染色体预后、血红蛋白(HGB)、血小板计数(PLT)、FMS样酪氨酸激酶3-内部串联重复基因(FLT3-ITD)、核仁磷酸蛋白基因1(NPM1)突变无关(χ^(2)=0.06~2.95,均P>0.05),与脾肿大、白细胞计数(WBC)有关(χ^(2)=5.90~8.59,均P<0.05);Pearson法分析结果显示,AML病人外周血中CCL22与FOXP1表达呈正相关(r=0.27,P<0.05);Kaplan-Meier法分析结果显示,AML病人外周血CCL22,FOXP1高表达组3年生存率均低于低表达组(47.06%比70.59%,44.12%比73.53%)(χ^(2)=6.50,P<0.05);多因素logistic回归分析结果显示,CCL22,FOXP1是影响AML病人预后的独立危险因素(P<0.05)。结论CCL22,FOXP1在AML病人外周血中呈高表达,CCL22,FOXP1高表达组病人3年生存率均低于低表达组,二者有望成为AML病人预后评估的分子标志物。

壮骨方通过Foxp1、PPARγ调控老年性骨质疏松小鼠成骨成脂平衡的机制研究

目的探讨壮骨方通过调节Foxp1、PPARγ干预老年性骨质疏松小鼠成骨成脂平衡的机制。方法取30只SAMP6小鼠随机分为模型组、碳酸钙+阿法迪三组和壮骨方组,每组10只,另取10只SAMR1小鼠作为空白组。持续干预8周后,采用Micro CT检测小鼠骨微结构变化,IF染色检测骨组织中成骨因子OCN、Osterix、DMP1,成脂因子FABP4、Cebpa,Western blot和RT-PCR分析Foxp1、Notch1、PPARγ的蛋白及mRNA表达水平。结果与空白组比较,模型组小鼠BV/TV、Tb.Th、Tb.N明显下降(P<0.05),Tb.Sp、SMI显著升高(P<0.01),骨组织中OCN、Osterix和DMP1水平显著降低(P<0.01),FABP4、Cebpa水平显著升高(P<0.01),Foxp1、Notch1的mRNA及蛋白表达水平显著下调(P<0.01),PPARγ的mRNA及蛋白表达水平显著上调(P<0.01)。壮骨方干预后小鼠BV/TV、Tb.Th、Tb.N明显上升(P<0.05),Tb.Sp、SMI显著降低(P<0.01),骨组织中OCN、Osterix、DMP1水平与Foxp1、Notch1的mRNA及蛋白表达水平呈增长趋势(P<0.05),FABP4、Ceb⁃pa水平与PPARγ的mRNA及蛋白表达水平显著下降(P<0.01)。结论壮骨方可能通过提高骨组织Foxp1、Notch1,降低PPARγ水平,改善老年性骨质疏松症成骨成脂平衡。

谷胱甘肽S转移酶P1和X线修复交错互补基因1基因多态性与前列腺癌化疗敏感性及预后关系研究

目的:探究前列腺癌患者谷胱甘肽S转移酶P1(GSTP1)和X线修复交错互补基因1(XRCC1)基因多态性与化疗敏感性及预后的关系。方法:选取2018年5月至2021年5月行雄激素剥夺治疗+双药化疗的前列腺癌患者103例,收集患者临床资料,采用PCR-PFLP方法对患者行基因分型,并分析其GSTP1-rs1695位点和XRCC1-rs25487位点的多态性,分析其与化疗敏感性的关系,并探究GSTP1和XRCC1基因多态性与患者3年生存率的相关性。结果:103例前列腺癌化疗患者GSTP1-rs1695位点和XRCC1-rs25487位点分布均符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=9.794,P>0.05)。GSTP1-rs1695位点中AA基因型占比为65.05%(67/103),AG基因型占比为23.30%(24/103),GG基因型占比为11.65%(12/103);XRCC1-rs25487位点中AA基因型占比为29.13%(30/103),AG基因型占比为50.49%(52/103),GG基因型占比为20.39%(21/103)。GSTP1-rs1695 AA型化疗敏感性为35.82%,低于AG/GG型58.33%(P<0.05)。XRCC1-rs25487 AA型化疗敏感性为40.00%,AG/GG型45.21%,两者差异无统计学意义(P>0.05)。GSTP1-rs1695、XRCC1-rs25487不同表型患者3年无进展生存率之间无明显差异(P>0.05)。GSTP1-rs1695 AA型3年总生存率低于AG/GG型;XRCC1-rs25487 AA型低于AG/GG型(P<0.05)。多因素COX回归分析结果显示,GSTP1-rs1695 AA型、XRCC1-rs25487 AA型均为前列腺癌患者化疗后3年总生存期的独立影响因素。结论:GSTP1-rs1695、XRCC1-rs25487基因多态性对前列腺癌患者化疗敏感性和预后均有一定影响,GSTP1-rs1695和XRCC1-rs25487 A等位基因突变均可导致更短的3年生存率,G等位基因突变可带来更好的化疗敏感性和生存期。

微生物发酵法制备核酸酶P1及其性质和应用

核酸酶P1又名5′-磷酸二酯酶,是酶法制备5′-核苷酸的关键酶类。文章对核酸酶P1的结构、性质、发酵工艺及其在食品领域的应用进行了总结,并对其未来的发展方向进行了展望。

阴离子交换树脂固定化核酸酶P1的研究

5′-核苷酸及其衍生物因具有较高的营养保健价值和药用价值,市场需求不断增大。核酸酶P1是目前5′-核苷酸工业生产的关键酶,但游离酶存在难以重复利用、消耗量过大等缺点。为了解决上述问题,提高核酸酶的利用效率,笔者利用不同类型树脂对核酸酶P1进行固定化。以核酸酶P1的吸附量和固定化酶的酶活为评价标准,研究发现阴离子交换树脂1(AER1)固定化时效果最佳,优化后的最佳固定化条件为酶量3 644.7 U/mL(2.2 mL)、戊二醛质量分数0.25%、交联时间1.5 h、固定化时间10.0 h、pH 5.1。该条件下制备的核酸酶P1的比酶活为47 980.95 U/g。在此最佳条件下,固定化酶的热稳定性有一定程度的提高;固定化酶的酸碱稳定性大幅度提高;固定化酶在4℃下保存6周后,酶活保留51.8%,是游离酶的1.6倍。

子宫内膜异位症不同r-AFS分期患者血清Furin,TGF-β,VEGF,netrin-1水平表达及Furin基因P1启动区r2071410 C/T位点多态性分析

目的了解子宫内膜异位症(endometriosis,EMT)不同r-AFS分期患者血清弗林蛋白酶(Furin)、肿瘤生长因子-β(tumor growth factor-β,TGF-β)、血管生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及神经轴突导向因子-1(neuron towards axon guidance factor-1,netrin-1)水平表达及Furin基因P1启动区r2071410 C/T位点多态性,探讨其与深圳地区EMT发病的相关性。方法选取2021年5月~2023年1月深圳市龙华区人民医院确诊的EMT患者102例为EMT组,并根据r-AFs分期法将EMT组分为I~II期和III~IV期。同时收集同期非EMT患者78例为对照组。采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清Furin,TGF-β,VEGF及netrin-1水平,并采用反转录-实时荧光定量聚合酶链反应法(reverse transcription-real time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)分析Furin基因P1启动区r2071410 C/T位点多态性。结果EMT组患者血清Furin(140.84±47.02pg/ml),TGF-β(376.46±82.36ng/L)和VEGF水平(167.67±53.02ng/L)明显高于对照组(55.49±13.67pg/ml,216.37±15.04ng/L,102.27±8.45ng/L),而netrin-1水平(48.37±15.20pg/ml)明显低于对照组(165.85±15.63pg/ml),差异具有统计学意义(t=28.409,20.347,16.915,36.653,均P<0.05)。III~IV期患者血清Furin(192.41±20.62pg/ml),TGF-β(452.61±72.03ng/L)和VEGF水平(201.84±28.01ng/L)明显高于I~II期(78.05±16.54pg/ml,283.75±56.92ng/L,126.07±19.35ng/L),而netrin-1水平(37.95±11.34pg/ml)明显低于I~II期(61.05±9.52pg/ml),差异有统计学意义(t=31.071,18.054,19.183,21.625,均P<0.05)。经Pearson/Spearman相关性分析结果显示,Furin与TGF-β,VEGF水平及临床分期呈正相关(r=0.6149,0.7526,0.7905,均P<0.05),而与netrin-1水平呈负相关(r=-0.6701,均P<0.05)。EMT组患者Furin基因P1启动区r2071410 C/T位点TT基因型和T等位基因频率(42.16%,55.39%)明显高于对照组(7.69%,19.87%),且III~IV期TT基因型和T等位基因频率(51.79%,65.18%)比I~II期(30.43%,43.48%)明显升高,差异具有统计学意义(χ^(2)=26.500,46.472,4.721,9.626,均P<0.05)。EMT组不同基因型患者血清Furin水平差异具有统计学意义(F=51.286,P<0.001),其中TT基因型患者血清Furin水平(216.29±68.53pg/ml)明显高于CC(83.04±21.37pg/ml)和CT基因型(89.18±20.95pg/ml),差异具有统计学意义(t=27.146,25.719,均P<0.01),但CC与CT基因型之间差异无统计学意义(t=1.326,P>0.05)。结论EMT患者血清Furin水平明显升高,且与TGF-β,VEGF,netrin-1水平及临床分期呈一定相关性;同时Furin基因P1启动区r2071410 C/T位点呈多态性分布,其中TT基因型患者血清Furin水平升高更为明显,可能与深圳地区EMT发病有关。

巨大芽孢杆菌P1的解磷效果与发酵条件研究

以巨大芽孢杆菌P1为研究对象,利用钼锑抗比色法测定了菌株的解磷能力,采用单因子实验及正交实验优化了菌株的最佳发酵条件,并在10 L发酵罐上进行了发酵条件验证。巨大芽孢杆菌P1在蛋黄培养基上可产生明显的溶磷圈,溶磷圈直径和菌落直径的比值D/d=4.5。在卵磷脂液体培养基中培养4 d后,上清液中的有效磷含量为55.66 mg/mL,是对照的101.2倍,说明溶磷效果明显。单因子实验表明,最佳培养温度为32℃,培养时间为32 h,培养基初始pH为7.5。正交实验表明,最佳培养基组成为玉米粉20 g,黄豆粉10 g,K2HPO41.5 g,MgSO4.7H2O 1.5 g,CaCO31.5 g,H2O 1 000 mL,pH 7.5。方差分析表明,玉米粉、黄豆粉在α=0.05水平上对实验结果的影响存在显著性差异。10 L发酵罐发酵结果表明,巨大芽孢杆菌P1发酵32 h基本达到终点,菌数达到60.0×108cfu/mL,芽孢比率达90%以上。

乳铁蛋白素B和天蚕素P1对投喂大肠杆菌断奶仔猪生长及肠道微生物区系的影响

本研究旨在探讨投喂大肠杆菌后乳铁蛋白素B(Lfcin B)和天蚕素P1(Cec P1)对断奶仔猪生长及肠道微生物区系影响。选用48头28日龄断奶的德国大白杂交二代断奶仔猪[(7.18±1.32)kg],根据体重、窝别、性别将其随机分成4组:对照组、产肠毒素组(ETEC)、乳铁蛋白素组(Lfcin B)、天蚕素组(Cec P1),每组2个重复,每个重复6头猪,试验期为12 d。结果表明,1)试验期间对照组、ETEC组、Lfcin B组、Cec P1组仔猪体重及平均日增重均差异不显著(P>0.05)。2)ETEC组仔猪腹泻率显著高于其他组(P<0.05),而其他组之间差异不显著(P>0.05)。在进行第1次攻毒后,即仔猪29日龄,ETEC组、Lfcin B组和Cec P1组仔猪的粪便干物质均显著下降(P<0.05),第2次攻毒后的第2天,即仔猪31日龄,Lfcin B组和Cec P1组的仔猪分别饲喂了Lfcin B和Cec P1,对照组仔猪的粪便干物质仍显著高于ETEC组和LfcinB组(P<0.05),但已与Cec P1组差异不显著(P>0.05)。3)各组仔猪的肠道微生物区系差异不显著(P>0.05)。由此可知,各组仔猪生长及肠道微生物区系差异不显著,但Cec P1来源于猪肠道微生物寄生线虫,比Lfcin B更能适应肠道环境,更有利于仔猪健康。

口蹄疫病毒P1基因在大肠杆菌中的高效表达及其生物活性的初步分析

将口蹄疫病毒 (FMDV)结构蛋白基因P1的完整cDNA序列插入原核表达性载体pGEX KG中 ,使P1基因与GST融合 ,获得融合表达质粒pKG P1,转化E .coliBL2 1 (DE3) ,经IPTG诱导 ,SDS PADE结果表明GST P1融合蛋白获得高效表达 ,Western blot检测证实表达的融合蛋白具有免疫学活性 ,表达产物主要存在于细菌裂解液上清中。进一步采用GST纯化试剂盒纯化P1蛋白并作为诊断抗原 ,建立了P1 ELISA诊断方法 ,与FMD间接血凝 (IHA)检测方法平行检测 86 4份血清样品 ,总的符合率达87%。

桑黄多糖P1对肝癌HepG2细胞周期和钙调蛋白信号通路的影响

目的探讨桑黄多糖P1抑制人源性肝癌Hep G2细胞增殖的作用机制。方法桑黄多糖P16.25~200 mg·L-1与Hep G2细胞作用48 h,MTT法检测细胞存活率。桑黄多糖P1 100和200 mg·L-1与Hep G2细胞作用48 h,流式细胞术检测细胞周期和凋亡;荧光分光光度法测定细胞内Ca2＋浓度;实时荧光定量PCR检测细胞内钙调蛋白（Ca M）、钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ（Ca MKⅡ）、表皮生长因子（EGF）及其受体（EGFR）、K-ras和c-fos基因表达;Western蛋白质印迹法检测细胞内Ca MKⅡ和Kras蛋白表达。结果桑黄多糖P1对Hep G2细胞存活的抑制率随药物浓度的增大而显著提高,100和200 mg·L-1时抑制率高达44.0%和61.3%。桑黄多糖P1 200 mg·L-1处理48 h S期细胞百分含量明显升高,由对照组的（23.3±3.4）%升高至（37.8±2.2）%（P〈0.01）,而G2/M期细胞百分含量明显降低,由对照组的（15.3±1.2）%降至（3.4±1.9）%（P〈0.01）;细胞凋亡率无明显变化。与对照组相比,桑黄多糖P1 100和200 mg·L-1处理48 h后Ca M,Ca MKⅡ,EGF,EGFR,K-ras和c-fos mRNA水平显著下降（P〈0.01）;Western蛋白质印迹检测结果显示,桑黄多糖P1作用48 h后Hep G2细胞内Ca MKⅡ和K-ras蛋白水平与对照组相比显著下降（P〈0.01）。桑黄多糖P1 200 mg·L-1处理细胞后,细胞内Ca2＋荧光强度显著升高,0~20 min内分别由951增至1430（P〈0.01）,而对照组一直维持在1150左右。结论桑黄多糖P1可能通过提高细胞内Ca2＋浓度以及下调Ca M,Ca MKⅡ,EGF,EGFR,K-ras和c-fos基因的表达,诱导Hep G2细胞S期阻滞,从而抑制Hep G2细胞增殖。

核酸酶P1活性中心金属离子与氯化钴(Ⅱ)相互作用

核酸酶P1是一种重要的DNA与RNA水解酶。本文利用ICP、VIS、NMR、酶活性测定等分析方法,首次拓展研究了核酸酶P1与CoCl2的直接相互作用。结果发现:核酸酶P1活性中心Zn?离子可被外加CoCl2中的Co?部分取代,而Co?进入酶的活性中心,生成相应的酶衍生物“Co?-P1”,并影响了酶的催化活性。与此同时还获得了Co?进入核酸酶P1活性中心Zn2位上的酶衍生物1HNMR谱。

P1因子分子克隆的体外感染性分析

利用脂质体分别将类猪圆环病毒2型的P1因子的单拷贝分子克隆和双拷贝串联分子克隆转染PK-15细胞，电镜检测可在转染P1因子双拷贝串联分子克隆的PK-15细胞的胞浆和胞核中发现包涵体。相比较而言，胞浆包涵体数量较多，基本呈圆形，直径0.1～0.3 μm；胞核包涵体有2种类型：一种为小而圆的、直径约0.1 μm的高电子密度的小体；一种是大小为0.4～0.8 μm、略呈六角形的包涵体。将转染细胞连续传代5次，通过PCR可在转染P1因子双拷贝串联分子克隆的细胞传代物中检测到P1因子的DNA。这是首次报道P1因子的分子克隆在体外具有感染性，为进一步研究P1因子在体内的生物学意义奠定了物质基础。

急性淋巴细胞白血病患儿GSTP1及MTHFR基因多态性对大剂量甲氨蝶呤不良反应的影响

目的:研究急性淋巴细胞白血病(ALL)患儿的GSTP1及MTHFR基因多态性对大剂量甲氨蝶呤(HDM TX)不良反应的影响。方法:对2014年1月-2016年1月98例ALL患儿采用PCR方法测定C677T A303G及MTHFR C677T的多态性,观察患儿HD-M TX化疗期间的不良反应发生情况,分析C677T及MTHFR对不良反应发生的影响。结果:98例患儿中61例(62.24%)存在有至少1个基因位点的变异;C677TA303G基因多态性表现:A基因频率84.69%,G基因频率15.31%;MTHFR C677T基因多态性表现:C基因频率66.33%,T基因频率33.67%。98例患儿中,7例(7.14%)发生骨髓抑制,23例(23.47%)发生肝损害,15例(15.31%)发生肾损害,48例(48.98%)发生胃肠道反应,46例(46.94%)发生黏膜损害。对患儿的年龄、性别、危险程度及MTX的剂量进行校正后分析显示,基因多态性与骨髓抑制、胃肠道及黏膜损害的发生无显著相关性(P>0.05)。然而,变异基因数量与肝功能及肾功能损害的发生具有显著相关性(P<0.05)。结论:MTHFR及C677T基因联合变异时患儿的M TX不良反应发生风险明显增加,对此应引起临床上的重视。

马铃薯Y病毒福建分离物P1基因的分子变异和结构特征

为揭示马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)P1基因的分子变异及结构特征,并查明福建分离物P1基因的变异来源。文章设计一对简并引物从感染PVY的马铃薯病叶扩增、克隆获得福建分离物P1基因的cDNA全长序列,分析其核苷酸序列和氨基酸序列的特征,并采用贝叶斯法重建P1基因的系统发育树。结果显示,12个福建分离物均成功扩增出预期大小(约915 bp)的特异性片段,P1基因的核苷酸序列与已报道的PVY不同株系的核苷酸序列一致性为73%～99%;QK44、XT02、XT08、LH05分离物的309 nt位置均检测到一个强烈的重组信号。12个PVY分离物中,P1蛋白有85个变异的氨基酸位点,表明其高度变异;P1蛋白的第41～275位是一个高度保守的结构功能域,含有3个保守的活性位点(H192、D201、V235);系统发育分析显示,福建分离物形聚为3种不同的簇,其对应的卷曲结构(Coiled-coil domain)和空间结构也不相同,表明不同株系型的P1基因在系统发育关系上分化较大。该研究结果表明PVY P1基因在核苷酸序列、氨基酸序列以及空间结构具有高度变异性,但行使P1蛋白功能的活性位点所在的氨基酸(H192、D201和V235)均高度保守;福建分离物P1基因的变异源主要来自碱基突变和基因重组。

SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测类猪圆环病毒因子P1

该研究旨在建立快速、敏感和特异的检测类猪圆环病毒因子P1的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR法,用于P1的早期诊断。以感染P1的猪血清DNA提取物为模板,采用PCR扩增P1 101 bp的基因片段,将其克隆至pMD18-T载体,重组质粒测序并进行同源性分析;以阳性质粒为模板,建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法,并进行敏感性和特异性检测。经测序证实扩增片段属于P1,所建立的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测P1的反应在101-108拷贝/μL之间具有良好的线性关系,反应的检出下限为10拷贝/μL,而对猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等的检测为阴性,表明该方法敏感、特异。成功建立了SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测P1载量的方法,为P1致病机制和机体免疫保护机制的研究提供了技术平台。

重组免疫毒素hIL-2-LuffinP1的构建及表达

目的 构建人分泌型IL 2与免疫毒素LuffinP1的重组基因原核表达载体,并对其产物进行鉴定及纯化。方法 采用基因工程原理,将IL 2 LuffinP1的重组基因片段克隆入表达载体pET2 0b(+ )中,经酶切及DNA序列测定鉴定正确,转化表达宿主菌Origami(DE3 ) pLysS中,经IPTG诱导表达含His标签的融合蛋白 重组免疫毒素hIL 2 LuffinP1。结果 成功构建了免疫毒素表达载体pET2 0b(+ ) hIL 2 LuffinP1,获得纯化的重组免疫毒素,并经Westernblot鉴定正确。结论 hIL 2 LuffinP1的成功构建,为进一步研究它在抗移植排斥中的作用奠定了基础。

Luffin P1-KDEL的构建、表达、纯化及鉴定

目的构建植物毒素Luffin P1的原核表达质粒PET32a(+)-Luffin P1,并对其进行诱导表达,以及表达蛋白的纯化及鉴定。方法采用基因工程技术将重组基因片段Luffin P1克隆到表达载体pET32a(+)中,经酶切及DNA序列分析正确后,转化至表达宿主菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达Luffin P1融合蛋白,并用His标签抗体对该融合蛋白进行Western blot鉴定,对鉴定正确的融合蛋白进行纯化,肠激酶酶切及再纯化。结果成功的构建了原核表达载体pET32a(+)-Luffin P1,获得了纯度较高的Luffin P1蛋白。结论通过基因工程合成Luffin P1蛋白是成功的,并为进一步对Luffin P1功能研究及制备免疫毒素的弹头鉴定了实验基础。

一株类猪圆环病毒2型因子P1的全基因组序列测定与分析

【目的】确定猪体内存在与猪圆环病毒2型核苷酸序列高度同源的因子。【方法】首先利用PCR方法对来自临床表现为猪断奶后多系统衰竭综合征的猪血清所抽提的DNA进行扩增,根据获得的序列再设计引物进行反向PCR,拼接得到类猪圆环病毒2型因子P1的全基因组序列,最后根据P1全基因组序列设计引物扩增其全基因组加以验证。【结果】首次完成了类猪圆环病毒2型因子P1的全基因组序列测定。测序结果表明P1因子为环状DNA基因组,全长648个核苷酸,包括3个开放阅读框。除5′端16个核苷酸外,P1因子与国内猪圆环病毒2型BF毒株的核苷酸同源率为98.42%。系统进化分析表明P1与猪圆环病毒有很近的亲缘关系。【结论】猪体内存在类猪圆环病毒2型因子P1。