瑶药小钻的特征图谱及其安五脂素含量和抗炎活性研究

目的 建立瑶药小钻特征图谱及其主要成分安五脂素含量测定方法,并评价安五脂素抗炎活性。方法 采用高效液相色谱法,以乙腈-0.5%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱,采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》建立小钻药材的特征图谱和进行相似度评价,并测定小钻中安五脂素含量。以脂多糖诱导的RAW264.7巨噬细胞为炎症细胞模型,考察安五脂素对细胞上清液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6水平的影响。结果 10批小钻样品的特征图谱相似度为0.901~0.994;标定了9个共有峰,指认了3个成分,分别为长南五味子素E、南五味子内酯A、安五脂素;安五脂素的含量为(0.72±0.05)~(1.21±0.03)mg/g(n=3)。0.125~0.5μg/mL的安五脂素可显著降低炎症模型细胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平(P<0.05或P<0.01)。结论 建立了小钻药材HPLC特征图谱及其安五脂素含量测定方法;安五脂素可能是小钻药材发挥抗炎作用的有效成分。

安五脂素改善小鼠学习记忆障碍与抑制凋亡的作用

目的:观察安五脂素对D-半乳糖诱导的小鼠学习记忆障碍的改善作用并探讨其与凋亡相关机制。方法:选取雄性ICR小鼠,随机分为5组,即空白组(灌服羧甲基纤维素钠溶液,皮下注射生理盐水),模型组(灌服羧甲基纤维素钠溶液,皮下注射220 mg/kg D-半乳糖),安五脂素低、中、高剂量组(分别灌服1、2、4 mg/kg安五脂素,皮下注射220 mg/kg D-半乳糖)。连续给药42 d,1次/d。通过跳台实验观察分析小鼠学习记忆能力。行为学实验结束后,应用Western印迹法检测小鼠脑海马组织凋亡相关基因P53、Bcl2、Bax及Caspase3的表达情况。结果:与空白组比较,模型组小鼠跳台潜伏期显著缩短,错误次数显著增多(P<0.01),脑海马组织P53及Caspase3表达水平显著升高(P<0.05或P<0.01),Bcl2/Bax比值显著降低(P<0.05或P<0.01);而与模型组比较,安五脂素给药组小鼠跳台潜伏期显著延长,错误次数显著减少(P<0.01),脑海马组织P53及Caspase3表达水平显著降低(P<0.05或P<0.01),Bcl2/Bax比值显著升高(P<0.05或P<0.01)。结论:安五脂素能够改善D-半乳糖诱导的小鼠学习记忆障碍,该作用可能与其抑制小鼠脑海马组织细胞凋亡有关。

基于HPLC-DAD法对护肝片中五味子掺伪情况研究

目的建立安五脂素的高效液相色谱-二极管阵列(HPLC-DAD)含量测定方法,以对护肝片中南五味子掺伪五味子的情况进行研究。方法采用Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相为甲醇-水(70∶30),柱温30℃,流速1.0 mL/min,检测波长为280 nm,参比波长为360 nm,进样量为10μL。结果安五脂素在浓度在12.064~120.640μg/mL范围内线性关系良好,平均加样回收率为98.80%,RSD为1.07%。结论建立的安五脂素含量测定方法灵敏度高、专属性强、重现性好,可用于护肝片中南五味子掺伪五味子的快速鉴别。

安五脂素改善大鼠肝纤维化的效果及机制

目的探讨安五脂素改善大鼠肝纤维化的效果及作用机制。方法将50只SD大鼠随机分为正常组,模型组,秋水仙碱片组(0.1 mg/kg),安五脂素高、低剂量组(2.8、0.7 mg/kg),每组10只。除正常组外,其余各组大鼠均腹腔注射50%CCl_(4)橄榄油混合溶液复制肝纤维化大鼠模型。造模结束后,各组大鼠从第9周开始灌胃相应药物或蒸馏水,每日1次,连续给药4周。实验期间观察大鼠一般情况;计算大鼠肝指数;采用比色法检测大鼠血清中丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)的含量;采用HE染色和Masson染色观察大鼠肝组织病理形态学和肝纤维化情况;采用Western blot法检测肝组织中磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路及凋亡相关蛋白表达水平。结果与正常组比较,模型组大鼠饮食量下降,被毛稀疏、蓬乱,反应迟钝,体重增长速率减慢或体重降低;肝指数显著上升(P<0.01);大鼠血清中ALT、AST、MDA含量均显著升高,SOD含量显著降低(P<0.01);HE染色及Masson染色均观察到大鼠肝组织中有大量纤维增生,胶原容积分数显著升高(P<0.01);大鼠肝组织中PI3K、Akt、磷酸化Akt、B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)蛋白表达水平均显著下降,Bcl-2相关X蛋白表达水平显著升高(P<0.01)。与模型组比较,安五脂素高、低剂量组及秋水仙碱片组上述指标均显著逆转(P<0.01或P<0.05)。结论安五脂素可能是通过激活PI3K/Akt信号通路降低肝纤维化氧化应激反应、抑制肝细胞凋亡,发挥抗肝纤维化的作用。

异型南五味子丁素、五味子酚和(+)-安五脂素对血小板聚集的影响

目的观察3木脂素类成分:异型南五味子丁素(heteroclitin D,HD)、五味子酚(schisanhenol,SAL)和(+)-安五脂素[(+)-anwulignan,AN]对血小板聚集的影响.方法采用Born比浊法,观察此3种木脂素在0.05～25 mg/L时对腺苷二磷酸(adenosine diphosphate,ADP)和血小板活化因子(platelet activating factor,PAF)诱导的兔血小板1、3、5 min聚集率和最大聚集率以及最大聚集时间的影响.结果①HD和SAL可呈剂量依赖性抑制ADP和PAF诱导的血小板最大聚集率,AN的抑制作用较弱.②对ADP诱导的血小板1、3、5 min聚集率,HD和SAL均可全程稳定抑制,AN 5mg/L在3、5min时有较明显的抑制作用;对PAF诱导的血小板1、3、5 min聚集率,HD在1、3 min时抑制作用较强,SAL在3、5 min时抑制作用较强.③HD、SAL和AN对ADP和PAF诱导的血小板最大聚集时间无明显影响.结论HD、SAL和AN在离体水平可不同程度抑制ADP和PAF诱导的兔血小板聚集.HD的抑制作用最强,可视为南五味子属药用植物的重要活性成分之一.

高效液相色谱法测定五味子和含五味子的制剂中五味子乙素及多种活性成分时流动相体系的选择

建立了用高效液相色谱法测定五味子和含五味子的制剂中五味子乙素的流动相体系。用Shim-pack VP-ODS(250mm×4.6mm,5μm)色谱柱,在柱温30℃、检测波长285nm、流速1.0mL/min的条件下,用不同的流动相组成及其不同比例研究了五味子提取液中3种木脂素(五味子乙素、安五脂素和五味子甲素)的保留时间及其分离情况,从中选择测定五味子乙素的最佳流动相体系。结果表明,在甲醇-水、甲醇-冰醋酸-水的流动相体系中,安五脂素和五味子乙素很难完全分离;而在乙腈-甲醇-水和乙腈-冰醋酸-水流动相体系中,3种木脂素可很好地分离。以乙腈-甲醇-水(体积比为17:58:25)为流动相测定五味子和护肝片中3种木脂素的含量,相对标准偏差(n=4)为0.95%～5.8%,平均加标回收率为94.50%～105.6%。将该流动相体系用于供试品中3种木脂素含量的测定,分离效果好,结果令人满意。

南北五味子醇提液的荧光光谱鉴别

建立了用荧光光谱法快速鉴别五味子和部分含五味子制剂中五味子药材种属的方法。研究了五味子中的五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和安五脂素5种活性成分以及南北五味子和护肝片的乙醇提取液的荧光光谱,并用高效液相色谱测定了供试品中5种活性成分的含量。结果表明,安五脂素和五味子乙素具有强荧光性且峰形差异显著,五味子甲素和五味子醇甲的荧光性较弱,而五味子酯甲不具有荧光性;南北五味子的主要荧光物质分别为安五脂素和五味子乙素,据此可用乙醇提取液的荧光光谱快速鉴别南北五味子。

安五脂素对衰老小鼠抗疲劳作用研究

目的:观察五味子安五脂素(Anwulignan,AN)对D-半乳糖致衰老小鼠的抗疲劳作用。方法:将ICR雄性小鼠随机分为四组,即空白对照组(CON)、模型组(MOD)、低剂量AN组(AN 1 mg/kg)、高剂量AN组(AN 4 mg/kg)、灌胃给予安五脂素或溶媒30 min后,除CON组皮下注射生理盐水外,其余各组皮下注射D-半乳糖(220 mg/kg)。每日1次,持续6周。通过疲劳转棒实验,前肢握力实验观察AN对衰老小鼠运动耐力的影响;化学比色法检测小鼠血清中尿素氮、乳酸、乳酸脱氢酶、肌酸激酶及骨骼肌组织中超氧化物酶和丙二醛的水平。结果:与MOD组相比,低剂量AN组及高剂量AN组分别延长了小鼠37%和67%(P<0.05)的转棒时间,及55%(P<0.05)和89%(P<0.01)的小鼠前肢握力值,显示经不同剂量AN处理后小鼠的运动耐力均显著增加;同时,在氧化及疲劳生化指标中显示,高剂量AN组超氧化物酶含量增加了38%(P<0.01),丙二醛含量降低了14%(P<0.05);血清尿素氮和乳酸含量分别降低了15%(P<0.05)和21%(P<0.05),乳酸脱氢酶和肌酸激酶活性分别降低了22%(P<0.01)和12%(P<0.05)。结论:安五脂素对D-半乳糖所致衰老小鼠具有抗疲劳作用,本研究为抗衰老及抗疲劳药物及保健食品的开发提供理论依据。

安五脂素对小鼠肺纤维化的改善作用及其机制研究

目的探讨安五脂素对肺纤维化的干预作用及其机制。方法雄性ICR小鼠65只,随机分成对照组、BLM模型组、安五脂素低剂量组(1 mg/kg)、安五脂素高剂量组(4 mg/kg)与N-乙酰半胱氨酸组(150 mg/kg),每组13只。采用气管灌注5 mg/kg博来霉素(BLM)诱导小鼠肺纤维化模型。收集各组小鼠血清和肺组织,采用HE染色和Masson三色染色观察肺组织病理学变化并进行肺纤维化评分;采用试剂盒测定血清氧化应激指标及肺组织羟脯氨酸(HYP)含量;采用Western blotting及qRT-PCR检测铁死亡通路相关基因的表达水平。取对数生长期HFL-1细胞:(1)设置对照组与安五脂素给药组(0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80μmol/L),采用CCK-8法检测安五脂素对HFL-1细胞的毒性作用。(2)设置对照组、转化生长因子(TGF)-β_(1)模型组、安五脂素低剂量组(5μmol/L)与安五脂素高剂量组(10μmol/L),以TGF-β_(1)诱导肺纤维化细胞模型,采用试剂盒测定氧化应激指标及活性氧(ROS)水平,采用Western blotting及qRT-PCR检测铁死亡通路相关基因的表达水平。结果HE染色、Masson染色结果及肺组织HYP含量测定结果均提示BLM诱导的小鼠肺纤维化模型构建成功,给予安五脂素后肺纤维化表型明显改善。CCK-8检测结果显示,当安五脂素浓度<20μmol/L时对HFL-1细胞的增殖活性无明显影响(P>0.05)。与BLM或TGF-β_(1)模型组比较,给予安五脂素可明显提高小鼠血清及HFL-1细胞中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)活性及谷胱甘肽(GSH)水平,明显降低丙二醛(MDA)含量(P<0.01或P<0.001)。与TGF-β_(1)模型组比较,给予10μmol/L安五脂素可明显降低HFL-1细胞中ROS水平(P<0.01)。Westernblotting和qRT-PCR检测结果显示,给予安五脂素可明显上调小鼠肺组织及HFL-1细胞中铁死亡通路中谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)、转铁蛋白(TF)的表达水平,下调转铁蛋白受体1(TFR1)的表达水平(P<0.05、P<0.01或P<0.001)。结论安五脂素可通过抑制氧化应激和铁死亡而改善肺纤维化,为开发肺纤维化的治疗药物提供了一定的理论基础。

安五脂素对α-黑色素细胞刺激素诱导的小鼠黑色素瘤B16F10细胞中黑色素生成的影响及机制

目的研究安五脂素对小鼠黑色素瘤B16F10细胞黑色素生成的影响及机制。方法体外培养B16F10细胞,用MTT法检测B16F10细胞存活率。随后实验分为细胞对照组、α-黑色素细胞刺激素(α-MSH)诱导模型组和模型+安五脂素5,10和20μmol·L^(-1)组,培养48 h。NaOH裂解法和多巴氧化速率法检测细胞内黑色素含量和酪氨酸酶活性,WST-1法检测细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)水平,化学荧光法检测活性氧(ROS)水平,实时-定量PCR检测血红素加氧酶1(HO-1)mRNA表达水平,Western印迹法检测核因子E2相关因子2(Nrf-2)和HO-1蛋白表达水平。结果安五脂素5,10和20μmol·L^(-1)对B16F10细胞存活无影响。与细胞对照组相比,模型组黑色素含量和酪氨酸酶活性显著升高(P<0.01);SOD活性降低(P<0.01),MDA和ROS水平升高(P<0.01);Nrf-2蛋白及下游HO-1 mRNA和蛋白表达显著降低(P<0.01)。与模型组相比,模型+安五脂素10和20μmol·L^(-1)组B16F10细胞黑色素含量和酪氨酸酶活性降低(P<0.05,P<0.01);SOD活性升高(P<0.01),MDA和ROS含量明显降低(P<0.05,P<0.01);Nrf-2蛋白及下游HO-1 mRNA和蛋白表达水平升高(P<0.01)。结论安五脂素可能通过抑制B16F10细胞氧化应激反应而抑制其黑色素合成,且可能与抑制Nrf-2/HO-1信号通路有关。

安五脂素对D-gal致衰老小鼠胸腺的保护作用及其相关机制

目的:观察安五脂素对D-半乳糖(D-gal)致衰老小鼠胸腺的保护作用并探讨其相关机制。方法:将ICR小鼠随机分为5组,空白对照组(CON,灌胃羧甲基纤维素钠溶液,皮下注射生理盐水),D-gal模型组(MOD,灌胃羧甲基纤维素钠溶液,皮下注射220 mg/kg D-gal),安五脂素低、中、高剂量组(分别灌胃安五脂素1、2和4 mg/kg,皮下注射220 mg/kg D-gal),1次/d,10 ml/kg,连续造模及给药42 d。计算胸腺指数,观察胸腺组织病理变化,测定血清中IL-2和IFN-γ含量,胸腺组织中SOD活力和MDA含量,应用Western blot法检测胸腺组织中Keap1、Nrf2、HO-1、Caspaes3、Bcl2和Bax等蛋白的表达情况。结果:安五脂素能显著提高胸腺指数并改善受损胸腺结构,提高IL-2和IFN-γ含量,提高胸腺组织中SOD活力,降低MDA含量,上调胸腺组织中Nrf2,HO-1和Bcl2的表达,降低Keap1、Caspase3和Bax的表达水平。结论:安五脂素对D-gal所致的小鼠胸腺损伤具有保护作用,其机制可能与其抗氧化和抗凋亡作用有关。

安五脂素在小鼠体内的药代动力学研究

目的运用高效液相色谱法分析安五脂素在小鼠体内的药代动力学特征.方法给小鼠口服安五脂素(10 m g/kg)后,取不同时间点的血液和组织样本,通过高效液相色谱法测定安五脂素的含量,运用DAS软件计算药代动力学参数,分析安五脂素在体内的分布特征.结果给药后24 h仍能在小鼠体内血液中检测到安五脂素,并在各个组织器官内广泛分布.结论安五脂素在小鼠体内的停留时间较长,分布广泛,尤其在肝内大量富集,并在脑组织中含量较高,在体内的组织浓度高低分别为肝>心>脑>肾>肺>脾.

安五脂素对D-半乳糖致衰老小鼠心肌损伤的保护作用及机制研究

目的研究安五脂素对D-半乳糖致小鼠心肌损伤的保护作用。方法将雄性ICR小鼠随机分为5组,即空白对照组(CON),衰老模型组(D-gal)和低、中、高三个剂量的安五脂素给药组(AN-L、AN-M、AN-H),连续给药7周。造模成功后,使用试剂盒测定各组小鼠心肌组织中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平,通过免疫蛋白印迹法测定心肌组织Nrf2、血红素氧合酶1(HO-1)水平。结果与D-gal组相比,AN-M、AN-H显著升高小鼠心肌组织SOD活性(P<0.05或P<0.01),显著降低MDA含量(P<0.05或P<0.01)。与CON组相比,D-gal模型组Nrf2(P>0.05)、HO-1表达升高(P<0.05);与D-gal组相比,AN-H的Nrf2及HO-1表达显著升高(P<0.01,P<0.05)。结论安五脂素通过其抗氧化作用对D-半乳糖所致衰老小鼠心肌损伤具有显著的保护作用。

五味子中荧光物质的分离和应用

从广西五味子中分离荧光物质并建立用荧光法测定南五味子中安五脂素含量的方法。以乙醇提取,乙醚萃取并用硅胶柱色谱分离纯化,采用理化性质和波谱分析鉴定化合物的结构;研究它们的荧光性质,用荧光法和高效液相色谱法同时测定南北五味子中安五脂素的含量。从广西五味子分离纯化出4个化合物,分别为安五脂素、五味子甲素、五味子酯甲和原儿茶酸;安五脂素的荧光性最强,五味子酯甲没有荧光性;南五味子乙醇提取液的荧光光谱与安五脂素一致;南五味子中安五脂素用荧光法和高效液相色谱法分析结果无明显的差异,而北五味子荧光法测定结果偏高。荧光法具有灵敏度高、选择性好等特点,可直接用于南五味子中安五脂素的定量分析。

安五脂素通过激活NRF2发挥对力竭训练小鼠肝脏损伤的改善作用

剧烈或过度运动过程中机体耗氧量大量增加,会产生过量的自由基。其中,肝脏组织中的自由基水平会因力竭运动增加2~3倍甚至更多,从而导致肝脏组织发生氧化应激损伤,影响肝脏的正常功能。安五脂素是南五味子木脂素中具有代表性的单体成分之一,本研究前期工作已报道,安五脂素对力竭训练小鼠表现出显著的抗疲劳作用,且该作用可能与激活骨骼肌组织中NRF2[nuclear factor(erythroid-derived 2)-like 2]/ARE(antioxidant responsive element)通路抗氧化功能相关。本研究通过建立力竭训练小鼠模型,观察安五脂素对其肝脏组织损伤的保护作用,并应用NRF2抑制剂ML385,通过H2O2所致HepG2细胞损伤模型实验明确安五脂素与NRF2的相关作用机制,动物福利和实验过程均遵循北华大学动物伦理委员会的规定。结果显示,安五脂素能够明显降低力竭训练小鼠血清中ALT(alanine aminotransferase)、AST(aspartate aminotransferase)水平,改善肝脏组织病理损伤,显著提高SOD(superoxide dismutase)、GSH-Px(glutathione peroxidase)、CAT(catalase)水平,降低MDA(malondialdehyde)、8-OHdG(8-hydroxy-2 deoxyguanosine)含量,显示出较强的抗氧化作用。安五脂素能够上调肝组织中NRF2/ARE抗氧化调节通路,增加Bcl-2(B-cell lymphoma 2)表达并降低Bax(Bcl-2-like protein 4)、caspase3的表达,且体外实验结果中安五脂素对抗氧化及凋亡相关蛋白的影响与动物实验中完全一致。给予ML385干预后,安五脂素对上述所有指标的影响均被抑制。安五脂素通过抗氧化作用发挥对力竭训练小鼠肝损伤的保护作用,该作用与其激活NRF2作用相关。

正交试验法优选肉豆蔻中安五脂素的提取工艺

【目的】正交实验法优选肉豆蔻中安五脂素的提取工艺。【方法】建立肉豆蔻中安五脂素的HPLC含量测定方法,监测提取工艺中安五脂素的含量,采用L9(34)正交试验设计法,考察乙醇浓度、固液比、提取时间、提取次数对肉豆蔻中安五脂素提取的影响。【结果】安五脂素含量测定方法为标准曲线回归方程:Y=2×107X-57655(R2=0.9996),安五脂素在0.791～3.164μg范围内线性关系良好,安五脂素的平均回收率为100.9%。通过正交实验法确定肉豆蔻中安五脂素的最佳提取工艺为12倍量的95%的乙醇回流提取60 min,提取次数为2次。【结论】该提取工艺简便易行,为肉豆蔻药材的综合利用提供了依据。