Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡实验

课程组面向本科生开设了利用Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡的实验项目。该实验加入化疗药物依托泊苷(简称VP-16)诱导Jurkat细胞发生凋亡,使用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡情况,在荧光显微镜下拍照计数。实验结果表明:紫外光激发下,早期凋亡细胞呈现绿色荧光,而晚期凋亡细胞和坏死细胞呈现红色荧光;对细胞计数可知,对照组各时期细胞数符合正常范围,经药物处理后,各时期细胞凋亡率随药物浓度升高而升高,其中早期和晚期凋亡细胞占比最高;在高浓度药物处理后,细胞被大幅度杀伤,仅剩余几个早期凋亡细胞。实验将Annexin V-FITC/PI试剂盒与荧光显微镜结合使用,突破了教学经费、规模和仪器等条件局限,实验成本相对较低,适于大班教学,实验结果直观便捷,能够让学生深入、系统地掌握细胞凋亡的实验原理和检测方法,符合本科生实验项目的综合性高、设计性强和研究性佳的特点,切实提升细胞生物学实验课程的质量和水平。

FITC标记重组灵芝免疫调节蛋白(rLz-8)在NB4细胞中的动态定位

实验发现,重组灵芝免疫调节蛋白(rLz-8)可直接杀伤人急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4.利用异硫氰酸荧光素(FITC)标记rLz-8,其相关的活性实验结果和晶体结构分析都表明,FITC没有影响rLz-8已知生物学功能.通过激光共聚焦显微镜观察FITC-rLz-8在NB4细胞内的动态过程发现,FITC-rLz-8可识别细胞膜上的受体,并可进入细胞质,并最终富集在细胞核区域内.Annexin V-FITC双染检测结果显示,rLz-8对NB4细胞杀伤作用的可能机制是对NB4细胞凋亡的诱导作用,在一定浓度范围内,剂量与凋亡诱导率成正相关.因此rLz-8能够诱导肿瘤细胞NB4发生凋亡的亚细胞学机制可定位在细胞核上.

FITC标记脂肪酶的稳定性和荧光光谱

以FITC(异硫氰基荧光素)为荧光探针,研究了标记后的脂肪酶的活性、构象、荧光光谱的变化及三者之间的联系。在不同变性条件下,比较了标记与未标记的脂肪酶活性变化及相对应的荧光光谱。结果表明,荧光标记的脂肪酶耐热性能比未标记的酶有所提高,70℃时完全失活。荧光标记的脂肪酶耐酸碱性能增强。在盐酸胍变性剂的条件下,荧光标记的脂肪酶活性下降趋势渐缓,荧光光谱能较好的反映脂肪酶的活性变化。

直标鼠抗人CD14单克隆抗体2F9-FITC的研制及鉴定

目的研制异硫氰酸荧光素(Fluoresceinisothiocyanate,FITC)标记的直标单克隆抗体2F9-FITC,用于白血病的免疫分型诊断。方法2F9杂交瘤细胞的亚克隆,2F9腹水的制备、纯化、纯度鉴定按照常规方法进行;参考改良Marsshall氏法,制备FITC标记的2F9-FITC单抗;通过流式细胞术鉴定单抗亚型,比较2F9-FITC和标准CD14-FITC在不同类型白血病细胞上的表达情况。结果制备了大量高纯度的IgG1κ亚型2F9单抗,成功研制了直标单抗2F9-FITC,A495/A280比值为0.44;2F9-FITC与CD14-FITC在单核细胞上反应的阳性细胞百分数分别为84.50%及90.08%,而在淋巴细胞仅为0.52%和1.01%;2F9-FITC与标准CD14-FITC在各类白血病细胞上的阳性细胞百分数的差异不显著(n=23,t=0.922,P=0.367)。结论研制的2F9-FITC能够替代进口的同类高质量单抗试剂,用于单核细胞相关性白血病的免疫诊断。

Annexin V-FITC/PI双标记与Hoechst33342/PI双标记流式细胞术检测细胞凋亡的比较

目的比较annexin V-FITC/PI双标记与Hoechst33342/PI双标记流式细胞术检测细胞凋亡的优缺点。方法用DEX诱导胸腺细胞凋亡和H2O2诱导K562细胞系细胞凋亡,应用Hoechst33342/PI和annexin V-FITC/PI双色标记流式细胞术检测体系检测细胞凋亡情况。结果 Annexin V-FITC/PI双标记法能准确地反映2种模型中的细胞凋亡情况,与其检测原理一致;而Hoechst33342/PI双标记法虽能准确反映DEX诱导胸腺细胞的凋亡情况,但在检测H2O2诱导的K562细胞凋亡时,其早期凋亡细胞的分布与其检测原理明显不符。结论与annexin-V-FITC/PI双标记法相比,Hoechst33342/PI双标记法有一定的局限性。

FITC-BSA与FI在葡萄膜巩膜模型中分布的对比研究

目的:从形态学方面观察比较FITC-BSA(异硫氰酸荧光素牛血清白蛋白)与FI(荧光素钠)在葡萄膜巩膜途径中的分布状况,探求FITC-BSA作为示踪剂的优点与可行性。方法:10只家兔,右眼前房内注入FITC-BSA为A组(n =10),左眼注入等量的FI为B组(n =10)。分别于术后2,4,6,8,10h,各处死家兔2只,摘除双侧眼球作冰冻切片,荧光显微镜下观察睫状体、脉络膜上腔、前、后巩膜和脉络膜部位的荧光强度并确定其等级。结果:A组葡萄膜巩膜途径各部位的荧光强度均比B组增强。结论:FITC-BSA示踪法是一种较为理想的研究葡萄膜巩膜途径的方法。

FITC标记的GSTP1蛋白在鼠巨噬细胞中的定位

GSTP1(GSTπ)是人体内谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的一种重要的活性亚型,属于机体内源性蛋白,不会引起免疫原反应,在维持细胞的正常机能中发挥着重要作用,也是一种具有临床应用价值的抗氧化剂.本实验室在研究中首先发现GSTP1具有明显的抗炎作用,由此我们设想可以通过增加外源性的GSTP1蛋白来提高其在机体内的水平,以此增强机体的抗炎能力.本实验将薄层色谱扫描和SDS-PAGE相结合用于FITC标记蛋白质的检测,使用激光共聚焦显微镜和流式分析相结合的方法研究了外源GSTP1蛋白在RAW264.7巨噬样细胞和鼠腹腔巨噬细胞中的跨膜转位,结果显示外源GSTP1蛋白能够进入上述细胞.该研究为GSTP1蛋白作为直接使用的药物在抗肿瘤、抗炎、抗氧化等领域的应用提供了实验基础.

拟南芥Ran2小GTP结合蛋白抗血清的制备及其FITC荧光标记

将原核表达、纯化的Ran2蛋白对新西兰兔进行免疫制备抗血清,ELISA测定其效价为1∶51 200。免疫印迹分析表明,原核表达、纯化的Ran2和拟南芥可溶性蛋白杂交带均在26 ku处。FITC荧光标记抗体检测Ran2绿色杂交带主要出现在细胞分裂间期的核膜上。

FITC-NYZL1分子探针标记膀胱癌患者尿脱落细胞特异性的研究

目的研究FITC-NYZL1分子探针标记尿脱落细胞的特异性,探索其在诊断和监测膀胱癌的临床应用价值。方法收集2014年8月至2015年1月山西医科大学第一医院66例膀胱癌患者尿液,选取12例膀胱炎患者和24名健康人作为对照。固相合成法制备探针FITC-NYZL1,将2h内的新鲜尿液离心、滴片,加入探针孵育,扫描激光共聚焦显微镜(LSCM)观察探针与细胞的结合率,同时取新鲜尿液进行瑞-吉染色。结果 FITC-NYZL1标记膀胱癌患者尿脱落细胞的阳性率为100%(66/66);不同临床分期患者尿脱落细胞的结合率有差异。对照组结合率很低,实验组与对照组间差异有统计学意义(P<0.001)。结论 FITCNYZL1分子探针标记结合膀胱癌细胞,特异性高,可提高膀胱癌患者尿脱落细胞的阳性率;FITC-NYZL1在分期不同的癌细胞中结合率不同,分期越高,荧光探针特异性结合率越高。FITC-NYZL1标记有望成为膀胱癌无创诊断和临床监测的新技术。

911-FITC荧光探针与免疫细胞的结合实验

应用911-FITC荧光探针对胸腺、脾脏淋巴细胞、巨噬细胞和内皮细胞进行了荧光染色,采用流式细胞仪及荧光显微镜对细胞的染色情况进行了评价。结果表明,911-FITC荧光探针能与淋巴细胞、巨噬细胞和内皮细胞发生特异性结合。证明911可通过与免疫细胞直接结合而起到免疫调节作用。

Annexin V-FITC/PI法检测脂多糖诱导滋养细胞的凋亡

目的:通过流式细胞术测定法检测脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对滋养细胞凋亡的影响,明确LPS与滋养细胞凋亡的关系,为预防和治疗由滋养细胞凋亡导致的病理妊娠提供新的思路。方法:利用流式细胞仪Annexin V-FITC/PI法检测不同浓度的LPS处理培养的JEG-3细胞系滋养细胞的凋亡率分析。结果:流式细胞检测结果显示LPS组凋亡指数分别为(2.05±0.33)%、(7.43±0.68)%、(13.43±0.90)%显著高于对照组(0.80±0.15)%,且P均<0.01。结论:Annexin V-FITC/PI法能特异地、准确地检出早期凋亡的细胞、继发性坏死的细胞;LPS能够诱导滋养细胞过度凋亡,且凋亡率随着LPS浓度的增加而增加。

以FITC-LPS为示踪物对小鼠肠道内毒素移位的观察

以Ｐｂ－Ａｃｅｔ和５－ＨＴ静注同时ＬＰＳ灌胃方法形成肠源性内毒素血症动物模型。利用荧光素异硫氰酸盐—内毒素（ＦＩＴＣ－ＬＰＳ）的荧光特性，将其按１／１０的比例混入于口灌的ＬＰＳ中。结果证实，造模３小时后，肝、肺、肾、脑均有较强的荧光发射，说明已有肠道ＦＩＴＣ－ＬＰＳ移位现象发生。本方法具有简单性、可行性、先进性等特点，不失为一种较佳的定性观察ＬＰＳ移位的实验方法。

环孢素A体外抗FITC-ConA标记的曼氏血吸虫童虫的作用

目的探讨环孢素A体外抗FITC ConA标记的曼氏血吸虫童虫的作用以及虫体表膜通透性。方法人工制备曼氏血吸虫童虫,使用FITC ConA进行标记,环孢素A体外作用,荧光显微镜下观察并摄照。结果童虫损伤或死亡,虫体逐渐从淡蓝色变成亮蓝色,虫体可见多个亮蓝色小点,虫体表面损伤。结论环孢素A能增加童虫表膜流动性。

CE法测定CD45-FITC荧光抗体溶液中的游离FITC

建立了测定CD45-FITC荧光抗体样品溶液中游离FITC浓度的毛细管电泳(CE)方法。熔融石英毛细管45 cm(有效长度30 cm)×75μm i.d.;0.05 mol·L-1磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(含5g·L-1PEG4000,p H=7.14);分离电压+12 k V;进样压力0.5 psi(3.45 k Pa),进样时间3.0 s;分离温度25℃;UV-Vis检测器检测波长200 nm。该方法能有效测定CD45-FITC荧光抗体样品溶液中游离的FITC含量,线性回归方程相关系数r=0.9900,检测限LOQ=0.20μg·m L-1。样品加标回收率为105.49%,相对标准偏差小于5.36%。该方法快速、灵敏、重现性好,能用于CD45-FITC荧光抗体样品溶液中游离FITC的快速测定。

表面等离子共振测定CD45-FITC抗体与蛋白A特异性结合常数

运用表面等离子共振(SPR)平台建立测定CD45-FITC抗体与蛋白A特异性结合常数的方法。当偶联蛋白A的传感芯片上流过CD45-FITC抗体溶液时,双通道SPR仪实时监测CD45-FITC抗体与蛋白A特异性结合过程,获得了该反应不同温度下的结合速率常数k_a、解离速率常数k_d和结合平衡常数K_a,以及该反应的活化能E_a和焓变△H。结果表明该特异性结合比较适宜的条件是:中性或微碱性、较高的离子强度和较高的温度。该方法操作步骤简单、快速、灵敏度高、消耗样品少,是研究分析免疫球蛋白IgG抗体和蛋白A等生物分子相互作用比较理想的方法之一。

FITC标记无唾液酸胎球蛋白对人精子去唾液酸糖蛋白受体的定位

背景与目的:采用FITC标记的无唾液酸胎球蛋白(FITC-ASF)对人精子去唾液酸糖蛋白受体(ASGP-R)进行定位和监测。材料与方法:采用FITC标记ASGP-R天然配体无唾液酸胎球蛋白得到FITC-ASF,进一步使用FITC-ASF对人精子表面ASGP-R标记,通过免疫荧光和流式细胞术检测其应用于外源ASF蛋白与该受体结合情况。结果:FITC-ASF能够较好的标记人精子表面ASGP-R,并成功应用于外源蛋白与该受体的结合。结论:本研究为获得一种适合临床广泛应用的新的简便易行的ASGP-R监测方法提供了实验基础。

兔眼葡萄膜巩膜引流术后FITC-Dextran在眼组织中的分布

目的观察兔眼葡萄膜巩膜引流术后房水流出道的形态学改变。方法 20只中国白兔随机分为2组,一组行葡萄膜巩膜引流术,另一组行小梁切除术,均行右眼手术。术后2周术眼前房内灌注异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖(FITC-Dextran),处死后取完整眼球做冰冻切片,在激光共聚焦显微镜下观察荧光素的分布。与手术部位处在眼环同一子午线上的同眼的对称部位未手术眼组织作为对照。结果在葡萄膜巩膜引流术组,荧光素的分布在前、中部巩膜最强,前葡萄膜次之;而在小梁切除术组,荧光素的分布在前葡萄膜最强,前、中部巩膜次之,两组的后葡萄膜和后巩膜均有部分中等亮度的显影,对照组的后葡萄膜和后巩膜则几乎无显影,且两组的前、中部巩膜荧光素强度均明显高于对照组。结论葡萄膜巩膜引流术和小梁切除术术后房水引流均是多途径的,既有外滤过,还增强了葡萄膜巩膜引流。与小梁切除术相比,葡萄膜巩膜引流术还明显增加了跨巩膜引流。

FITC示踪在优化小麦花粉管通道转化方法中的应用

利用FITC(fluorescein is othiocyanate,异硫氰酸荧光素)标记的外源DNA对小麦进行了花粉管通道法转化,在荧光显微镜下观察了外源DNA进入小麦胚囊的情况,并初步研究了转化时间及转化溶液组成对DNA进入胚囊效率的影响。结果表明,外源DNA沿着花粉管生长过程中形成的花粉管通道进入胚囊;授粉45 min和60min进行转化外源DNA进入胚囊的几率较大,因此在此段时间开始转化较为合适;相对于TE缓冲液,将0.05%Silwet L-77和5%蔗糖作为转化溶液可以缩短DNA进入胚囊的时间,但不能提高外源DNA进入胚囊的几率。研究表明,使用FITC标记观察外源DNA进入胚囊效率的方法,可简便有效地应用于花粉管通道法转化条件的初步优化。

FITC标记的叶酸类衍生物的合成及显像研究

以对氨基苯乙酸为起始原料,合成了N-(2-氨基乙基)-2-(4-氨基苯基)乙酰胺.以4-二甲基吡啶(DMAP)和1-乙基-[3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)作缩合剂,将N-(2-氨基乙基)-2-(4-氨基苯基)乙酰胺偶联到叶酸的α位和γ位羧基上,得到叶酸衍生物FA-EA,用异硫氰酸荧光素(FITC)标记FA-EA得到FA-EA-(FITC)2.反应中间体及最终产物采用HPLC,1H NMR和MS表征.通过尾静脉注射FA-EA-(FITC)2,观察其在荷瘤裸鼠主要脏器和肿瘤中的分布及对荷瘤裸鼠进行活体荧光显像.实验结果表明,FA-EA-(FITC)2在肿瘤部位有明显的聚集,在其它主要脏器中几乎看不到分布,说明FA-EA-(FITC)2具有较好的肿瘤靶向性.本研究为进一步研制可用于肿瘤显像的叶酸类显像药物提供了依据.