基于PCR技术的松材线虫分子检测技术研究进展

松材线虫是世界性检疫对象,并对我国林业造成了严重的危害。由于线虫个体较小且鉴定特征单一,利用传统的形态学鉴定较为困难,因此客观的分子生物学鉴定方法显得尤为重要。本研究总结了近些年主要的松材线虫PCR检测技术及其与拟松材线虫的区别,阐述了常规PCR技术、PCR-PFLPs检测技术、RAPD和SCAR分子标记技术以及荧光PCR技术等各类检测技术的特异性序列、片段大小和应用场景,并探讨了各检测技术的优缺点,为后期研究提供参考。

利用RAPD-PCR方法鉴定我国烟粉虱的生物型(英文)

收集了国内北京、山东、广东和海南等 14个省市 2 3个地区的蔬菜、园林花卉和杂草上的 2 3个烟粉虱Bemisiatabaci(Gennadius)种群 ,根据报道合成了一个随机引物H1 6 ,运用RAPD PCR技术对所收集的烟粉虱种群进行了生物型鉴定。结果表明在 2 3个烟粉虱种群中 ,有 17个种群同属于危害严重的“B生物型” ,这些种群主要分布在交通便利的城市或沿海地区 ,而非B生物型则主要分布在交通不便的山区或内陆。

应用RAPD标记和细胞质基因组PCR-RFLP技术研究大花蕙兰的遗传多样性

利用RAPD、叶绿体和线粒体基因组PCRRFLP标记系统评价了大花蕙兰20个品种的遗传多样性。在50个RAPD引物分析中,有36个引物(72.0%)能揭示材料间的多态性,材料间遗传相似系数为0.503～0.765,平均0.598,根据遗传相似系数进行聚类分析表明,RAPD标记能将所有材料区分开。在7个叶绿体基因组(cpDNA)的PCRRFLP分析中,6个标记(87.5%)可扩增出1至多条清晰的谱带;扩增产物经7种限制性内切酶消化后,6个标记的19种引物/酶组合共检测到53条DNA片段,其中多态性片段有37条,占69.8%;材料间遗传相似系数变化范围为0.571～0.949,平均值为0.766。在8个线粒体基因组(mtDNA)的PCRRFLP标记分析中,只有3个(37.5%)标记能得到1条清晰的谱带;利用7种限制性内切酶对3个标记的扩增产物消化后,在10种标记/酶组合中,共检测到33条酶切片段,其中21条(63.6%)具有多态性;遗传相似系数为0.634～1.000,平均0.829。这些结果表明,RAPD标记揭示的大花蕙兰遗传多样性最高,其次为cpDNAPCRRFLP标记,而mtDNAPCRRFLP标记揭示的遗传多样性最低。

人参RAPD指纹鉴定的毛细管PCR方法

本实验建立并优化了用毛细管PCR扩增人参RAPD指纹的反应体系，讨论了用毛细管PCR方法扩增RAPD指纹在中药材鉴别上的应用前景。

猕猴桃模板DNA的提取及RAPD-PCR最佳反应体系的建立

以改良CTAB法从猕猴桃叶片中制备模板DNA ,优化了PCR热循环参数 ,建立了RAPD PCR扩增的最佳反应体系。实验结果表明 ,CTAB提取液中EDTA组分的浓度对模板提取影响很大 ,其最适浓度为 80mmol/L ;用异丙醇沉淀后不经乙醇洗涤纯化的DNA不会影响扩增效果。PCR热循环参数为 :94℃预变性 5min ;94℃变性 1min ,37℃退火 1min ,72℃延伸 2min ,循环 4 0次 ;最后在 72℃延伸 6min。

松口蘑菌丝体的分离和RAPD-PCR分析

针对松口蘑 [Tricholomamatsutake(S .ItoetImai)Sing .]菌丝体分离培养困难和各种相关分离物目前难以用出菇试验鉴定的现实 ,采用 8种培养基配方 ,对 9个不同来源的松口蘑子实体的不同部位及菌根、菌土进行组织分离 ,计接种试管 81 0多支 ,结果从菌褶部位获得 94支慢生型的菌丝体分离菌株 ,从菌柄部位仅获得 1支快生型的菌丝体分离菌株。以马铃薯葡萄糖土壤滤液培养基 (PDAS)、马铃薯葡萄糖麦麸滤液培养基 (PDAW )、BM培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基 (PDA)对菌褶进行组织分离 ,获慢生型菌丝体的成功率依次为 74 4%、35 5%、1 5 6%和 8 9%。以各分离菌株的来源松口蘑子实体和中日两国松口蘑研究者提供的分离菌株作为DNA参照样品 ,对从供试子实体、菌根、菌土进行组织分离获得的各种相关纯培养物进行亲菌鉴定。采用筛选的 1 7个随机引物介导 2 5个供试松口蘑子实体及其分离菌体的RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNA) PCR反应 ,全部获得了清晰而稳定的DNA指纹图谱 ,结果一致表明 :每个松口蘑子实体的菌盖 (含菌褶 )、菌柄与从自身菌褶分离的慢生型纯培养菌丝体都具有相同的DNA指纹图谱 ,其相似系数为 1 0 0 0 ,明确揭示松口蘑个体的DNA同质性 ,而不同来源的供试松口蘑之间的相似系数在 0 934～ 0

双孢蘑菇RAPD-PCR反应体系的优化

本研究对6个影响双孢蘑菇RAPD-PCR反应的关键因素进行了一系列优化,目的在于建立理想的RAPD最佳反应条件和反应体系,为大量双孢蘑菇品种间的RAPD多样性分析做准备。各关键因素梯度设置如下:(1)7个退火温度梯度:33.5、36.5、38.3、40.1、43.7、45.4、48.1℃。(2)6个Mg2+浓度梯度:0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3mmol/L。(3)5个Taq酶用量梯度:0.5、1.0、1.5、2.0、2.5U。(4)5个dNTPs浓度梯度:0.10、0.15、0.20、0.25、0.30mmol/L。(5)5个引物浓度梯度:0.1、0.2、0.3、0.4、0.5μmol/L。(6)7个模板DNA用量梯度:100、20、4、0.8、0.16、0.032、0ng。实验结果表明:最佳的RAPD反应体系为:10×buffer2.0μl、Taq酶1.5U、模板DNA4-100ng、MgCl22.0mmol/L、dNTP0.20mmol/L,引物0.3μmol/L,加ddH2O至20μl。PCR热循环参数为94℃预变性5min;94℃变性1min,44℃退火1min50s,72℃延伸2min,循环40次;最后72℃延伸7min。

利用RAPD-PCR与ISSR-PCR标记技术分析长江口刀鲚的群体遗传结构

利用RAPD-PCR及ISSR-PCR两种分子标记技术对长江出海口两年3个群体的52条刀鲚（Goiliaectenes）进行群体遗传结构的分析。在3个群体中，利用RAPD-PCR标记技术，15个10bp随机引物共检测到110条带，多态性为0．490～0．657，Shannon多样性指数为18．63～22．38，Nei平均遗传距离为0．1195～0．1454；而利用11个ISSR引物所获得的相应结果分别为67、0．576～0．682、11．56～13．66以及0．117～0．147。相关性分析表明这两种技术所获得的上述数据呈正相关（r=0．95，P〈0．05）。AMOVA结果显示，3个群体按采集时间划分成的两年之间的遗传变异不超过总变异的1．1％，同一年内群体间的遗传变异也分别只占总变异的6．99％（RAPD）和2．75％（ISSR-PCR），群体内各个体之间的遗传变异占总变异的96％（P〈0．0001），说明两年内所采集的3个群体之间基本上没有产生遗传分化。基于样品之间的Nei遗传距离所构建的Neighborjohing聚类图也清楚地显示出没有按采样的时间产生群体的遗传分化。对各样品之间的Nei遗传距离及Neighbor-joining聚类图分别经Mantel检测及支序分析，发现ISSR-PCR技术所获得的结果与RAPD-PCR技术的结果不存在明显的正相关，但ISSR-PCR标记技术具有在待测样品中能检测到高多态性等优点。

RAPD-PCR对梨属植物品种鉴定的研究

用RAPD-PCR技术分析鉴定了梨属的18份品种材料(包括不同品种、杂交种和芽变种材料)。从OP系列8组共160个10碱基随机引物中,筛选出12种能很好地用于梨品种鉴定的引物。

适于核桃的RAPD-PCR反应体系的建立

采用CTAB法和改进的CTAB法,从叶片中提取核桃基因组DNA,比较其分离效果。结果表明,改进的CTAB法可有效去除细胞内多糖和多酚等杂质对模板DNA的污染。并以此为模板进行RAPD反应,对RAPD反应程序中的一些重要参数进行摸索和优化试验,建立适合于核桃的RAPD-PCR反应体系,以进行该树种的分子标记研究。

利用正交设计优化兴安落叶松RAPD-PCR反应体系

以兴安落叶松针叶DNA为模板,对影响落叶松RAPD-PCR扩增的重要参数进行了优化试验,以期建立兴安落叶松RAPD-PCR反应的最佳体系。通过采用正交设计L16(45)对兴安落叶松RAPD-PCR反应的5因素(Taq酶、Mg2+、dNTP、模板DNA、引物)在4个水平上进行优化试验,结果表明兴安落叶松最佳的RAPD-PCR的反应体系(20μL)中含有模板90ng,0.5μmol·L-1的引物,1×反应缓冲液,DNTP各为0.25mmol·L-1,1U的TaqDNA聚合酶,Mg2+2.5mmol·L-1。在此基础上筛选出20个扩增稳定、多态性丰富的RAPD引物,并通过梯度PCR试验,确定了引物最佳退火温度。

萝卜基因组DNA RAPD与ISSR-PCR反应体系优化

对影响PCR反应的主要因子——模板DNA、引物、dNTPs和Mg^2＋浓度进行优化，建立起适合于萝卜基因组DNA的RAID和IssR反应体系。RAPD反应体系（18μl）为随机引物0．4～0．6μmol／L，dNTPs0．15～0．2mmol／L，Mg^2＋ 2．0mmol／L，模板DNA10～40ng，TaqDNA聚合酶0．8U；ISSR反应体系（16-）为引物0．5μmol／L，dNTPs 0．16mmol／L，Mg^2＋ 2．5mmol／L，模板DNA10～40ng，TaqDNA聚合酶0．64U。对扩增程序中复性温度进行了梯度PCR试验，表明35～42℃（37℃）与52．4-58．3℃（55℃）分别适于萝卜基因组DNA的RAID．PCR和ISSR-PCR反应：应用优化的RAPD和ISSR反应体系对17个萝卜品种进行了鉴定分析。研究结果将为萝卜分子育种、品种鉴定与种子纯度检测提供重要的技术基础。

正交试验设计在建立杜鹃花RAPD-PCR反应体系中的应用

利用正交试验对影响RAPD-PCR反应体系的各种因素进行研究,从而建立适合杜鹃花RAPD反应的最佳反应体系,最终选择杜鹃基因组RAPD-PCR的最佳扩增反应体系,即模板DNA80ng、随机引物0.5μmol/L、dNTPs1.1mmol/L、MgCl22.5mmol/L,1.2μmol/LTag—DNA聚合酶,buffer2μL,总反应体系20μL。试验设计的6个因子、5个水平中,Mg2+、dNTPs和引物的浓度是主要因子,其中Mg2+的浓度对试验的影响最大,dNTPs和引物浓度在较低的水平就可满足需要,高浓度并没有显著提高试验效果。

11种兰属植物DNA的提取及RAPD-PCR实验体系的建立与优化

采用改进的CTAB-DNA提取方法，从11种兰属植物的嫩叶中提取总DNA。所得的DNA样品的A260／A280值在1．7～1．9之间，琼脂糖凝胶上主带清晰，较少降解，样品纯度高，DNA量大。另外，对影响RAPD-PCR的Mg^2＋、dNTPs、Taq酶、引物浓度等因素进行了优化。确定优化的反应体系为：75ng模板DNA，1×Buffer，2．5mmol／LMg^2＋，0．15mmol／LdNTPs，0．75UTaq酶，引物浓度0．4μmol／L，反应总体积为25山。该体系在20个供试兰属实验材料中获得较好的扩增结果。

洋葱(Alliumcepa L.)RAPD-PCR反应体系及扩增程序的优化

为建立多态性高、稳定性好的洋葱RAPD-PCR反应体系,采用正交设计,研究了Taq酶、Mg2+、引物和dNTP 4种RAPD-PCR反应组分浓度变化对扩增结果的影响,在此基础上对模板DNA用量、扩增程序中退火温度和反应循环次数进行了筛选。试验结果表明,洋葱20μl RAPD-PCR优化反应体系为1×Buffer、2.0 mmo1/L Mg2+、1.0 UTaqDNA聚合酶、200μmo1/L dNTP、0.6μmo1/L引物、2%甘油和15 ng DNA模板;PCR扩增程序为94℃预变性4 m in;94℃变性30 s,35℃退火40 s,72℃延长1.5 m in,45个循环;72℃保温延伸7 m in。

美花石斛RAPD-PCR反应体系的建立

目的建立美花石斛基因组DNA的RAPD-PCR最佳反应体系。方法在提取纯化美花石斛基因组DNA的基础上,利用PCR扩增技术和方法,对Mg2+,dNTP,模板DNA,引物,Taq聚合酶等反应条件进行优化。结果反应体系的最佳条件是总体积为25μl,其中Mg2+浓度1.2 mmol.L-1,Taq聚合酶1.2U,引物浓度0.3 mmol.L-1,模板DNA 46 ng和dNTPs 160 mmol.L-1;PCR扩增程序为94℃预变性3 min,94℃变性50 s,40℃退火1 min,72℃延伸2 min,循环40次,72℃延伸5 min。结论该反应体系具有经济,简便以及扩增条带较清晰而稳定等特点。

濒危竹种小蓬竹(Drepanostachyum luodianense)RAPD-PCR反应体系优化

为了建立小蓬竹(Drepanostachyum luodianense)RAPD-PCR反应的最优体系,以小蓬竹基因组DNA为模板,对影响其RAPD扩增的dNTPs浓度、模板DNA浓度、Taq DNA聚合酶量、引物浓度、Mg2+浓度等重要参数进行了单因子和正交试验。试验得出小蓬竹RAPD最优反应体系为:20μL反应体系,10×PCR buffer为1/10体积,dNTPs为100μmol·L-1,模板DNA量为30 ng,Taq DNA聚合酶为1.0 U,引物浓度为0.2μmol·L-1,Mg2+浓度为1.5 mmol·L-1。优化后的RAPD-PCR反应程序为:94℃预变性5 min,然后进入35个循环,即94℃变性1 min,35℃退火30 s,72℃延伸90 s,循环完毕后于72℃延伸7 min,最后在4℃保持。

RAPD-PCR系统优化用于对水稻穗型性状的分析

本实验优化了RAPD-PCR体系,并用于对重组自交系F_(12)群体中随机挑选直穗水稻和弯穗材料进行分析。结果表明,优化的RAPD-PCR体系可用于多态性分析,从100条随机引物中筛选到7条对模板DNA扩增出了具有重复性较好、清晰、稳定、多态性高的谱带,优化后的RAPD-PCR系统可望应用于对直穗和弯穗这一对性状的分析。

天牛干标本DNA的提取及RAPD-PCR扩增反应

对标本馆保存多年的天牛标本进行基因组DNA的提取,并成功用于PAPD-PCR的扩增。结果显示基因组DNA的提取与标本的保存时间无直接的联系,而与标本保存的质量关系密切。用同一引物扩增,不同种天牛的扩增片段呈现多态性。

奶牛乳房炎病例中金黄色葡萄球菌RAPD-PCR基因分型的研究

用随机扩增多态性DNA技术(RAPD)对来自2个集约化奶牛场不同奶牛乳房炎病例分出的16株金黄色葡萄球菌进行了基因分型。分别用3个寡核苷酸引物扩增,仅OLP11引物可扩增出质量良好、具有RAPD特征的条带图谱。对反应体系的退火温度、模板浓度进行了筛选,模板原倍浓度、33℃的退火温度能使所有检测菌株产生清晰、可分辨、具有较好重复性的带谱。分型结果表明,16株菌可分为2个类群,其中14株位于同一类群,大多数菌株的相关系数差距仅为0.04,这一结果提示这些菌株可能具有相同的来源和相似的遗传背景。