一种以GFP为报告基因的酿酒酵母表达载体构建的新方法

利用通用载体质粒融合系统UPS (univectorplasmid -fusionsystem)构建出了以GFP (绿色荧光蛋白 )为报告基因的酵母表达载体 ,经PCR、电泳、测序等手段证明了构建的准确性 。

抗菌肽Spinigerin基因真核表达载体的构建

采用毕赤酵母偏爱原则,人工设计合成抗菌肽Spinigerin基因。按正确的阅读框架定向克隆至真核表达载体pPICZαA,经PCR鉴定及序列分析,所转化的毕赤酵母GS115中含有Spinigerin插入基因的重组质粒pPICZαA-S,结果表明成功构建了抗菌肽Spinigerin基因真核表达载体pPICZαA-S。

小鼠4.5SRNA逆转座子cDNA的克隆及其表达载体的构建

利用ＲＴ＿ＰＣＲ方法，从小鼠肝脏组织总ＲＮＡ中扩增出４．５ＳＲＮＡ的ｃＤＮＡ．此ｃＤＮＡ被克隆到ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）质粒，酶切鉴定并测序．然后将该序列插入以虫荧光素酶基因作为报导基因的表达载体ｐＳＶｌｕｃ２０的ＰｖｕⅡ位点，构建了含４．５ＳＲＮＡ逆转座子的表达载体ｐＳＶｌｕｃ２０＿４．５Ｓ．并对４．

猪传染性胃肠炎病毒S基因植物表达载体的构建

应用RT-PCR技术克隆了猪传染性胃肠炎病毒TGEV-JL株S基因全序列,将其连接到pMD18-T载体。经SacⅠ和BamHⅠ酶切鉴定,其产物全长4320bp。测序后与TH-98等8个TGEV毒株的S基因序列进行比对,同源性为97.6%～99.8%。将该基因插入植物表达载体pBI121的CaMV35S启动子下游,构建高效植物表达载体,转入根癌农杆菌EHA101中。结果表明:成功构建了重组植物表达载体pBI121-S,获得农杆菌工程菌。

马铃薯S病毒CP基因原核表达载体的构建

以质粒pGEM-pvs为模板,经PCR扩增得到了长约890bp的PVS-CP基因条带。回收特异性DNA带并与T表达载体pBAD/Thio-TOPO连接,连接物转化受体菌获得了Amp抗性菌落。经PstⅠ、SphⅠ酶切鉴定,筛选到了PVS-CP基因正向插入载体的阳性克隆。DNA测序结果表明PVS-CP基因插入方向与读码正确,成功构建了PVS-CP基因的原核表达载体。经阿拉伯糖诱导获得了预期的49kDa融合蛋白,PVS-CP基因在受体菌中表达正确。

猪传染性胃肠炎病毒S基因抗原位点片段的真核表达

为探讨利用转基因动物乳腺生物反应器生产基因疫苗的可行性,构建了以奶牛β-酪蛋白启动子为调控序列,增强型绿色荧光蛋白为报告基因的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因抗原位点区乳腺表达载体pEGBS。通过脂质体介导方法将其转染小鼠乳腺癌细胞EMT6,在倒置荧光显微镜下可观察到明亮的绿色荧光分布于阳性细胞,并且RT-PCR检测结果显示,RT-PCR扩增产物与目的基因片段大小相符,证明其确实源于重组质粒转录后的mRNA。

禽传染性支气管炎病毒S_1基因玉米表达载体的构建

禽传染性支气管炎病毒主要编码3种结构蛋白,其中S蛋白的S1蛋白是宿主的主要保护性抗原,能诱导机体产生中和抗体和血凝抑制抗体,并与病毒的组织嗜有关。本研究选取具有代表性的禽传染性支气管炎病毒分离株SAIB14和SAIB4,以其S1基因克隆质粒pUCSAIB14和pUCSAIB4为模板,用具有高保真度的pfu酶分别扩增,得到含先导序列的S1基因片段。把扩增产物分别通过ClaI和BamHI酶切纯化,替换中间载体pUGFPocs的GFPm1基因,构建中间表达载体pUSAIB14和pUSAIB4。用KpnI和HindIII双酶切重组质粒pUSAIB14和pUSAIB4,回收Ubi-S1-Tocs片段,定向插入到pCAMBIA1300载体的多克隆位点。经酶切和PCR鉴定,证明获得了S1基因的玉米表达载体pCUSAIB14和pCUSAIB4。外源基因导入受体植物能否有效表达,表达载体构建是关键因素,构建时选用表达载体的类型、启动子和终止子、目的基因插入位点等都有影响。本研究用BamHI和ClaI双酶切载体pUGFPocs,用S1基因扩增片段替换GFPm1基因,将S1基因置于Ubi启动子和T-ocs终止子的控制之下,有助于S1蛋白的高效表达,最后将Ubi-S1-Tocs单元HindIII和KpnI双酶切下来,插入到pCAMBIA1300的多克隆位点,得到可用于农杆菌介导的转化或直接转化的植物表达载体pCUSAIB4和pCUSAIB14。Ubi启动子来自玉米,属组成型启动子,?

小白杏自交不亲和S-RNase基因RNAi表达载体的构建及遗传转化

为了应用RNAi技术调控杏自交不亲和性状,根据自交不亲和S66-RNase基因序列(Gen Bank登录中)设计特异引物,通过RT-PCR扩增S66-RNase基因(Gen Bank登录中)高变区及下游(63 bp)作为靶基因,构建RNAi表达载体的ihp RNA。以植物表达载体p CAMBIA为骨架载体,利用农杆菌介导的方法转化本氏烟,利用子房转化法转化小白杏。结果显示:获得了长度为439 bp的ihp RNA。表达载体酶切检验表明S66-RNase基因的RNAi表达载体构建和转入农杆菌LBA4404成功。通过抗性筛选和GUS染色检测,获得了16株阳性植株。结论:获得转基因烟草植株证明了本研究构建的RNAi植物表达载体有效,为诱导杏S-RNase基因转录后基因沉默、获得自交亲和的杏提供参考。

两种帕金森体外模型的构建及相关研究

为检测a-突触核蛋白(a-Synuclein)在人神经元母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)中的表达,构建人野生型(WT)和A53T突变型a-Synuclein质粒(p EGFP-SNCA-WT和p EGFP-SNCA-A53T),经酶切鉴定无误后转染SH-SY5Y细胞,并对转染完成的细胞进行嘌呤霉素筛选,然后通过PCR法扩增转染后SH-SY5Y细胞的a-Synuclein片段,并对其进行测序,检测目的基因,运用Western blot法检测转染后SH-SY5Y细胞中a-Synuclein的表达.酶切鉴定结果表明p EGFP-SNCA-WT和p EGFP-SNCA-A53T质粒构建成功,嘌呤霉素筛选和转基因细胞a-Synuclein片段测序结果显示慢病毒表达载体能成功的整合到SH-SY5Y细胞基因组中,Western blot结果表明,转染后的SH-SY5Y细胞能成功的过表达a-Synuclein.a-Synuclein慢病毒表达载体构建成功,并且SH-SY5Y细胞作为宿主细胞能够表达a-Synuclein.为今后帕金森病(PD)体外模型的建立及帕金森病发病机制的研究奠定了基础.

表达hβ2m-A24单链的RMA-S细胞系的构建及鉴定

目的构建人类白细胞抗原HLA-A24真核表达载体,并使其在小鼠细胞RMA-S获得稳定表达。方法采用PCR方法扩增出HLA-A24基因的重链,将其克隆到含轻链β2m的真核表达载体pcDNA3.1上,构建成表达完整HLA-24分子的真核表达载体。用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒,电转染RMA-S细胞,药物筛选稳定细胞系。蛋白印迹法和流式细胞鉴定HLA-A24分子在靶细胞表面的表达。结果成功构建了pcDNA3.1/A24真核表达载体,并使LA-A24分子在HLA-A24阴性的小鼠RMA-S细胞表面获得稳定表达。结论真核表达载体成功构建和稳定转染RMA-S细胞系的建立为进一步研究HLA-A24人群中多种疾病的细胞免疫、筛选和鉴定合适的T细胞抗原表位奠定了基础。

GST-CTCF融合蛋白原核表达载体的构建及表达

目的构建人CCCTC结合因子(CCCTC-binding factor,CTCF)与谷胱甘肽转移酶(glutathione S-transferase,GST)重组蛋白的原核表达载体,并进行诱导表达。方法以pEASY-T1-SIMPLE-CTCF为模板,设计引入限制性酶切位点的CTCF引物,PCR方法扩增目的片段,产物经限制性内切酶酶切后与原核表达载体pGEX-4T-1连接,构建成pGEX-4T-1-CTCF原核表达载体,转化至大肠埃希菌BL21中,经异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)进行诱导,Western blot检测GST-CTCF融合蛋白的表达情况。结果经菌液PCR、质粒双酶切分析、基因测序分析证实重组表达质粒pGEX-4T-1-CTCF构建成功,GST-CTCF融合蛋白产物经Western blot鉴定为特异性表达。结论成功构建了pGEX-4T-1-CTCF原核表达质粒,获得特异性的GST-CTCF融合蛋白,为进一步研究转录因子CTCF的功能奠定了基础。

利用基因工程技术构建重组人血小板因子4真核表达载体

目的:构建携带绿色荧光蛋白标签的重组人血小板因子4基因(plateletfactor4,PF4)的真核表达载体,并在真核细胞中表达,为研究其生物学功能奠定基础。方法:人工合成PF4基因模板,通过PCR方法扩增PF4-cDNA,然后克隆至pUC19克隆载体,经序列测定后重组入pIRES2-EGFP真核表达载体并进行酶切鉴定。将鉴定正确的质粒用脂质体转染法瞬式转染至COS7细胞中。结果:获得了PF4-cDNA基因,序列分析表明,该序列与GenBank数据库中的序列一致。重组质粒酶切鉴定表明,PF4基因已与pIRES2-EGFP真核表达载体正确连接。荧光显微镜示,此载体成功转染至COS7细胞中,并获得有效表达。结论:利用基因工程技术,成功的构建了携带绿色荧光蛋白标签的PF4的真核表达载体,并在真核细胞中获得有效表达,为下一步研究其在真核细胞中的生物学功能奠定基础。

紫杆柽柳谷胱甘肽硫转移酶基因的烟草转化

将所克隆的紫杆柽柳谷胱甘肽硫转移酶基因(TaGST)构建成植物表达载体pB I-TaGST,通过农杆菌介导法将其转入烟草W 38(Nicotiana tabacumcv.W 38),获得了转基因的烟草植株.转基因植株的PCR和RT-PCR检测表明,该目的基因已经整合到烟草基因组上.

海甘蓝硫甙合成关键酶S-GT基因两种表达载体的构建

Thiohydroximate S-glucosylt ransferase(S-GT)是硫甙生物合成的一个关键酶。根据发表的甘蓝型油菜S-GT基因cDNA序列设计引物,以海甘蓝总DNA为模板进行PCR扩增,获得S-GT基因全长,构建了海甘蓝S-GT基因的植物双元表达载体pCambia2300sn-Ca SGT。用PCR的方法对CaSGT基因的外显子进行了拼接,将得到的序列正向插入到了大肠杆菌表达载体pET-32b(+)中,得到重组质粒pET-32b(+)-CaS-GT,为进一步研究CaSGT的生物学特性打下基础。

日本血吸虫谷胱甘肽转移酶基因片段在真核表达载体中的亚克隆

目的将日本血吸虫谷胱甘肽转移酶(GST)基因片段克隆到真核表达载体 pBKCMV中,以便对其进行核酸疫苗的研究。方法特定寡核苷酸引物的设计和合成,TRIZOL 提取日本血吸虫成虫 RNA,RT-PCR 法扩增 GST 基因编码序列,将扩增产物连接 pGEM-T 克隆载体,再亚克隆到真核表达载体 pBK CMV 中。结果 RT-PCR 法特异性扩增出 SiGST 编码基因片段,其大小约为670bp,经双酶切、PCR 鉴定表明所构建的质粒 pGEM-T-GST 和 pBK CMV-GST中含有目的基因。结论 pBK CMN-GST 重组质粒的成功构建,为进一步表达 GST 及其在血吸虫病免疫诊断、免疫预防中的作用研究提供了条件。

日本血吸虫Mr=26×10^3谷胱甘肽S-转移酶基因植物表达载体的构建

【目的】构建日本血吸虫Mr=26×103谷胱甘肽S-转移酶(GST)基因的植物表达载体,为研制血吸虫病口服疫苗做前期准备。【方法】采用PCR技术,扩增目的基因GST,与植物表达载体pBI121连结,构建重组表达载体pBI121-GST。【结果】通过PCR检测和双酶切鉴定以及重组质粒序列测定,结果表明,该目的基因片段已被整合到植物表达载体pBI121中,通过电激转化,将质粒转入农杆菌菌株LBA4404、EHA105中。【结论】本实验成功地构建了日本血吸虫Mr=26×103谷胱甘肽S-转移酶GST基因的植物表达载体。

家蚕蛹表达的乙型肝炎表面抗原中蛋白口服免疫原性的研究

目的 探讨家蚕蛹表达的重组乙型肝炎表面抗原中蛋白 [rHBsAg(PreS2 +S) ]口服免疫原性。方法 选择 4周龄的SD大鼠 ,将重组病毒感染后的家蚕蛹 ,制成口服剂型灌胃大鼠 ,ELISA方法检测抗 HBs抗体及抗 PreS2抗体。结果 在灌胃重组蛋白组中有 4 0 %鼠体血清内检测到了特异性抗 HBs抗体及抗 PreS2抗体 ,抗体应答反应持续 2～ 3周 ;口服免疫后抗体转阳的SD鼠加强免疫后能产生较强的二次免疫应答。进一步研究表明 ,口服家蚕蛹表达的rHBsAg(PreS2 +S)具有加强免疫的效果。对酵母重组疫苗单剂腹腔注射过的SD鼠 ,用家蚕蛹表达的rHBsAg(PreS2 +S)灌胃加强免疫后 ,能诱导鼠体迅速产生较强的抗 HBs抗体。结论 家蚕

T载体克隆乙肝病毒preS2+S基因的实验研究

将商品化真核表达载体pcDNA3改造成T载体pcDNA3－T，并运用pcDNA3－T直接克隆了由PCR扩增的adw2亚型乙肝病毒preS2与S基因。结果：pcDNA3－T与PCR产物的重组率高达70％。提示：该方法具有简便，省时等特点。

SARS-CoV S蛋白基因的克隆及其与VSV-G融合表达载体的构建

为了解重症急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)表面S蛋白的受体结合功能域及其在宿主细胞上的作用受体,应用PCR技术从SARS-CoVcDNA中克隆到S蛋白的全长基因,并构建了S蛋白与疱疹性口腔炎病毒胞膜蛋白(VSV-G)融合表达载体pVSV-G'-SG,进而为制备含有SARS-CoVS蛋白膜外区的逆转录病毒假毒粒奠定了实验基础。

峨嵋山地区块体图的计算机绘制

本文介绍了用计算机辅助设计软件 AUTOCAD与三维动画软件 3DMAX来绘制峨嵋山地区块体图的方法 ,以此为例子讲述了将地形图改画成三维图的具体操作步骤。并进一步论述了用计算机绘制块体图的方法有着广泛的应用前景及其实用价值。