禽4型副黏病毒F基因的克隆及原核表达载体构建

扩增禽4型副黏病毒(Avian paramyxovirus type 4,APMV-4)新疆野鸭源分离株APMV-4/Pintail/CH(XJ)/01/2016的F基因,并构建原核表达载体。参考GenBank上公布的APMV-4序列,通过DNAStar设计F基因特异性引物,以APMV-4/Pintail/CH(XJ)/01/2016基因组RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增F基因编码区,连接于pMD19-T载体,用BamHⅠ和HindⅢ酶切原核表达载体pET-30a重组质粒,将酶切产物克隆至pET-30a多克隆位点上,转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,构建F基因原核表达载体,并对阳性重组质粒进行PCR和测序鉴定。结果显示,扩增出的片段大小为1701 bp,经测序鉴定该扩增片段为F基因全长,与GenBank中收录的APMV-4序列核苷酸相似性为99%;连接表达载体结果表明,原核表达载体pET-30a-F成功构建,为APMV-4诊断方法的建立提供了良好的技术基础。

一株鸡副粘病毒的分子特性研究

应用 RT-PCR技术对新城疫病毒 ( NDV) Y98株的 F基因重要功能区片段扩增后进行序列测定 ,并与多株已报导的 NDV参考株相应片段进行序列比较 ,经遗传基因进化树分析后 ,首次报道了基因

鹅源禽副粘病毒GPMV/QY97-1株的生物学特性

对新近分离到的鹅源禽副粘病毒 GPMV/QY97-1株的生物学特性进行了研究。结果表明 ,该病毒粒子在电镜下呈球形 ,直径 1 2 1～ 2 50 nm,表面有纤突 ,能凝集鸡的红细胞 ,血凝反应能被 I型禽副粘病毒阳性血清所抑制 ,由此初步判定该病毒属于 I型禽副粘病毒。该病毒人工感染 1、1 4、2 8、4 8日龄的鹅 ,发病率均为1 0 0 %,致死率分别为 1 0 0 %、87.5%、62 .5%、1 2 .5%;人工感染 2 5日龄的鸡 ,发病率和致死率均为 1 0 0 %;

鸡副粘病毒病的病毒特性和基因型研究及疫病防制

用 SPF鸡胚分别从不同患病鸡群中分离到 4株病毒 ,经病毒学鉴定 ,该病毒为禽副粘病毒 型 .根据新城疫毒力的国际判定标准测定 ,4株病毒均属于新城疫强毒株 ;人工感染 71周龄 SPF鸡均 1 0 0 %发病致死 ;应用 1株鹅副粘病毒制备的具有对禽副粘病毒 型共同的群特异性单抗和仅对鹅副粘病毒毒株、鸡副粘病毒毒株呈阳性反应 ,而对新城疫 F4 8E8,Lasota等毒株不发生反应的特异性单克隆抗体 ;应用RT-PCR技术对禽副粘病毒 型分离株 F基因的部分片段进行扩增、测序 ,并绘制基因进化树作分析 .结果表明 :鸡副粘病毒株为基因 型 .用 Y98毒株和 T99毒株制备的油乳剂灭活苗经试验和生产应用 。

禽副粘病毒Ⅰ型(APMV-1)分子生物学研究进展

主要介绍了禽副粘病毒 1型两种主要的囊膜糖蛋白基因的特点 ,结合最近出现的几种分类方法 ,描述了两种新近出现的副粘病毒病 ,强调了禽副粘病毒所表现出的新的致病特点 ,为研究禽副粘病毒病的防制方法提供了理论依据。

应用新城疫病毒强弱毒株RTPCR鉴别诊断技术检测多种禽类副黏病毒

应用已建立的新城疫病毒 (NDV)强、弱毒株RT PCR快速鉴别诊断技术 ,对来自广西各地疑为禽副黏病毒血清 1型 (APMV 1)感染的 14 4份不同禽类的病料进行了检测 ,并用常规方法对RT PCR检测为阳性的部分病料进行了病毒的分离和鉴定。结果 ,从鸡、鸽、鹅、鸭、鹌鹑、珍珠鸡、孔雀、鸵鸟和画眉鸟 9种禽的病料样品中检测到APMV 1,阳性检出率为 6 4.5 8% (93/ 14 4 ) ;从 7种禽病料中分离到 2 9株APMV 1地方野毒株。部分分离株用NDV强、弱毒株快速鉴别技术鉴定属中、强毒株。

一株鸡副粘病毒F基因重要片段的扩增、克隆与分析

应用RT_PCR技术对新城疫病毒 (NDV)Y98株的F基因重要功能区片段扩增、克隆后进行序列测定 ,并与多株已报道的NDV参考株相应片段进行序列比较 ,经遗传基因进行化树分析后 。

鹅源禽副粘病毒NA-1株生物学特性的研究

对从吉林省分离的鹅副粘病毒NA-1株应用SPF鸡胚进行传代,通过电镜形态学观察、HA及HI试验、血清学鉴定、毒力鉴定、AGID试验、血凝谱的测定、动物感染试验等一系列研究,发现NA-1株属于禽副粘病毒Ⅰ型,具有新城疫病毒速发型相似的毒力,属于强毒力毒株,遗传进化树分析属于基因Ⅶ新城疫病毒。该病毒对鹅、鸡均具有高致病性。

血清Ⅰ型鸭源副粘病毒HN蛋白基因的遗传变异及原核表达

参考GenBank发表的鹅副粘病毒（GPMV）SF02株基因组核苷酸序列，设计并合成了1对特异性引物，采用RT—PCR技术扩增鸭源血清I型禽副粘病毒DP1／0z株的HN基因，并进行遗传变异及原核表达研究。结果显示，HN基因共1716bp，编码571个氨基酸，存在6个潜在的糖基化位点和13个完全保守的半胱氨酸（C）残基。与GenBank中收录的鹕源副粘病毒HN基因核苷酸和氨基酸的同源性分别为81．3％～98．3％和87．2％～98．4％，系统进化树分析表明DP／02株与鹅源副粘病毒处于同一进化分支。经SDS—PAGE、Western—blot分析，原核表达的HN蛋白相对分子质量在63000左右，1mol／L（终浓度）IPTG时间梯度诱导，3h时HN蛋白表达量最高，占整个菌体蛋白含量的30％，且能与鼠抗鸭源血清I型禽副粘病毒阳性血清反应。

八株禽副粘病毒Ⅰ型的生物学特性和免疫原性

为了解禽副粘病毒Ⅰ型不同毒株的某些生物学特性,测定了分离于三黄鸡、乌骨鸡、孔雀、鹅、鸭等不同宿主的7株禽副粘病毒的血凝特性、血凝解脱时间、鸡胚半数致死量、脑内致病指数、静脉致病指数,并与新城疫病毒强毒株F48E8进行了比较。结果显示,7株禽副粘病毒的毒力除分离自鸭的1株Y01属于弱毒株外,其余6株的毒力均与F48E8相当。为筛选具有优良免疫原性的禽副粘病毒Ⅰ型病毒株,用包括F48E8在内的8株病毒分别制备油乳剂灭活疫苗,免疫40日龄SPF鸡,用21 d后的血清进行交叉血凝抑制试验,用免疫鸡进行交叉攻毒试验。由交叉血凝抑制价计算出的“优势”标准(D)和交叉攻毒保护结果得知,8株禽副粘病毒的免疫原性有很大差异,SHJ00对8株禽副粘病毒的D值均大于、等于1.0,有较高的攻毒保护率,免疫原性最佳;F48E8、SHJ02、E01、KQ02、Y03、Y01依次降低;WG J02对其它7株病毒的D值均小于1.0,攻毒保护率最低,免疫原性最差。这一结果为研制对该病有效的疫苗打下了基础。

鸭源副粘病毒Y03株F基因的克隆及序列分析

从安徽某发病鸭场分离鉴定出1株副粘病毒Y03株,采用RT-PCR法扩增出包括裂解位点在内的部分F基因,对其进行序列测定,并与GenBank中的各基因型代表毒株进行比较。结果表明:所克隆片断长度为385 bp;Y03株F基因的裂解位点序列为112R-R-Q-K-R-F117,并且具有第101位的K(赖氨酸)和121位的V(缬氨酸),为基因Ⅶ型副粘病毒强毒株的特征序列;Y03株与NDV代表毒株间的同源性在80.3%至97.4%,与国内标准强毒F48E9的同源性只有83.6%,差异达到18.1%。

鹅常见病毒性疾病的快速诊断技术的建立及其应用

根据 3种病原基因组相关基因的序列特征设计了三对 PCR引物 ,用于鹅常见的病毒性疾病包括鹅副粘病毒病、鸭瘟、小鹅瘟的鉴别诊断 .三对引物均能从各自的参考毒株扩增出与预计片段大小一致的产物 ,而对其它的病原的扩增结果均为阴性 ;应用建立的 PCR方法对来自广西不同地方的 3 8份临床可疑病例分别进行诊断 ,DPV、APMV-1和 GPV的检测阳性率分别为 66.6% ( 1 0 /1 5 )、5 5 .6% ( 1 5 /2 7)和 75 % ( 6/8) ,二重及三重混合感染的占 42 .8% ( 9/2 1 ) .研究结果表明建立的 PCR方法具有快速、敏感、特异的特点 。

雏番鸭感染禽副黏病毒1型的分离鉴定

从呼吸困难、肠道粘膜出血、胰腺大量白色坏死点为特征的7日龄病死雏番鸭的肝脏中分离到1株病毒。经电镜观察发现该病毒为多形性有囊膜病毒,表面有呈辐射状分布的纤突;血清学鉴定表明,能在4℃下凝集鸡和鸽红细胞,其血凝活性能被NDV标准阳性血清特异性抑制。该病毒对10日龄SPF鸡胚的半数致死量(ELD50)和平均致死时间(MDT)分别为10-8.5/0.1 mL和63.2 h,对番鸭胚成纤维细胞的TC ID50为10-6.32/0.1 mL。经静脉和腿部肌肉两种途径分别接种10日龄雏番鸭和非免疫雏鸡,均可引起发病死亡,并从死亡雏番鸭和雏鸡中可回收到原攻击病毒。依据以上结果表明所分离病毒为中等偏强毒力的禽副黏病毒1型。

鹅Ⅰ型禽副粘病毒GPMV/QY97-1株HN基因的克隆和序列分析

在华南地区进行鹅病病因的调查过程中,从患病鹅群中分离到一株对鹅和鸡都有致病力的病毒,初步判定该病毒属于Ⅰ型禽副粘病毒,命名为GPMV/QY97-1株。以GPMV/QY97-1毒株的基因组RNA为模板,通过RT-PCR方法,扩增出血凝素-神经氨酸酶(HN)基因3′端和5′端的cDNA片段,分别将其克隆至pGEM-TEasy载体中,对其进行序列测定。序列分析表明,HN基因的cDNA全长为2024nt,编码571个氨基酸。序列中含有13个半胱氨酸残基和6个潜在的糖基化位点,其HN基因及编码蛋白结构与新城疫病毒株相符。将GPMV/QY97-1株HN基因序列和推导的氨基酸序列与新城疫病毒株的HN基因相应序列做比较后发现,它们的核苷酸序列同源性分别在89 6%～83 6%,氨基酸序列同源性在93 3%～87 9%。在同源性比较的基础上,进一步绘制了Ⅰ型禽副粘病毒株HN基因的系统发育树。这对于Ⅰ型禽副粘病毒毒力基因的功能分析和该病的分子流行病学调查有着重要意义。

鹅副粘病毒的分类地位初探

对从病鹅体分离的禽副粘病毒 (GPV)YG97株 ,经红细胞凝集 (HA)和红细胞凝集抑制 (HI)试验证明 ,与新城疫病毒 (NDV)存在着极大的相关性。参考NDV的 3个毒力指标———最小致死量致病鸡胚平均死亡时间 (MDT)、1日龄雏鸡脑内接种致病指数 (ICPI)和 6周龄非免疫雏鸡静脉接种致病指数 (IVPI) ,对YG97株进行测定 ,表明其具有与NDV速发型类似的毒力 ,属强毒力的毒株。应用RT PCR技术对F基因重要功能区片段扩增后进行序列测定 ,并与多株已报道的NDV相应片段进行序列比较 ,经遗传进化树分析后 ,初步判定其为禽副粘病毒 Ⅰ型 ,属基因Ⅶ型NDV。

鹅源Ⅰ型禽副粘病毒JG97株F基因的分子特性分析

根据GenBank中鸡新城疫病毒(NDV)基因序列合成了1对引物,通过RT-PCR扩增出了鹅源Ⅰ型禽副粘病毒(AMPV-1)或NDV JG97株的F基因。将扩增片段克隆到pGEM-T载体中,并进行了序列测定。该片段含1个完整的、长1662bp的F基因开放阅读框(ORF),编码的F蛋白长553个氨基酸,其中含有12个半胱氨酸残基和6个潜在的糖基化位点,其裂解位点的氨基酸顺序为112R-R-Q-K-R-F117,与NDV强毒株特征相符。同源性分析表明,JG97株与LZ-NDV、NA-1、SF02、Taiwan95和YG97株的核苷酸和蛋白氨基酸的同源性分别为94.6%～99.6%和96.6%～99.5%,与LaSota株的核苷酸和氨基酸的同源性仅为84.6%和88.8%。结果表明JG97株与LZ-NDV、NA-1、SF02、Taiwan95和YG97等5个毒株的遗传关系较近,而与La Sota株差异较大。

番鸭源禽1型副粘病毒PX2/03株P基因的克隆及原核表达

根据GenBank中水禽源1型副粘病毒(ZJ1)P基因序列设计2对引物,运用RT-PCR技术从1株雏番鸭源禽1型副粘病毒(PX2/03)的基因组中扩增出P全基因的cDNA.测序结果表明,P基因全长1441 nt,包含1个完整的开放阅读框架,编码395个氨基酸.与GenBank中已发表的P基因比对发现,该基因与近年来分离的鹅源禽1型副粘病毒分离株的亲缘关系很近.以分别含BamHⅠ、XhoⅠ的1对引物对该目的基因进行亚克隆后插入到pET32 a原核表达载体中,构建了pETP原核重组载体,将该重组载体转化入BL21(DE3)后,成功诱导表达了分子质量大小约为62 ku的P融合蛋白,经W estern b lotting检测证实表达产物具有免疫活性.

禽I型副粘病毒f基因克隆及序列分析

用RT-PCR一步法对云南省不同禽类(鸡、鸽子)3株禽I型副粘病毒F基因进行扩增和克隆,并对其f基因片段核苷酸序列进行分析,结果表明,云南省禽I型副粘病毒各毒株同源性为88.1%～94.9%,与疫苗株LaSota和强毒株F48E9的同源性为85.6%。所分离两株新城疫病毒在F蛋白裂解位点区(112～117aa)的氨基酸序列与强毒株在这一区域的序列完全相同,表明为强毒株。鸽I型副粘病毒F蛋白裂解位点区的氨基酸序列与PPMV ZQ98-1株在这一区域的序列完全相同,揭示为中强毒株。以1 662bp核苷酸绘制系统发育树,表明云南地方新城疫病毒属于基因Ⅶ型,鸽I型副粘病毒属于基因Ⅵ型。

鹅Ⅰ型禽副粘病毒融合蛋白基因3′端cDNA片段的分子克隆

参考禽副粘病毒的融合蛋白基因 (F基固 )cDNA序列 ,设计并合成了 1对引物 ,以分离到对鹅有致病力的Ⅰ型禽副粘病毒GPMV/QY97 1株的核酸 (RNA)为模板 ,用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)对其融合蛋白基因 3′端进行扩增 ,获得了预计的 884bp左右的片段。将该片段克隆进 pGEM TEasy质粒载体 ,获得重组质粒T GPMVF3′ ,采用限制性内切酶和PCR方法对该重组质粒进行鉴定 ,证明所克隆的片段即为目的基因片段 。

广西猪源禽Ⅰ型副粘病毒的分离与鉴定

【目的】了解广西猪源禽Ⅰ型副粘病毒的流行特征、毒力强弱及基因类型,为今后开展猪源副粘病毒的相关研究提供参考,也为有效防控副粘病毒感染奠定基础。【方法】采集疑似发病猪组织病料,通过鸡胚接种传代分离病毒后,分别进行血凝(HA)与血凝抑制(HI)试验、平均死亡时间(MDT)和脑内接种致死指数(ICPI)测定,然后运用RT-PCR对分离株进行鉴定及扩增部分F基因片段,并对扩增片段进行克隆测序及比对分析。【结果】从广西疑似发病猪组织中分离获得一株猪源禽I型副粘病毒,其HA、HI效价均为26,鸡胚最小致死量为10-8/0.1mL,MDT为60h,ICPI为1.45;分离株F基因112～117位裂解位点的氨基酸组成为R-R-Q-R-R-F,与NDV标准强毒株HER33、F48E9的裂解位点一致;同源性分析结果表明,分离株与标准强毒株F48E9、中等毒力代表毒株BeaudetteC的核苷酸同源性分别为86.5%和85.7%,其推导氨基酸同源性分别为90.1%和90.8%。【结论】猪源禽Ⅰ型副粘病毒分离株为强毒株,属于基因Ⅱ型,是传统型毒株,广西地区禽I型副粘病毒宿主范围呈不断扩大趋势。