大肠杆菌E.coli HB101(pBR322)高密度培养过程质粒的稳定性

通过正交实验考察了大肠杆菌E.coli HB101-pBR322)高密度培养过程中，不同培养条件对质粒的稳定性和β(内酰胺酶活力的影响. 结果表明，当温度在33(39oC、pH为6.4-7.2、DO为 40%-80%、 补料速率在5.4-10.8 g/h范围内变化，以及细胞密度达到27.3 g/L、比生长速率达到0.73 h-1时，质粒没有发生丢失现象，但在培养过程中β-内酰胺酶的活力降低.

pBR322-Red在大肠杆菌lac操纵子基因敲除和敲入中的应用

pBR32 2 - Red是一种新型重组工程系统 ,它携带了λ 噬菌体Red重组酶基因和一系列调控元件。对pBR32 2 Red最优重组条件进行探索后应用该质粒提供的体内同源重组功能 ,在菌株W3110体内 ,对染色体上的lac操纵子进行了基因修饰 ,包括 :①运用kan- sacB选择反选择方法和重叠引物方法敲除了阻遏基因lacI,②运用kan -sacB选择反选择方法和线性双链DNA介导的DNA重组方法将报告基因lacZ敲入lacA和lacY的位置 ,并且首次测定了报告基因lacZ在这三个结构基因位置的组成性表达情况。结果表明运用不同的重组策略 ,pBR32 2- Red系统都能方便有效地对大肠杆菌W3110染色体进行基因敲除和敲入修饰。

磁场对质粒pBR322DNA的影响

讨论了经５００ｍＴ、９００ｍＴ、１２００ｍＴ、１５００ｍＴ恒磁场作用后的质粒ｐＢＲ３２２ＤＮＡ与Ⅱ型限制性内切酶ＥｃｏＲⅠ、ＨｉｎｄⅢ、ＢａｍＨⅠＳａｌⅠ、ＰｓｔⅠ、ＰｕｖⅡ、ＴａｑⅠ、ＢｇｌⅠ、ＲｓａⅠ、ＨｉｎｆⅠ、ＡＰａⅠ、ＫｐｎⅠ等的单酶解、双酶解及多酶解反应。从琼脂糖电泳分离酶解片段的结果，发现经磁场作用过的ｐＢＲ３２２ＤＮＡ在３３６１—６３１ｂｐ的区段内产生了一个被ＨｉｎｆⅠ识别的新序列ＧＡＮＴＣ，证明了磁场作用能引起ＤＮＡ点突变。

三核铜配合物[Cu_3L_2](ClO_4)_2(H_2L=1,3-双(2-羟基-1-苯基-亚甲基)-丙烷)的合成与对pBR322 DNA的切断作用

利用席夫碱配体 [H2 L =1,3 双 (2 羟基 1 苯基 -亚甲基 ) -丙烷 ]与铜盐作用 ,得到了配合物 [Cu3 L2 ] (ClO4) 2 ,并用X射线单晶衍射测定了其晶体结构 .研究了该三核铜配合物与质粒pBR3 2 2DNA之间的相互作用 ,琼脂糖凝胶电泳实验结果表明该配合物能够将pBR3 2 2DNA从超螺旋构型切割成开环型和线型 .同时 ,紫外光谱实验可以推测 ,配合物在对pBR3 2 2DNA进行切断时 。

EHEC O157 △ler/stx (pBR322::stx1/2B::eae)对小鼠免疫保护作用的实验研究

通过粘膜免疫途径对基因工程菌EHEC O157Δler/stx(pBR322::stx1/2B::eae)进行小鼠免疫保护作用实验研究。结果表明,用EHEC O157Δler/stx(pBR322::stx1/2B::eae)灌胃免疫小鼠能够诱导小鼠产生抗EHEC O157特异性免疫应答,两次免疫后7d,免疫组血清IgG抗体显著高于对照组,14 d检测IgG抗体达到最高峰,粪便中检测到高水平的抗EHEC O157特异性IgA抗体,表明该工程菌可以诱导肠道粘膜免疫应答和系统免疫应答。EHEC O157强毒株经胃肠道途径攻毒后,一次免疫组和两次免疫组小鼠存活率(67%和78%)均高于未免疫组(50%);免疫小鼠强毒菌排菌时间大大缩短,两次免疫组攻毒后第5 d检测不到强毒菌,未免疫组排菌达10 d以上;攻毒后免疫组小鼠体重较快恢复正常水平。

BglⅠ限制性核酸内切酶与环状pBR322-DNA专一性和非专一性相互作用的动力学及热力学

本文选择限制性核酸内切酶BglⅠ和pBR322-DNA为试验系统,用酶促反应的动力学和热力学方法来研究内切酶对环状DNA分子的专一性和非专一性结合及切割过程,求得了各限制位点的切割速度k及活化能E,各限制位点催化速度常数k_c,酶同限制位点专一性结合的平衡常数k_S非专一性结合的平衡常数k_N及其热力学参数△H,△S。研究表明:不论底物的构型如何(线状还是环状),内切酶都以相似的动力学和热力过程对其进行结合与切割。

pBR322-Red介导的E.coli染色体基因敲入、位点及表达研究

应用pBR322-Red介导的重组工程系统,kan/sacB选择反选择系统,双链线性DNA重组技术和重叠引物介导的DNA重组技术,将长度为1 653 bp的luc报告基因分别敲入到E.coliW 3110染色体lacZ,lacY和lacA基因的位置,建立了一系列具有新遗传表型的菌株:CWL2、CWL4和CWL6。荧光素酶分析表明,外源报告基因luc能在这3个结构基因处有效的组成型表达。为了进一步确定外源基因的表达情况,用霍乱毒素B亚单位基因ctxb替换了lacZ基因,构建了新菌株CWD1。证明了以单拷贝形式存在在大肠杆菌染色体CWD1上的ctxb基因能有效的表达CTB蛋白并能将其分泌至细胞外培养液中。结果初步确定了大肠杆菌染色体上的lac操纵子结构基因位点适合外源基因的敲入和表达。

利用PBR322质粒监控MSAP甲基化检测过程

[目的]监控MSAP甲基化检测过程,以控制MSAP每一反应步骤。[方法]利用PBR322质粒作为阳性对照,全程监控MSAP分析中酶切、连接、预扩与选扩体系。[结果]PBR322质粒作为阳性对照电泳时条带有限,可以根据条带有无和位置对MSAP甲基化检测过程进行全程监控,有助于发现问题的具有所在。[结论]该研究可以为MSAP技术提供可靠保障。

基于原子力显微镜研究p53蛋白与PBR322 DNA的相互作用

肿瘤(癌症)是由于细胞在复制过程中,DNA损伤不能修复导致细胞凋亡或者细胞无限增殖而形成的。DNA在细胞中转录和翻译都会涉及蛋白与DNA的结合,肿瘤抑制蛋白也是参与这一过程的关键蛋白之一。然而,众多研究发现,肿瘤抑制蛋白p53具有识别和修复损伤DNA的效果,对于细胞的凋亡、基因的保护和避免癌症发生有着重要的意义。有研究表明,金属镁离子和锌离子可以增强p53蛋白的结构稳定性和p53-DNA的亲和力。因此,我们基于原子力显微镜(AFM),直观地呈现出p53蛋白与PBR322环状DNA相互作用的图像,同时发现p53蛋白可以使环状DNA自身形成聚集或者相交。但是,对于长度相当的5 000bp的线状DNA几乎没有这样的效果,而对于20 000bp DNA不会出现这样的现象。然而,在高浓度镁离子环境下,环状DNA会扭转成为麻花状,即形成超螺旋结构。这一现象,可为p53蛋白功能和作用机理研究提供指导,也为癌症治疗、癌症药物开发以及癌症检测方法提供启发。

稳态和时间分辨荧光光谱法检测pBR322质粒中十字形结构

在目的DNA不被酶切成不同片段的情况下,应用光谱方法探测pBR322质粒中十字形结构DNA的形成。吡咯脱氧胞苷(Pyrrolo deoxycytidine,PdC)取代dC掺入到pBR322质粒的特定位点(3195,3222或3281位点)。应用稳态和时间分辨荧光法研究十字形结构DNA的形成。结果显示:(1)稳态荧光特性表明,当PdC掺入到pBR322质粒的3222位点,PdC-pBR322超螺旋荧光强度大约是松弛型PdC-pBR322的4倍;与此同时,其时间分辨荧光寿命大约比松弛型PdC-pBR322长约0.3ns。当PdC掺入到3195或3281位点时,稳态荧光光谱和荧光寿命(两位点处约1.42ns)并没有显著变化。(2)随着盐浓度的增大,荧光寿命略微有变化,但不是很明显。通过检测和分析pBR322质粒的荧光光谱和荧光寿命,表明能够形成在非配对环状部分3222位点含有dC的十字形结构。在一定的盐浓度(0-100mmol/L)条件下,十字形结构能够保持其稳定性。

氯化钇对质粒pBR322转化的影响

用含 50 μmol/ L钇 ( )的氯化钙诱导大肠杆菌进入感受态 ,质粒 p BR32 2的转化率提高2倍 ;若在热休克后使感受态细胞在含 50 μmol/ L氯化钇的营养培养基 (SOC)中复壮 ,则转化率提高 5倍 .实验结果表明 :微量氯化钇存在的条件下 ,钇 ( )可能比钙 ( )更易形成抗 DNase的羟基 -钇 ( ) -磷酸复合物 ,更易于被细胞吸收而提高了质粒的转化率 .

华蟾素注射液对人肝癌HepG-2细胞DNA拓扑异构酶Ⅰ的影响

背景与目的:华蟾素注射液是传统抗肿瘤中药制剂,目前药效机制尚不明确。本研究旨在探讨华蟾素注射液对DNA拓扑异构酶Ⅰ(topoisomerase Ⅰ,TOPOⅠ)的影响。方法:采用噻唑蓝还原法(MTT)观察华蟾素注射液对人肝癌HepG-2细胞增殖的影响;采用流式细胞术(FCM)检测对HepG-2细胞周期的影响;采用RT-PCR法检测对HepG-2细胞TOPOⅠmRNA表达的影响;采用TOPOⅠ介导的负超螺旋PBR322 DNA解旋反应检测华蟾素对TOPOⅠ酶活性的影响;采用负超螺旋PBR322 DNA检测华蟾素对DNA的直接抑制作用。结果:华蟾素注射液对HepG-2细胞增殖具有抑制作用,其抑制效应具有时间和剂量依赖性;并将HepG-2细胞阻滞于S期;RT-PCR检测表明,华蟾素注射液可下调TOPOⅠmRNA表达,表现浓度依赖效应;对TOPOⅠ介导的负超螺旋PBR322 DNA解旋反应有抑制作用;对负超螺旋PBR322 DNA没有直接抑制作用。结论:华蟾素注射液能够抑制HepG-2细胞增殖,影响DNA拓扑异构酶Ⅰ酶的mRNA表达及活性可能为机制之一。

DNA双链断裂的组成与自由基清除效能的关系

Measured by gel electrophoresis scanning,it was shown that the double strand breaks (DSBs) of pBR322 irradiated by γ rays were constituted by two parts,αDSB and βDSB,and the relationship between α,β and scavenging capacity σwas obtained.Results showed that β/α non linearly decreased with increasing σ.Moreover,the yield of the OH free radicals reacting with DNA was analyzed.

原子力显微镜研究不同温度下质粒DNA结构变化

采用原子力显微镜（ＡＦＭ）在无水乙醇中成象了ｐＢＲ３２２质粒ＤＮＡ。在不同温度范围加热云母表面的ＤＮＡ溶液，并在相应温度下干燥使ＤＮＡ充分展开地固定在云母基底上。ＡＦＭ观察结果表明：在３０～４０℃，质粒ＤＮＡ主要是超螺旋和环状分子；在４０～５０℃，环状分子开环形成线形分子； 在７０～８０℃，这些线形分子全部变性，解链形成无规线团。我们通过测定ｐＢＲ３２２质粒ＤＮＡ的熔融曲线，发现了两个突变点，对应于ＡＦＭ所观察到的质粒ＤＮＡ在加热过程中由环状变成线形、双螺旋解开成单链的两个结构变化过程。这是首次通过ＡＦＭ直接观察到质粒ＤＮＡ在不同温度下的结构变化。

全反式维甲酸合钇(Ⅲ)配合物对DNA的切割和键合作用(英文)

以紫外光谱、荧光光谱、粘度法和凝胶电泳方法研究了全反式维甲酸合钇!配合物与DNA的作用。结果表明,该配合物能在生理条件下比配体和金属离子更有效地切割质粒DNA,体系离子强度和pH值的变化对配合物的切割活性有较大影响,自由基捕捉剂的加入不影响配合物的切割活性。该配合物对DNA的切割可能通过水解机理进行。该配合物可使DNA的粘度增加,使EB-DNA体系的荧光强度和DNA溶液的紫外吸收强度降低。据此推断,该配合物主要以嵌入方式与DNA作用。

新型β,β-桥连双卟啉的合成及其光敏活性研究

以1,6-二溴己烷为桥连试剂,2-(1-羟基萘基)-5,10,15,20-四苯基卟啉及其Cu(Ⅱ),Ni(Ⅱ),Zn(Ⅱ)配合物为原料,合成了4个新型β,β-桥连双卟啉.以1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)为猝灭剂,测试了双卟啉及其Ni(Ⅱ),Zn(Ⅱ)配合物在光照条件下产生单线态氧的能力,并研究了4个双卟啉化合物在光照和无光照条件下对pBR322质粒DNA的切割能力(用凝胶电泳)和对金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)的光敏抑菌活性.结果表明,新型双卟啉光敏剂具有较好光敏活性,产生的活性氧能有效杀灭金黄色葡萄球菌.

Genefinder和EB在DNA电泳谱带定量分析中的比较

[目的]比较Genefinder和EB对DNA电泳谱带定量分析的影响。[方法]用加入Genefinder或EB的琼脂糖凝胶进行PBR322DNA电泳,并用凝胶成像分析系统进行标准曲线相关性等分析。[结果]用Genefinder作染料,标准曲线相关性、样品含量百分误差、灵敏度等都比EB好。[结论]用Genefinder作染料不仅提高了定量分析的质量,而且安全、无污染,有利于保护环境。

质粒DNA提取的简便方法

以质粒pBR322为对象,在经典的质粒提取方法的基础上进行了一些改进,将酚氯仿异戊醇抽提和氯仿异戊醇抽提省去。比较了简便方法和经典方法提取质粒的效果,结果显示:两种方法均能够提取出质粒DNA,RNA的量并没有比经典方法提出来的多;简便方法抽取的质粒,蛋白含量稍稍多于后者;简便方法节省了大约一半的提取时间及大量的药品,并且减少了有害的化学物质对人体的危害,是一种经济实用的方法,完全可以满足一般实验需要。

维康醇对DNA拓扑异构酶活性的影响

目的探讨维康醇对DNA拓扑异构酶活性的影响。方法以质粒pBR322超螺旋DNA为底物,采用凝胶电泳分别检测维康醇对拓扑异构醇Ⅰ(TopoⅠ)和拓扑异构醇Ⅱ(TopoⅡ)介导的pBR322 DNA解旋反应的影响。结果维康醇对TopoⅠ介导的pBR322解旋反应无明显的抑制作用,而对TopoⅡ的活性有明显的抑制作用。结论维康醇的直接作用靶点可能是DNATopoⅡ,该药可能成为新的TopoⅡ抑制剂。

钌(Ⅱ)配合物光谱性质及对DNA光切割作用

用紫外吸收光谱、荧光光谱和荧光淬灭技术,研究钌(Ⅱ)多吡啶配合物[Ru(bpy)2(MDBIP)]2+(bpy为2,2′-联吡啶;MDBIP为3,5-二溴基-咪唑并[4,5-f][1,10]邻菲咯啉)与小牛胸腺DNA的作用.用琼脂糖凝胶电泳法研究配合物对pBR322质粒DNA的光切割作用.结果表明,[Ru(bpy)2(MDBIP)]2+与小牛胸腺DNA可能是以一种弱的部分插入的方式相结合,对pBR322质粒DNA有较好的光切割作用.