BSA联合转录组分析发掘西瓜叶片黄化候选基因

叶片是植物重要的功能器官之一,不仅是植株进行光合作用的主要场所,也可作为重要的形态标记,应用于育种中。叶片颜色作为形态标记,不仅可用于苗期杂种的清除,亦可用于种子纯度的测定。以西瓜全生育期叶片黄化突变体纯合自交系ly104为母本(P_(1))、绿叶自交系w3为父本(P_(2)),通过杂交创制F_(1)代、F_(2)代、BC_(1)代群体。遗传分析结果表明,该突变体的叶片黄化由单隐性基因控制。采用混合分组分析(BSA)进行初定位,通过简化基因组测序(RAD)开发全基因组单核苷酸多态性(SNP)标记构建西瓜高密度遗传图谱,将西瓜叶片黄化基因定位于2号染色体13950306~15517591 bp(大小约为1.57 Mb)。以西瓜97103v2为参考基因组,该区间包含24个注释基因。对P_(1)(P1Y)、P_(2)(P2G)和F 2代群体中黄叶(F2Y)、绿叶(F2G)株系进行转录组水平分析,结果表明,目标区间内基因Cla97C02G035950、Cla97C02G036010、Cla97C02G036020、Cla97C02G036060在黄化叶片与正常绿叶材料中的表达量差异显著,可能是西瓜叶片的黄化候选基因。研究结果可为进一步解析西瓜叶片黄化基因功能和生物学特性奠定重要基础。

基于BSA-seq的大豆棕色荚皮L2基因定位

大豆荚皮的颜色是重要的驯化性状和表型特征,与炸荚习性和躲避捕食关系紧密。大豆荚皮颜色主要由2对等位基因控制,其中棕色荚皮L2基因尚未被鉴定。为了在大豆基因组上对该基因进行鉴定,为大豆棕色荚皮相关基因功能解析和育种应用提供一定的理论基础。以栽培大豆中龙优203(黄色荚皮)和野生大豆FF1235(黑色荚皮)为亲本构建F 2分离群体进行遗传分析。利用F 2群体棕色豆荚和黄色豆荚单株构建混池进行BSA-seq定位分析,并在此基础上进行重组交换单株分析。结果表明,大豆棕色荚皮性状为1对等位基因控制的质量性状。棕色荚皮L2基因关联区域位于3号染色体0~0.75 Mb的区段。进一步开发InDel分子标记进行精细定位,获得具有多态性的InDel引物7对。最终将棕色荚皮位点定位于3号染色体上的Indel-L2-3~Indel-L2-6,物理距离为344 kb。定位区间内共有候选基因32个,其中Glyma.03G005700基因注释为异丙基苹果酸聚合酶,与已发现的黑色荚皮基因L1(Glyma.19G120400)高度同源,其功能为将4-羟基丙酮酸转化为红果酸和番石榴酸,可能是调控大豆棕色荚皮形成的关键基因。

基于文献计量学BSA在作物育种领域的应用现状与展望

为了解国内外集群分离分析法(bulked segregant analysis,BSA)在作物育种领域的研究现状与前沿动态,客观反映各国家、机构及研究人员在该领域的影响力,本文基于文献计量学分析方法使用文献计量分析软件CiteSpace对WOS(Web of Science)数据库2000~2023年2111项和CNKI(China National Knowledge Infrastructure)数据库2003~2023年446项研究成果进行关键词共现分析、突显词分析、关键词聚类分析、聚类时间线分析及作者共被引分析。结果表明:BSA在作物育种领域应用的研究成果在国内外的发文趋势相同,国内外期刊发文量均逐年上升;在发文量国家排序中,中国排名第一、美国第二、印度第三。在CNKI数据库中华中农业大学的发文量最多,而在WOS数据库中中国农业科学院的发文量最多。国外BSA在作物育种领域应用的文章主要集中在植物科学、农学、园艺学和遗传学等学科,而国内主要集中在作物学、植物保护学、园艺学、生物学等学科;Michlmore RW、Kosambi DD和Li H这3位作者在该领域的影响力最高,而Michlmore RW、Lander ES、Li H这3位作者与其他作者有更密切的联系。国内研究的热点作物和性状分别是水稻(Oryza sativa)、大豆(Glycine max)、玉米(Zea mays L.)和抗病性、株高;国外研究的热点作物和性状分别是水稻、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、小麦(Triticum aestivum L.)和抗病性。目前,BSA在国内集中应用于作物目标性状候选基因及作物突变体突变基因的定位和功能验证,而国外则集中应用于作物目标性状基因的精细定位和功能验证及遗传机制的解析。此外,BSA在作物育种领域应用的研究前沿分析表明,未来在该领域热点研究的对象为水稻、花生(Arachis hypogaea L.)、陆地棉(Gossypium hirsutum L.)、作物突变体和作物代谢产物。

BSA-Seq结合RNA-Seq技术挖掘大豆叶片提前黄化衰老基因

大豆产量与其生殖生长的持续时间呈正相关,延缓其开花后叶片的衰老,提高其生理功能,有利于增加植物的粒重。叶片黄化是植物衰老的显著特征之一。关于在大豆鼓粒后期叶片黄化的研究鲜见报道。本研究对鼓粒后期叶片提前黄化突变体ly和野生型ofc杂交组合进行遗传分析,结果表明,大豆鼓粒后期叶片提前黄化性状受单隐性核基因控制。通过BSA-Seq在19号染色体得到一个2.23Mb的初定位区间,经开发标记图位克隆后将区间缩短至1.75 Mb,区间内有219个基因,再结合RNA-Seq分析,得到了区间内12个候选基因,其中有4个SNP变异基因和8个差异表达基因。本研究结果为大豆鼓粒后期叶片黄化衰老基因的克隆奠定了基础。

基于BSA-seq技术定位花生种皮颜色基因

花生种皮颜色是花生重要性状,同时种皮颜色和黄酮类化合物例如花青素的含量有着密切关联。定位与种皮颜色相关的基因对培育和开发新品种,提高花生营养成分有重要作用。本研究以紫色种皮花生‘T371’和粉色种皮花生‘T34’为亲本进行杂交并构建F_2分离群体。基于高通量测序技术,在亲本和分离群体中获得了312.96 G高质量的Clean Reads数据,采用BSA-seq方法定位到1个SNPs和InDels关联区域交集,区间长度为7.61 Mb,位于12号染色体上,区间内有675个基因,其中非同义突变基因14个,移码突变基因3个。根据基因注释结果推测arahy.AFLD8J、arahy.26781N、arahy.YQ76T0、arahy.1KM4NQ、arahy.X3FWT9可能是调控种皮颜色的候选基因。本研究为挖掘花生种皮颜色遗传相关基因和开发新品种提供了一定的理论基础。

基于BSA-seq发掘水稻抽穗期相关QTLs及候选基因

抽穗期作为水稻重要的性状之一,不仅与水稻生育时期密切相关,还与水稻产量、品质和抗逆性密切相关,决定了水稻品种的种植地区和季节适应性,因此,定位水稻抽穗期相关基因在水稻生产中有着重要的作用。利用HQ20和金23B及其杂交构建的F4群体为试验材料,根据群体中水稻抽穗期划分3个等级:抽穗期早、抽穗期适中、大青棵(不抽穗),并构建早、中、青3个混池,采用BSA-seq(bulked-segregant analysis sequencing)方法挖掘水稻抽穗期基因。结果表明,BSA-seq结果与参考基因组比对率在94%以上,4×基因组覆盖率在80%以上;基于此,在置信度为0.95时,经SNP-index算法获得位于4条染色体(6、7、8和9号)的17个SNPs与Indels一致的关联区间,进一步分析区域内的候选基因,发现61个基因存在非同义突变。GO与KEGG富集分析表明,与水稻抽穗期密切相关的途径有UDP-糖基转移酶活性、细胞周期G2/M期转变的正向调控和植物激素信号转导等。结合3K水稻数据库中的单倍型分析与已公布的表达量数据,挖掘出3个抽穗期关键候选基因:LOC_Os07g22720、LOC_Os07g23740、LOC_Os08g07200。以上结果为开展水稻抽穗期性状遗传改良以及遗传基础解析奠定了基础。

基于DNA-BSA重测序和SSR技术的番茄ty-5基因分子标记的筛选

利用DNA-BSA重测序和SSR标记技术对番茄黄化曲叶病毒抗病基因ty-5开展定位研究。DNA-BSA重测序获得7个与番茄ty-5基因相关的侯选区域,分别位于1,4,9号染色体上,总长度为21.68Mb。利用SSR标记获得C_2at4g34700和SSR383标记,与番茄抗黄化曲叶病毒病基因ty-5紧密连锁,并且没有发现重组单株。最后,对DNA-BSA重测序和SSR标记结果联合分析,标记C_2at4g34700和SSR383位于重测序关联分析的1号和9号染色体的抗病关联区域附近。由此初步认定,这2个标记可以作为番茄抗黄化曲叶病毒病ty-5基因的分子标记。

基于BSA-seq和RNA-seq挖掘西瓜果皮硬度候选基因

为了挖掘西瓜果皮硬度关键调控基因,选育耐裂高硬度果皮西瓜品种。以西瓜果皮硬度差异显著的高硬度材料901和低硬度材料BSH为亲本,构建F 2分离群体,采用极端性状混池重测序接合BSA(BSA-seq)方法进行定位,并结合转录组测序(RNA-seq)数据进行关联分析,挖掘果皮硬度关键调控基因。BSA-seq结果表明,SNPs和InDels关联区域交集位于10号染色体1620000—3760000 bp区间内共2.14 Mb的区段,包含150个候选基因,其中2个非同义突变基因和1个移码突变基因。将BSA-seq测序结果与RNA-seq测序结果进行联合分析发现,共有Cla97C10G187120、Cla97C10G187020、Cla97C10G187430、Cla97C10G187510、Cla97C10G187280和Cla97C10G1865406个基因相关联,经生物信息学分析,确定Cla97C10G187120基因为西瓜果皮硬度候选基因。实时荧光定量(qRT-PCR)试验结果表明,转录组试验数据可靠,并且候选基因Cla97C10G187120在901中表达较BSH明显降低。本研究为进一步精细定位西瓜果皮硬度调控基因奠定了基础。

基于BSA-seq技术挖掘番茄耐裂果候选基因

[目的]明确番茄耐裂基因在染色体上的位置。[方法]以耐裂果番茄14FP5和易裂果番茄14FP26为试材,将二者杂交得到F 1代,F 1自交得到F 2,分别构建2个极端性状的DNA混合池,采用BSA-seq方法进行定位。[结果]利用BSA-seq对F 2群体的2个极端混池进行基因组重测序分析,将番茄耐裂基因定位在5号染色体上,位于34140000~38120000 pb,区间大小为3.98 Mb,候选区间内共注释到38个基因,其中非同义突变基因4个。[结论]该研究结果可为番茄耐裂基因的精细定位提供数据支撑,为番茄耐裂分子育种奠定基础。

基于BSA-ELM模型的建筑项目施工成本预测研究

为降低建筑施工项目的管理成本,提出一种基于BSA-ELM的建筑项目施工成本预测模型。首先介绍ELM神经网络算法和BSA算法;其次利用BSA算法的优势对ELM模型进行优化,从而形成一种基于BSA-ELM的预测模型;最后对基于BSA-ELM建筑项目施工成本预测模型进行测试,将其与传统的预测模型进行对比。结果证明,BSA-ELM预测模型的性能更好,预测精度更高。

基于BSA-seq技术对乌拉尔图小麦条锈病抗病基因的初步定位

【目的】发掘和克隆小麦条锈病抗病基因,为小麦条锈病抗病育种提供遗传基因资源。【方法】以乌拉尔图小麦为材料,通过接种鉴定筛选具有条锈病抗性的材料,利用正向遗传学和混合分组测序分析法(BSA-seq)在乌拉尔图小麦材料中鉴定新的条锈病抗病基因位点。【结果】通过接种鉴定筛选到6个具有小麦条锈病抗性的乌拉尔图小麦材料,通过构建杂交群体结合BSA-seq技术在其中1个抗病材料TuW1中鉴定出1个新的条锈病抗病基因位点,定位于7AS染色体的0~35.2 Mb区间。【结论】通过正向遗传学结合BSA-seq技术在乌拉尔图小麦中鉴定到1个新的条锈病抗病基因位点,为小麦条锈病抗病育种提供了基因资源。

基于BSA全基因组重测序的甘蓝型油菜有限花序突变体候选基因的鉴定

油菜是我国第一大油料作物,机械化生产是我国油菜产业发展的必然趋势。油菜无限花序导致花期长和角果成熟不一致,是影响机械化收获的关键因素。因此,开展甘蓝型油菜有限花序性状的基因挖掘对油菜的遗传改良、培育适合油菜机械化收获的新品种、突破油菜机械化生产的瓶颈具有重大意义。本研究以一个自然变异产生的甘蓝型油菜有限花序突变体Y69为研究对象,通过与中双11杂交构建F2分离群体,在群体中挑选有限花序和无限花序的单株各20株构建混合池,对混合池和亲本开展20×和10×覆盖度的全基因组重测序。根据测序结果,分别筛选出277679个SNP和302625个InDel多态性位点,用于有限花序性状的全基因组定位。利用△SNP-in-dex方法关联分析,共筛选到892个多态性标记位点,涉及683个基因,分布于甘蓝型油菜基因组A09、A10和C093条染色体上的6个关联区间,其中C09染色体上的关联区间峰值最高。通过拟南芥基因组同源序列比对,结合基因功能注释以及序列差异分析,候选基因预测位于A09和C09染色体上的关联区间内包含6个候选基因,分别为Bn⁃aA09g34410D、BnaA09g37880D、BnaA09g38520D、BnaC09g40470D、BnaC09g40480D和BnaC09g49710D,其中,Bn⁃aA09g34410D、BnaA09g37880D和BnaC09g49710D根据基因注释参与花发育和开花时间的控制参与花发育和开花时间调控,且位于C09染色体上的3个基因存在等位变异,推测为控制该有限花序性状变异的关键基因,本研究结果为油菜有限花序后续的基因克隆和功能验证奠定了基础。

利用BSA-Seq技术初步鉴定棉花芽黄候选基因

芽黄性状可作为棉花育种的标记性状,在棉花杂交选育中可减轻棉花杂交制种和鉴定过程,还可以作为叶绿素等生理代谢研究的理想材料。研究棉花芽黄突变体具有重要的理论和实践意义。本研究以芽黄突变体115-23与绿叶正常材料JSH1527为亲本,构建F2分离群体,鉴定后代芽黄性状,选择30个芽黄单株和30个正常绿叶单株构建混合池,对4个样本(2个亲本池和2个混合池)开展全基因组重测序,采用SNP-index进行关联分析,确定芽黄基因的候选区域,筛选芽黄候选基因。结果表明,在2个亲本之间共获得840,612个多态性SNP,利用Δ(SNP-index)方法,在95%的置信区间内将候选区域定位到染色体D02区间,包含93个候选基因,其中4个基因功能注释与叶绿体合成等相关,可能是调控棉花叶色的候选基因。研究结果可为棉花芽黄分子机制及芽黄相关基因的克隆奠定理论基础。

基于BSA-seq技术对豌豆花色基因的精细定位

BSA-seq技术在挖掘农艺性状相关的新基因中已被广泛应用,随着豌豆首个参考基因组问世,将BSA-seq技术结合豌豆基因组的基因定位策略势在必行。本研究利用紫花亲本G0004562、白花亲本G0002930以及F2群体,通过BSA-seq技术对豌豆花色基因进行初步定位,获得31.42Mb定位区间,再通过设计InDel分子标记分析进一步缩小定位区间,最终将目标基因定位在包含19个基因的0.99 Mb区间内,通过基因注释信息推测出Psat6g060480.1为豌豆花色候选基因。本研究结果验证了BSA-seq技术快速高效定位豌豆花色基因的可行性,为利用该技术挖掘豌豆其他重要农艺性状相关基因奠定了基础。

热处理对等离子喷涂BSAS环境障涂层性能影响

采用自制的固相烧结BSAS粉体,利用大气等离子喷涂工艺在SiC基体表面制备Si/Mullite+BSAS/BSAS三层结构环境障涂层。通过扫描电子显微镜、能谱仪和X射线衍射分析仪等研究环境障涂层在不同热处理温度下涂层的相结构、显微组织演变规律。结果表明:喷涂态BSAS涂层主要由单斜结构BAS相和非晶相组成;经过1100℃热处理后,涂层内部非晶相转变为六方结构BAS相;1200℃热处理后六方结构BAS相逐渐向单斜结构BAS相转变,在1300℃热处理后单斜结构BAS相的含量达到最大;随着热处理温度的进一步上升,出现鳞石英结构的SiO_(2)相和高钡含量的Ba3SiO5相以及副钡长石结构BAS相,1400℃热处理过程中发现硅液滴渗出的现象。

基于BSA-seq结合连锁分析发掘大豆荚粒性状QTLs及候选基因

豆荚和籽粒是大豆重要的产量形成器官,同时,荚粒性状作为大豆重要外观品质,还直接影响其商品性。鉴于此,基于大豆重组自交系群体(recombinant inbred line,RIL)在多种环境条件下的荚粒性状(荚长、荚宽、荚重、粒长、粒宽和粒重),筛选极端家系构建2个混池——大荚大粒池(large pool,LP)和小荚小粒池(small pool,SP);经混合群体分离测序(bulked segregant analysis sequencing,BSA-seq)寻找控制荚粒性状的遗传位点,同时结合前期该群体连锁定位QTLs以及RIL亲本荚粒转录组数据,发掘多环境、多方法、多性状共定位区间以及候选基因。结果表明,构建的LP与SP混池在不同环境下的荚粒性状存在显著差异,BSA-seq结果与Williams82参考基因组的平均比对效率在98%以上,10×基因组覆盖率在94%以上;基于此,在置信度0.95时,经SNP-index、Euclidean distance(ED)和G-statistic算法分别获得27、41和51个关联区域,在置信度0.99时,分别获得5、15和16个关联区域,位于11条染色体(1、3、4、6、7、12、13、15、17、19和20号);经与前期连锁定位QTLs比较发现,在7、19和20号染色体上存在多环境、多方法、多性状共定位遗传位点,且20号染色体SNP标记ss715637629及19号染色体SNP标记ss715635705、ss715635755、ss715635844等在连锁定位与BSA-seq同时被检测到;进一步分析3种BSA-seq算法共关联区域内的候选基因,发现40个基因存在外显子非同义突变,其中15个基因在RIL群体亲本C813和KN7豆荚和籽粒表达量较高,并有3个基因随豆荚发育进程表达量增加。以上结果为开展大豆荚粒性状分子遗传改良以及遗传基础解析奠定了重要基础。

基于BSA-seq和RNA-seq挖掘水稻株高相关QTL

株高是影响水稻产量稳定性的重要因素之一,水稻株高相关QTL的定位及候选基因的挖掘,有助于深入了解株高分子调控机制,进而为培育理想株型的水稻品种奠定基础。以油占8号及广西野生稻为亲本构建的285个CSSL群体为试验对象,结合NGS与BSA-seq等方法,利用SNP和InDel两种分子标记进行关联分析,对可能与株高相关的基因组区段进行定位。结果显示,Δ(SNP-index)分子标记在Chr.7和Chr.10中分别关联到3.205和1.311 Mb大小的候选基因组区域。Δ(InDel-index)标记关联到的基因组区域大小分别为2.848和1.292 Mb,且全部包含于Δ(SNP-index)关联到的区间内。结合GO、KEGG、Uniprot、eggNOG等数据库中的功能注释、高质量多态性位点筛选以及已有的株高相关转录组数据,最终关联到Chr.7中的5个候选基因,包括功能和机理已知的OsTCP21。RT-qPCR结果显示,OsTCP21在高株和矮株中的表达差异与已有研究结果相一致,LOC_Os07g05050和LOC_Os07g02850在高株中表达量较高,LOC_Os07g04220和LOC_Os07g02770在矮株中表达量较高。这5个候选基因在水稻株高性状的调控中起重要的作用,OsTCP21是一个关键调控基因。

基于BSA-seq技术的马铃薯块茎蛋白含量基因定位与分子标记开发

【目的】开发与四倍体马铃薯蛋白含量相关的分子标记,加快选育高蛋白的马铃薯品种,提高马铃薯品种竞争力。【方法】以高蛋白马铃薯品种‘大西洋’为母本、低蛋白品种‘定薯1号’为父本构建分离群体,利用混池和高通量简化基因组测序技术相结合的方法(BSA-seq)对马铃薯块茎蛋白含量进行QTL定位,在定位区间开发与马铃薯块茎蛋白含量紧密连锁的SSR标记,并使用分离群体及四倍体马铃薯品种进行筛选验证。【结果】在2号、4号染色体共定位到3个控制马铃薯块茎蛋白含量的主效位点,分别位于2号染色体18.88~21.59 Mb,区间大小为2.71 Mb;4号染色体8.3~12.84 Mb,区间大小为4.54 Mb;4号染色体65.12~66.39 Mb,区间大小为1.27 Mb。根据定位区域、基因位置及参考基因组信息,使用NR、 Tr EMBL、 KEGG、 GO、 KOG、 swissprot、 PFAM共7个功能数据库对候选基因进行功能注释,共注释到719个候选基因,注释基因显著富集在玉米素合成代谢通路,该代谢通路可阻止蛋白质降解。在2号染色体18.88~21.59 Mb区间内开发分子标记pChr2-4。用分离群体、四倍体马铃薯品种结合田间表型对pChr2-4的准确性进行鉴定,结果显示,pChr2-4在离群体、四倍体马铃薯品种中的准确性分别为73.17%和81.82%,准确度较高。【结论】通过BSA混池测序,检测到3个与马铃薯块茎蛋白含量相关的区间。在2号染色体开发与马铃薯块茎蛋白含量紧密连锁的标记pChr2-4,该标记有助于马铃薯块茎蛋白含量分子标记辅助育种。

基于BSA分析技术对陆地棉抗旱基因的鉴定

【目的】研究抗旱相关的候选基因,为棉花抗旱性鉴定与评价和抗旱基因的挖掘提供理论依据。【方法】以陆地棉石远321和奎85-174为亲本构建重组自交系中选取的20份极端抗旱和旱敏感材料,将筛选的极端材料分别构建极端抗旱池、极端敏旱池,与亲本进行BSA测序分析,以陆地棉基因组为参考,通过BSA测序分析,挖掘抗旱相关的候选基因。【结果】关联到3个相关的候选区域,候选区域的总长度为6.12 Mb,其中共包含86个基因。结合GO注释、KEGG通路和前期筛选出的5个关键指标,共筛选出5个候选基因。【结论】5个基因在叶片中的表达量显著高于根和茎,并且在抗旱性强材料中的表达量均高于抗旱性弱的材料,且总体呈先上升后下降的趋势。

基于极端混合池(BSA)全基因组重测序的羽衣甘蓝白色叶基因定位

筛选羽衣甘蓝白色叶形成相关的关键基因和位点以及心叶颜色性状的遗传规律,以羽衣甘蓝红叶亲本WR、白叶亲本WB及其构建的F2分离群体为试验材料,从F2群体中挑选红叶和白叶植株各20株,分别构建2个DNA混合池,对子代混合池和亲本分别开展50×和20×覆盖深度的全基因组重测序,定位白叶性状关联区间,并根据基因注释信息预测候选基因。结果表明,重测序获得3 987 718个单核酸多态性(SNP)标记,获得位于第2、3和9染色体的8个显著关联区间,根据基因注释和功能分析,筛选到8个候选基因(Bol030253、Bol029431、Bol012077、Bol007709、Bol030318、Bol030235、Bol030286和Bol005195)。将8个基因确定为羽衣甘蓝白叶的候选基因,可能在羽衣甘蓝叶片颜色形成过程中起着重要作用。