小白链霉菌(Streptomyces albulus)的原生质体制备研究

广谱天然防腐剂ε-多聚赖氨酸产生菌Streptomyces albulus的育种工作目前仅处于常规育种水平,为对其进行原生质体技术的育种改造,对影响S.albulus原生质体制备的几个重要因子进行了详细研究。测定了S.albulus的生长曲线,确定制备原生质体的最佳菌龄为稳定期初期即培养40h;S发酵液中添加2·0%甘氨酸可使原生质体形成率最高;以破坏链霉菌细胞壁效果最好的溶菌酶进行酶解,确定最佳酶解温度为为35℃、最佳酶解时间为180min、最佳溶菌酶浓度为2.0mg·mL-1;在以上最佳原生质体制备条件下可获得纯净且量多的S.albulus原生质体,形成量达1.74×108cfu·mL-1,为S.albulus原生质体的进一步遗传育种奠定了良好的基础。

Streptomyces albulus NK49合成ε-聚赖氨酸及其产物特征

从土壤中分离到一株ε-聚赖氨酸高产菌株．通过细胞、菌落形态特征研究、生理生化反应以及16SrDNA序列分析，对该菌株进行了分类鉴定．命名为小白色链霉菌NK49（StreptomycesalbulusNK49）．利用摇瓶培养72h后检测到ε-聚赖氨酸产量达0．74g／L．通过1HNMR、13CNMR和MALDI—TOF—MS对ε-聚赖氨酸的结构进行了表征．小白色链霉菌NK49所合成的ε-聚赖氨酸的聚合度为21～34，聚合度28～31的￡聚赖氨酸为主要组分．该聚合度与已报道的微生物产ε-聚赖氨酸的聚合度不同，具有独特性．

基于低pH适应性进化策略提高小白链霉菌ε-聚赖氨酸合成能力

小白链霉菌(Streptomyces albulus)是ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)的工业生产菌,其在发酵生产过程中遭受低p H胁迫,易造成ε-PL合成能力下降。因此,该文采用一种逐级增加选择压力的低p H适应性进化策略,经过连续93 d的适应性进化,实现S.albulus GS114耐受p H值由4.0降低到3.6。经过大量筛选,获得了低p H适应性进化菌株S.albulus ALE4.0、S.albulus ALE3.8和S.albulus ALE3.6;结合低p H耐受性和摇瓶发酵实验,确定最优适应性进化菌株为S.albulus ALE3.6。进一步考察不同p H值对S.albulus ALE3.6合成ε-PL的影响发现,S.albulus ALE3.6在不同p H值条件下,较出发菌株S.albulus GS114均表现出发酵优势。最后,采用恒定p H 4.0补料分批发酵方式,在5 L发酵罐水平实现S.albulus ALE3.6的ε-PL产量达到43.7 g/L,较出发菌株提高了63%。研究结果一方面表明通过适应性进化方法可以显著提高S.albulus的低p H耐受能力,另一方面也说明通过增强S.albulus低p H耐受性是提高其合成ε-PL能力的有效途径。

小白链霉菌全细胞转化L-赖氨酸合成ε-聚赖氨酸的体系构建与优化

小白链霉菌(Streptomyces albulus)是天然抗菌肽ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)的主要生产菌株。为了提高小白链霉菌生产ε-PL效率,该文构建并优化了全细胞转化L-赖氨酸合成ε-PL体系:葡萄糖质量浓度80 g/L,菌龄12 h,反应温度30℃,L-赖氨酸质量浓度15 g/L,柠檬酸浓度15 g/L,初始反应p H 4.0,硫酸铵质量浓度6 g/L,湿菌体量为1900 g/L。基于该转化体系,实现小白链霉菌在96 h合成ε-PL产量和底物转化率达到13.80 g/L和38.9%,分别是常规摇瓶发酵的4.1、3.2倍。最后,在小白链霉菌中异源表达来自大肠杆菌的L-赖氨酸特异性通透蛋白基因lysp,获得的重组菌S.albulus OE-lysp实现L-赖氨酸利用能力和底物转化率较出发菌株分别提升26%和33%,ε-PL产量增加至17.21 g/L,约为常规摇瓶发酵ε-PL产量的6.4倍,这是文献报道的最高摇瓶规模ε-PL产量。该研究结果一方面说明了通过全细胞转化L-赖氨酸生产ε-PL的可行性,另一方面为S.albulus转化大宗氨基酸L-赖氨酸生产高值ε-PL奠定了坚实的技术基础,具有重要的理论意义和经济价值。

小白链霉菌中CRISPR-Cas9基因敲除系统的构建与优化

小白链霉菌(Streptomyces albulus)是工业上生产ε-聚赖氨酸的主要菌株。为提高S.albulus的ε-聚赖氨酸合成能力,基于诱变和抗性筛选的传统育种方法被普遍应用。然而,由于传统育种存在“疲劳效应”,当前S.albulus的育种陷入了瓶颈。为利用代谢工程方法进一步提高S.albulus的ε-聚赖氨酸合成能力,亟需建立基于CRISPR-Cas9的基因编辑方法。为此,该文以S.albulus GS114为研究对象,以ε-聚赖氨酸合成酶基因pls为靶基因,构建了CRISPR-Cas9基因敲除系统,成功敲除了pls,编辑效率为100%。为进一步提高获得的敲除株数量,对S.albulus GS114结合转移条件进行了系统优化,获得的最优结合转移条件为:供受体比例1∶1,镁离子浓度30 mmol/L,55℃热激孢子10 min,培养20 h后覆盖抗生素。在最优转移条件下,结合转移效率达到2.5×10^(-8),较优化前提高了78%。该研究结果一方面为后续S.albulus的代谢工程改造提供了重要工具,另一方面为其他工业链霉菌构建CRISPR-Cas系统提供了重要参考。

ε-聚赖氨酸微生物生产及其应用研究进展

ε-聚赖氨酸是一种同聚酰胺生物聚合物,由25~35个L-赖氨酸残基通过α-羧基和ε-氨基缩合形成的酰胺键连接而成。因其独特的结构,ε-聚赖氨酸具有许多优异的性能,如可食性、水溶性、热稳定性、可降解性、广谱抗菌活性和无毒性等。因此,ε-聚赖氨酸已在日本、韩国、美国和中国等国家被广泛用作食品防腐剂。目前,ε-聚赖氨酸主要由白色链霉菌发酵生产。自ε-聚赖氨酸于1977年由日本学者发现以来,ε-聚赖氨酸发酵生产得到了很大提高,对其应用研究也由最初的食品领域拓展到了许多其他的领域。本文首先概述了ε-聚赖氨酸生物合成机理、菌种选育和发酵生产策略,在简要介绍其抑菌机制基础上,着重介绍了ε-聚赖氨酸在食品、医学和材料等领域应用研究进展,最后,对相关研究进行了展望,以期为ε-聚赖氨酸微生物生产及其应用研究提供有益的借鉴。

pH-DO组合调控策略提高小白链霉菌ε-聚赖氨酸的生物合成

ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine, ε-PL)是一种主要由小白链霉菌生产的广谱性天然食品防腐剂,具有广泛的工业应用价值。该研究对ε-PL高产菌Streptomyces albulus WG-608在5 L罐发酵不同阶段的pH与溶解氧(dissolved oxygen, DO)进行了系统优化,并构建了一种新的pH-DO组合调控策略。该策略将发酵分为2个阶段:第一阶段DO被控制在40%,pH维持在4.0;第二阶段DO被控制在20%,pH维持在4.3。经240 h的补料-分批发酵,WG-608的ε-PL产量与平均比生产速率为(68.77±2.53) g/L和(2.33±0.08) d-1,比对照策略分别提高了28.23%和12.02%。为进一步探究该策略提高WG-608 ε-PL产量的细胞生理代谢差异的原因,对不同时期细胞的关键酶活力、呼吸链活力和辅因子水平等进行了分析。结果表明,葡萄糖消耗、中心碳代谢途径、L-赖氨酸生物合成途径、呼吸链活性和胞内辅因子的增强是pH-DO组合调控策略增强ε-PL产量的原因。总之,pH-DO组合调控策略是一种通过增强碳代谢和能量代谢提高ε-PL产量的有效方法。该方法的建立为其他链霉菌发酵生产ε-PL提供了新的思路。

ε-聚赖氨酸生产菌育种研究进展

ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)是一种含25~35个L-赖氨酸残基的新型生物聚合物,由ε-NH2和α-COOH脱水缩合形成。其具有热稳定性、可食性、水溶性、可降解性、抑菌谱广及无毒等优异性能,作为一种安全的食品防腐剂,在日本、韩国、美国、中国和一些其他国家得以应用。ε-PL通常由白色链霉菌(Streptomyces albulus)发酵生产,对生产菌进行育种改造是提高ε-PL生产和降低成本的关键方法之一。目前,研究者们已通过理化诱变、核糖体工程、基因组重排、基因工程等方法对ε-PL生产菌进行了大量育种研究,且得到了一些高产菌株。本文首先简要介绍ε-PL生物合成机理,并从上述几个方面着重介绍ε-PL生产菌育种研究进展,然后概述ε-PL发酵生产工艺,最后对相关研究进行展望,以期为ε-PL微生物育种和绿色生物制造提供借鉴与参考。

小白链霉菌H3分批发酵产ε-聚赖氨酸动力学的构建

为预测和控制小白链霉菌H3发酵产ε-聚赖氨酸的过程,对菌株H3分批发酵过程中的菌体量、ε-聚赖氨酸含量和还原糖含量进行动态检测,并对各参数进行发酵动力学模型进行构建。结果表明,分别使用Logistic方程、Luedeking-Piret方程和Luedeking-Piret-Like方程对发酵过程中菌体生长、ε-聚赖氨酸生成和还原糖消耗进行拟合,3个模型的显著性水平都为0.0001,相关系数R^(2)都在0.9以上,表明得到的拟合模型能预测和描述发酵过程中各参数的变化情况。

GapN诱导型表达小白链霉菌的构建及其对ε-聚赖氨酸生产的影响

目的构建NADP依赖型三磷酸甘油醛脱氢酶(GapN)诱导型表达的小白链霉菌基因工程菌,研究GapN不同表达水平对ε-聚赖氨酸(ε-PL)生产的影响。方法化学合成来自变异链球菌的gapN基因,利用DNA无缝克隆技术构建GapN诱导型表达载体pSET152-Cel-RS2-gapN,再通过接合转移得到GapN诱导型表达的小白链霉菌基因工程菌Q-gapN-Cel;利用实时荧光定量PCR和摇瓶发酵比较等方法研究纤维二糖添加量对gapN基因表达水平、胞内NADPH浓度和ε-PL产量的影响。结果gapN基因的表达水平与纤维二糖的添加量呈正相关;gapN基因的表达能够显著提高胞内NADPH浓度;随着gapN基因表达水平的提高,ε-PL的产量先增加后降低,添加0.03 mM纤维二糖时产量最高,比对照菌株Q-152提高152.6%。结论GapN表达水平对小白链霉菌生产ε-PL有显著影响,通过控制GapN的表达水平能够有效提高小白链霉菌发酵生产ε-PL的能力。

ε-聚赖氨酸高产菌株的选育

依据传统诱变理论和白色链霉菌生物合成ε 聚赖氨酸的特点 ,确立了以枯草芽孢杆菌为敏感菌株 ,抗性突变株筛选和抑菌圈法相结合的初筛方法。在优化诱变条件的基础上 ,以白色链霉菌为出发菌株 ,经紫外线与硫酸二乙酯诱变 ,选育出一株遗传性状稳定 ,遗传标记为AECr+Glyr的ε 聚赖氨酸生产菌株 ,其产量可达 0 79g/L。

新的抗肿瘤抗生素云南霉素 Ⅰ.抗微生物活性及产生菌的生物学

新的抗肿瘤抗生素云南霉素是云谷霉素（谷氏菌素）的水解产物，它具有很强的抗肿瘤活性及很弱的抗微生物活性。云谷霉素产生菌是从云南关坪土壤分离的一株放线菌２３２１菌株。按形态、培养、生理生化等特征及细胞壁化学组分，２３２１菌株非常近似小白链霉菌（ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｌｂｕｌｕｓＲｏｕｔｉｅｎｉｎＲａｏｅｔａｌ，１９５９）定名为小白链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｌｂｕｌｕｓ）２３２１。

一种简便的ε-聚赖氨酸产生菌的筛选方法

目的:建立一种简便、灵敏的ε-聚赖氨酸(-εPL)产生菌的筛选方法。方法:利用产正电分泌物的菌株和美蓝之间的静电作用而形成独特的透明圈,从而灵敏地筛选得到产正电分泌物的菌株;利用Dra-gendorff试剂与生物碱特有的颜色反应,从菌株中筛选,得到3株生物碱产生菌。结果:对产生物碱的菌株发酵液进行-εPL含量分析,确定1株-εPL高产菌Z-18。结论:经鉴定Z-18为白色链霉菌。

高产ε-聚赖氨酸白色链霉菌的复合诱变选育研究

为了进一步提高ε-聚赖氨酸的产量,本实验以白色链霉菌SA为出发菌株,采取紫外照射复合氯化锂(15W,25s,0.5%LiCl)诱变选育及0.025mol/L亚硝酸诱变选育,得到一株具有遗传标记AEC的抗性突变高产菌株UN2-71,在液体摇瓶发酵培养基中,ε-聚赖氨酸产量达到1.64g/L,较出发菌株提高57.7%。

搅拌转速和pH对ε-聚赖氨酸发酵的影响

采用 5L自控式发酵罐研究了ε 聚赖氨酸分批发酵过程中搅拌转速和pH对发酵指标以及菌体细胞形态的影响。提高搅拌速率对菌体生长和ε 聚赖氨酸的合成有显著的促进作用 ;但当搅拌转速达到 4 0 0r min以上时 ,由于剪切力过大导致细胞死亡 ,ε 聚赖氨酸产量下降。当pH维持 5以上 ,有利于菌体生长 ;pH4 0左右可促进ε 聚赖氨酸的合成。搅拌转速 35 0r/min和控制pH4 0时可获得最大的ε 聚赖氨酸产量 2 95g L ,菌体量 9 33g L ;此时产物ε 聚赖氨酸对葡萄糖的得率和对细胞干重的比生成速率分别为 0 0 6 2g g和 0 0 0 6g g·h。通过对比不同发酵条件下菌丝体的形态变化 ,发现当菌丝球比较均匀、形态无较大差别、具有致密程度相当的核心时 ,有利于ε 聚赖氨酸形成。

诱变选育ε-聚赖氨酸产生菌突变株

以白色链霉菌(Streptomyces albulus)SF-21为出发菌株,对其进行微波诱变、硫酸二乙酯诱变和紫外诱变。在诱变过程中经瓶初筛、复筛获得了高产ε-聚赖氨酸的菌株,ε-聚赖氨酸的产量达0.848g/L,比出发菌株提高了41.3%。经5次传代发酵表明该菌株稳定。

大剂量紫外诱变选育ε-聚赖氨酸高产菌

以白色链霉菌Z-18为出发菌株,经大剂量紫外诱变处理,用S-2-氨基乙基-L-半胱氨酸(AEC)氨基酸结构类似物平板定向育种方法,获得1株ε-聚赖氨酸高产菌C-18,其发酵液中ε-聚赖氨酸产量较出发菌株提高42.9%。在含有50 g/L葡萄糖的培养基中,ε-聚赖氨酸积累可达1.23 g/L。

聚-ε-赖氨酸高产菌株的筛选及其发酵工艺的初步研究

利用亚甲基蓝平板初筛、摇瓶复筛,从土壤中筛选了一株聚-ε-赖氨酸(ε-PL)高产菌株,ε-PL摇瓶产量大于2g/L,经初步鉴定该菌株为白色链霉菌(Streptomyces albulus)。对该菌株发酵生产ε-PL的培养基成分进行初步研究表明:葡萄糖是最好的碳源,酵母粉和硫酸铵是最佳的复合氮源,在优化培养基下,ε-PL摇瓶产量达到3.9g/L。

拮抗放线菌MY-4的分离、鉴定及其对果蔬病原菌的抑制作用

【目的】为了鉴定从沙糖橘果实表面分离得到的拮抗放线菌株MY-4,并确定该菌株对果蔬病原菌的拮抗作用,【方法】采用分析MY-4形态学、生理生化特性及16S rDNA序列相似性方法以确定其分类地位,并采用平板对峙培养法和生长速率法测定了其抑菌活性。【结果】结果显示,菌株MY-4为小白链霉菌(Streptomyces albulus Routien),菌株MY-4及其无菌发酵液对供试16种果蔬病原真菌均具有拮抗作用,其中菌株MY-4对香蕉炭疽病菌的拮抗作用最强,平板抑菌带宽度达17.08 mm,无菌发酵液对柑橘绿霉病菌的拮抗作用最强,菌丝生长抑制率高达98.82%,【结论】小白链霉菌菌株MY-4具有活性高、抑菌谱广的特点,有望继续研究开发成新的生防剂。

ε-多聚赖氨酸的研究进展

ε-多聚赖氨酸是目前天然防腐剂中具有优良防腐性能和巨大商业潜力的微生物类食品防腐剂.ε-多聚赖氨酸抑菌谱广,在酸性和微酸性环境中对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母菌、霉菌均有一定的抑菌效果,尤其对其他天然防腐剂不易抑制的革兰氏阴性的大肠杆菌、沙门氏菌抑菌效果非常好.采用小白色链霉菌(Streptomyces albulus) 发酵制得ε-多聚赖氨酸的合成方法是较为理想的. 在发酵生产中,甘油和葡萄糖是最好的碳源,氮源方面,硫酸铵和酵母膏的混合使用更有利于ε-多聚赖氨酸产物的形成,发酵生产的最适温度是25～30℃,产物形成的最佳pH为4.0.