以淀粉酶基因为筛选标记的E.coli克隆载体的构建

以E．coli质粒pJRD184为基础，将多酶切点引入地衣芽胞杆菌（Bacilluslicheniformis）的a－淀粉酶基因信号肽编码区的PstI切点，构建了能表达并将a－淀粉酶（Amy）渗漏到胞外的E．coli克隆载体pLAM9712．该载体可根据在含有可溶性淀粉的LB平板上菌落周围有没有淀粉水解圈直接筛选重组子，从而避免了使用异丙基硫代－β－D－半乳糖苷（IPTG）、5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D一半乳糖苷（X－gal），代之以廉价的碘、淀粉．实验进一步验证了pLAM9712在基因克隆中的可行性及质粒本身的稳定性．

大肠杆菌cai DE的基因克隆与表达

从E .coliMC41 0 0菌体的染色体DNA中利用鸟枪法克隆含编码肉碱消旋酶及相关因子的caiDE基因片段 ,并经序列分析验证。由重组质粒 pJX393亚克隆得到 pDSW 2重组表达质粒 ,后者转入E .coliBL2 1 (DE3)菌株中 ,经异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导 ,在聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)上分子量为 30kD和 2 4kD附近可见明显的表达蛋白带。

大肠杆菌guaC基因的克隆及高效表达

以 E.coli MC41 0 0染色体 DNA为模板使用 PCR扩增技术克隆了鸟苷酸还原酶基因gua C,该基因全长 1 0 44bp,编码相对分子质量为 3 7ku的蛋白质。将该基因直接克隆于 p ET-1 6b质粒的 T7启动子下游 ,得到质粒 p EXP1。转化 E.coli BL2 1 (DE3 ) ,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导 ,获得了高效的表达。含表达质粒的菌体胞内粗提液经酶活分析表明 ,鸟苷酸还原酶的活性为不含质粒的宿主菌的 80～