牛传染性鼻气管炎病毒gB基因的截短表达与间接ELISA诊断方法的建立

经DNAstar分析,据牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)全基因序列设计合成gB基因的特异性引物,以构建的pGM-T-gB为模板,PCR扩增IBRV gB蛋白192-266位氨基酸的基因序列。将目的片段克隆,酶切鉴定并测序鉴定后,定向插入pET32a表达载体中,转化表达菌BL21。SDS-PAGE电泳分析表明,诱导表达产物以包涵体和可溶形式存在,大小约为29.2 ku,与预测值相符。亲和纯化后重组蛋白浓度为2.000 mg/mL,纯度为79.2%。间接ELISA检测证明,表达蛋白具有抗原性。以该蛋白作为诊断抗原,建立了间接ELISA诊断方法。确定的抗原包被浓度为50μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶40,阳性标准定为S/P>0.395。交叉试验表明对牛流热(BEV)、牛肺疫(CBPP)、牛病毒性腹泻(BVD)、牛结核(BTB)、牛副结核(PBB)以及牛赤羽病(BAD)等其它6种疾病阳性血清不发生交叉反应。与中和试验相比较,特异性、敏感性和符合率分别为83.3%、90.9%和88.9%;与进口法国IBRV全病毒ELISA抗体诊断试剂盒比较,特异性、敏感性和符合率分别为92%、92.7%和92.5%。上述结果表明该诊断方法具有良好的特异性和敏感性,显示了良好的应用前景。

鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)王岗株糖蛋白gB基因序列比较分析

根据已经发表的鸡传染性喉气管炎病毒 ( ILTV) SA2 株的 g B基因序列 ,设计了 1对引物 ,通过 PCR扩增了 ILTV王岗株的 g B基因 ,并克隆到 p UC1 1 9质粒的 Eco R 位点中 ,经酶切鉴定证实后 ,进行了序列测定。结果表明 ,g B基因长 2 6 1 9bp,包含完整的阅读框架。序列比较分析表明 ,ILTV王岗株的 g B基因核苷酸序列与英国的 Throne882和美国的 6 32 2个强毒株的 g B基因序列完全一致 ,而与澳大利亚 SA2 疫苗株g B基因核苷酸同一性为 99.8% ,氨基酸的同一性为 98.4 %。与澳大利亚 SA2 疫苗株 g B基因核苷酸和氨基酸序列比较发现 ,ILTV 3个强毒株 (王岗株 ,Throne 882株和 6 32株 ) g B基因的核苷酸序列在第 89位上均缺失 1个碱基 G,而在第 1 0 2位核苷酸处又插入了 1个碱基 A,从而引起了在氨基酸序列中第 2 9～ 32位 5个氨基酸的移码突变。

猪巨细胞病毒gB蛋白抗原表位富集区的表达和抗原性的分析

为表达猪巨细胞病毒(PCMV)gB基因,本研究根据GenBank登录的PCMV gB基因序列设计1对引物,以感染PCMV猪肺细胞总DNA为模板,采用PCR扩增得到gB基因片段,克隆于pMD-18T并进行核苷酸序列测定。利用DNAStar分析gB蛋白的抗原表位,选择抗原表位富集的2个基因片段(命名为PCMVgB1和PCMVgB2)分别克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组表达质粒并转化Rosetta(DE3)宿主菌。结果显示:扩增的gB基因与GenBank登录的PCMV gB基因的核苷酸同源性在97.6%～98.9%之间,推导的氨基酸同源性在97%～98.6%之间。经IPTG诱导的含pET-gB1和pET-gB2重组质粒的宿主菌可表达重组gB1和gB2蛋白,SDS-PAGE显示分子量约为62ku和36ku。Western blot和间接ELISA结果表明,重组gB1和gB2蛋白均具有反应原性。

以杆状病毒为载体在昆虫细胞中表达鸡马立克病病毒糖蛋白B抗原基因

以杆状病毒为载体，在昆虫Ｓｆ９细胞中表达了马立克病病毒的与病毒中和反应密切相关的囊膜糖蛋白Ｂ抗原基因（ｇＢ）。用３５Ｓ－蛋氨酸标记重组杆状病ｇＢ－ＡｃＮＰＶ感染细胞溶解物和抗ＭＤＶｇＢ单克隆抗体１ＡＮ８６作免疫沉锭反应，显示出分子量为９８ｋＤ、５５ｋＤ和４９ｋＤ的３条ＭＤＶｇＢ特异性蛋白质带，与天然ＭＤＶｇＢ的１００ｋＤ、６０ｋＤ和４９ｋＤ糖蛋白在大小和带型上类似。在标记过程中加入能抑制蛋白质Ｎ－糖基化的抗菌素ｔｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ，或在标记后用能水解糖苷键的Ｎ－内切糖苷酶Ｅｎｄｏ－Ｈ及ｇｌｙｃａｎａｓｅ酶处理标记细胞溶解物，然后再作免疫沉淀反应。结果表明，在昆虫细胞中表达的重组ＭＤＶｇＢ确能象ＭＤＶ感染的鸡成纤维细胞中的天然ｇＢ那样糖基化。二者糖基化的程度及方式略有差别，但亦非常相似。抗重组ＭＤＶｇＢ鸡血清能象抗ＭＤＶ血清那样与ＭＤＶ感染细胞在荧光抗体试验中呈阳性反应，但未能表现病毒中和作用，其原因有待进一步研究。

禽马立克氏病毒糖蛋白B基因在家蚕中的表达

将马克克氏病毒（Marek'sdiseasevirus，MDV）糖蛋白B（gB）基因克隆入转移载体pBac－PAK8中，得到重组转移载体质粒pBacPAK（gB）。经限制性酶切图谱结合Southernblot分析鉴定表明，gB基因以正确方向插入转移载体，受多角体蛋白基因启动子控制。将此转移载体与经CvnI酶切线性化的亲本病毒Bm－BacPAK6DNA通过脂质体法共转梁家蚕细胞，只有发生重组的病毒才有复制增殖的能力。然后通过蓝白斑筛选、结合点杂交，纯化得到重组的空斑病毒vBM，用该重组病毒接种家蚕5龄幼虫，对表达产物进行SDS－PAGE分析，检测到gB基因在家蚕中高效表达，表达产物的分子量主要为97KD，表达量约为1mg／mL血淋巴。

人类免疫球蛋白超家族一个新成员:α-1B糖蛋白前体基因的克隆和分析

应用RACE方法 ,从人肝MarathoncDNA中克隆一 16 94bp的cDNA ,其中开放阅读框架在 4 3～ 15 30bp ,编码 4 95个氨基酸 ,1～ 17氨基酸为信号肽 ,有 4个IGc2结构域 ,与从人血浆分离的α 1B糖蛋白高度同源 ,是一个尚未克隆的α 1B糖蛋白前体基因 ,属于免疫球蛋白超家族的一个新成员 。

汉族人血小板GP Ⅰ b HPA-2基因多态性与冠心病血瘀证的相关性研究

目的观察GPⅠb HPA-2(Ko^b/Ko^a)基因多态性,在北京河北地区汉族人中各基因型的分布频率,分析该多态性与冠心病、冠心病血瘀证易感性的相关性。方法采用病例对照设计,筛选符合冠心病、血瘀证、健康人入选标准的110例冠心病血瘀证、102例冠心病非血瘀证患者及106例健康对照人群为研究对象,进行中医辨证分型、血瘀证计分,并记录冠脉造影病变支数,采用基因测序技术检测HPA-2基因多态性。结果GPⅠb HPA-2a/2a、HPA-2a/2b、HPA-2b/2b各占90.9%,8.8%和0.3%,所有入选病例中仅有1例表达HPA-2b/2b型;冠心病组和健康对照组、冠心病血瘀证组和冠心病非血瘀证组的基因型构成,冠心病患者不同病变支数基因型构成,冠心病血瘀证各基因型患者的血瘀证计分,各组间比较均无显著性差异(P>0.05)。以是否患冠心病为因变量的二分类Binary Logistic回归分析,校正年龄、性别、体重指数对冠心病的影响后,结果显示HPA-2多态位点基因型与冠心病发病无相关性。结论GPⅠb的HPA-2多态位点不是汉族人冠心病、冠心病血瘀证的独立危险因素。

鸡传染性喉气管炎病毒gB基因核酸探针的研究

将插有传染性喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ）糖蛋白Ｂ（ｇＢ）基因的重组质粒ｐＩＬｇＢ克隆，然后用碱法抽提，乙醇沉淀。质粒ｐＩＬｇＢ经ＥｃｏＲＩ酶切后，用地高辛标记，获得ＩＬＴＶｇＢ基因的核酸探针。该探针分别与传染性喉气管炎病毒，传染性支气管炎病毒，传染性法氏囊病毒，禽流感病毒，马立克氏病病毒，新城疫病毒核酸斑点杂交，发现只有传染性喉气管炎病毒的核酸有阳性反应，说明该探针对ＩＬＴＶ有高度的特异性。ｇＢ基因核酸探针与不同浓度的核酸杂交，能检出０．０１μｇ的核酸，表明该探针高度敏感。实验结果还显示，探针能重复多次使用，检测效果不变。

含有马立克氏病病毒糖蛋白B基因重组质粒的构建及其鉴定

将马立克氏病病毒(MDV)GA 株基因文库中 BamH I I_3和 K_3克隆片段分别用 BamH I 加 Sal I 和 BamH I加 EcoR I 双酶切消化。含有编码 MDV 糖蛋白 B(gB)部分 DNA 的2.B kb、BamH I-Sal I 片段和1.1kb、BamH I-EcoR I 片段与 Sal I-EcoR I 消化的载体 pUR 222通过三聚体连接方式相连接。限制性核酸内切酶分析表明,重组质粒含有 MDV gB 基因,并且 MDV GA 株 gB 基因克隆在 EcoR I,Hind,Ⅲ,Xba I 和 Sal I 切点与 MDVRBIB 株相同。

HSV-1截短gB基因DNA疫苗的构建及初步鉴定

目的 为有效预防单纯疱疹Ⅰ型病毒 (HSV - 1 )感染 ,给多价DNA疫苗的构建奠定基础 ,构建表达截短HSV - 1 gB糖蛋白的DNA疫苗。方法 用PCR技术从HSV - 1基因组中扩增出编码HSV 1gB糖蛋白 1 - 5 1 7氨基酸序列的一段基因序列 ,通过 pGEM -T中介载体 ,将其插入到真核表达质粒pcDNA 3 1 (+)的CMV启动子下游。结果 构建的重组真核表达质粒可在动物体内正确表达目的基因 ,对HSV - 1病毒攻击具有免疫保护作用。结论 本研究对截短HSV - 1 gB基因DNA疫苗进行了初步的探索性研究 ,也为多价HSV 1DNA疫苗的构建奠定了基础。

马立克氏病病毒囊膜糖蛋白B基因原核细胞表达产物单克隆抗体的制备

用大肠杆菌 BL2 1表达了马立克氏病病毒 (MDV)强毒 GA株的囊膜糖蛋白 B(g B)基因 ,通过 SDS- PAGE电泳分离表达蛋白条带 ,切下并碾碎后作为免疫原制备单克隆抗体。通过 EL ISA和间接免疫荧光试验 (IFA) ,得到 1株阳性单克隆抗体杂交瘤细胞株 7C8。该单抗腹水的 EL ISA效价为 1∶ 2 1 2 ,IFA效价为 1∶ 80 0 ,与 MDV不同致病型毒株CVI988、GA、RB1B、MD11、6 48A株感染的鸡胚成纤维细胞 (CEF)均呈 IFA阳性。1∶ 10 0稀释时与 GA株感染的 CEF在斑点酶联免疫吸附试验 (dot- EL ISA)中呈阳性。

马立克氏病病毒囊膜糖蛋白B基因原核表达产物单抗的制备

用大肠杆菌 BL2 1表达了马立克氏病病毒 ( MDV)强毒 GA株的囊膜糖蛋白 B( g B)基因 ,通过 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳( SDS- PAGE)分离表达蛋白条带 ,切下并碾碎后作为免疫原制备单克隆抗体。通过酶联免疫吸附试验 ( ELISA)和间接免疫荧光试验( IFA) ,得到 1株 GA株阳性的单克隆抗体杂交瘤细胞株 7C8。该单抗腹水的 ELISA效价为 1∶ 2 1 2 ,IFA效价为 1∶ 80 0 ,与 MDV不同致病型毒株 CVI988、GA、RB1 B、MD1 1、6 48A株感染的鸡胚成纤维细胞 ( CEF)均呈IFA阳性。 1∶ 1 0 0稀释时与 GA感染的 CEF在斑点酶联免疫吸附试验 ( dot- EL ISA)中呈阳性。

单纯疱疹病毒1型截短糖蛋白B基因疫苗的构建及其诱导小鼠细胞免疫应答

目的：构建、制备单纯疱疹病毒1型截短糖蛋白B DNA疫苗，检测其诱导机体产生的细胞免疫应答效果。方法：利用PCR技术从HSV-1 SM44毒株基因组中扩增出编码HSV-1 gB14-507氨基酸序列的一段基因。定向插入真核表达质粒pcDNA3载体中，构建出重组真核表达质粒pcDNA3-gBt，并对其进行酶切分析、PCR鉴定及测序鉴定。于BALB/c鼠注射免疫3次，抗体分析CD4＋、CD8＋T细胞亚群的变化，羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）/碘化丙碇（PI）双标记的流式细胞计数法检测CTL活性。结果：PCR及测序鉴定结果显示，插入的克隆基因与GenBank中HSV-1F株gB基因序列一致，证实了HSV-1 gBt核酸疫苗的构建；pcDNA3-gBt免疫组BALB/c鼠的CD4＋T细胞数较空质粒（pcDNA3）对照组和生理盐水对照组增加，CTL活性也较对照组明显增强，但是pcDNA3-gBt免疫组BALB/c鼠的CD8＋T细胞、CD4＋/CD8＋T细胞比值与对照组比较差异均无显著性（P〉0.05）。结论：HSV-1 gBt核酸疫苗诱导较强的细胞免疫应答。

表达MDVgB基因的重组鸡痘病毒的免疫效果研究

将马立克氏病病毒 (MDV)gB基因插入鸡痘病毒 (FPV)中 ,构建了含有MDVgB基因的重组鸡痘病毒 (rFPV)。用rFPV、HVT冻干苗、rFPV +HVT疫苗分别免疫 1日龄AA肉用雏鸡 ,于 8日龄攻毒后观察疫苗免疫效果。实验结果表明 ,HVT、rFPV、HVT +rFPV疫苗免疫组比攻毒对照组病毒血症持续时间短 ;上述 3种疫苗免疫后用京 1株MDV(vMDV)攻毒 ,脾脏T淋巴细胞增殖反应处于较高水平 ,而攻毒对照组脾脏T淋巴细胞增殖反应减弱 ,两者差异显著(P <0 0 5 ) ;用HVT +rFPV二价疫苗免疫雏鸡 ,其抵抗vMDV攻击的免疫保护力高于HVT和rFPV单价苗 ,HVT +rFPV、rFPV、HVT免疫保护指数分别为 81 7% ,6 3 4 %和 6 4 1%。以上结果表明 ,表达MDVgB基因的重组鸡痘病毒疫苗在一定程度上能保护鸡体抵抗vMDV的攻击 ,并且HVT和rFPV具有免疫协同作用。

猴B病毒囊膜蛋白gC基因密码子优化及其在大肠埃希菌中的表达

根据猴B病毒E2490标准株gC基因,选择大肠埃希菌偏好的密码子,设计合成了1 200个碱基,共编码400个氨基酸,测序证实后,克隆入pET-28b(+)载体,转化至大肠埃希菌BL21(DE3),在IPTG诱导下获得50 ku以包涵体形式表达的gC重组蛋白。Western blot分析表明表达产物能够被猴B病毒标准阳性血清识别。间接ELISA检测表明,重组蛋白与人单纯疱疹病毒1型、2型阳性血清无交叉反应。本研究为进一步建立检测猴B病毒抗体间接ELISA方法奠定了基础。

聚合酶链反应用于人巨细胞病毒B基因编码区段的体外扩增

作者采用聚合酶链反应(PCR)成功地从含人巨细胞病毒B基因的重组质粒pBH_2DNA中扩增及分离了B基因编码区段及其产物糖蛋白52kd抗原编码区段。0.2μg的模板DNA经过30次循环,目的基因片段的扩增量达到10μg,足以用于酶谱分析及克隆的构建。

马立克病病毒糖蛋白B抗原基因克隆的酶切分析

用狄可辛标记的马立克病病毒(MDV)基因组DNA的BamHⅠ-K_3片断为探针,从建于pUC18质粒中的GA株MDV感染细胞基因组DNA的基因文库中,筛选到MDV糖蛋白B抗原基因克隆,酶切分析表明,GA株MDV的B抗原基因克隆在EcoRⅠ、HindⅢ、SalⅠ及BamHⅠ等酶切位点的分布上与RBIB株MDV的B抗原基因没有区别。

鸡传染性喉气管炎病毒烟台株gB基因的序列测定及其结构功能分析

研究以鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)烟台株为模板,PCR扩增出1条约2.7kb的gB基因片段,并将其克隆到pMD18-T载体中。序列测定显示,gB基因长2622bp,包含完整的阅读框架。序列比较分析发现,烟台株和王岗株、河北株的gB基因核苷酸序列与SA2株的相比均在第89位上缺失1个碱基G,而在第102位核苷酸处插入1个碱基A,从而引起氨基酸序列中第29～32位5个氨基酸的移码突变。烟台株还有另外7个碱基发生突变,使得其gB基因与河北株、王岗株、疫苗株的gB基因核苷酸同源性分别为99.8%、SA299.7%和99.6%,氨基酸的同源性分别为99.4%、99.4%、98.9%,表明不同ILTV毒株之间gB基因是非常保守的。

NF-κB抑制剂PDTC逆转K562/AO_2细胞耐药性及其机制的研究

为研究NF-κB的异常活化在K562/AO2细胞耐药机制中的作用,采用非细胞毒剂量抗氧化剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)抑制K562/AO2细胞NF-κB表达,用MTT法检测K562/AO2细胞对药物敏感性的变化,RT-PCR、流式细胞术分别检测K562、K562/AO2细胞mdr-1 mRNA、P-gp表达水平以及不同浓度PDTC作用一定时间对其影响。结果显示:①阿霉素(ADM)诱导耐药的K562/AO2细胞对ADM的耐药性是K562细胞的59倍;非细胞毒剂量PDTC预作用后,ADM对K562/AO2细胞的IC50显著降低,相对逆转耐药效率为93.03%,强于经典耐药逆转剂维拉帕米(Ver);②K562/AO2细胞NF-κB表达水平高于K562细胞(p<0.01);3组非细胞毒剂量PDTC作用后K562/AO2细胞NF-κB表达均受抑制;0.2μmol/LPDTC作用24小时抑制效应最强,K562/AO2细胞NF-κB表达降至接近K562细胞水平(p>0.05);③K562/AO2细胞mdr-1 mRNA、P-gp表达均高于K562细胞(p<0.01);3组非细胞毒剂量PDTC作用K562/AO2细胞48小时后,其mdr-1 mRNA、P-gp表达明显减少。结论:抑制NF-κB异常活化可部分逆转K562/AO2细胞耐药性,其机制与mdr-1 mRNA及其编码的P-gp表达减少有关。

马疱疹病毒8型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立一种能够快速检测马疱疹病毒8型(EHV-8)的方法,本试验以EHV-8的全基因组序列为模板,针对糖蛋白B(gB)基因的保守序列,进行对比分析,设计EHV-8的特异性引物和探针,优化反应条件,建立EHV-8 TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法的敏感性、特异性和重复性进行验证,使用该方法进行临床样本检测。结果显示,建立的EHV-8 TaqMan实时荧光定量PCR检测方法对EHV-8 DNA模板的最低检测限为1.1×10^(2)copies/μL,敏感性高;EHV-8与EHV-1、EHV-4、马流产沙门氏菌和肠产毒性大肠杆菌均无交叉反应,特异性强;批内重复性试验和批间重复性试验均表明该方法重复性好。对132份临床样本的检测结果显示,阳性检出率为10.61%,基因测序正确。由此可见,本试验建立的EHV-8 TaqMan实时荧光定量PCR检测方法能够满足EHV-8的检测需求,且该方法敏感性高、特异性强、重复性好,为EHV-8的进一步研究提供了有效的辅助检测手段。