气道上皮功能障碍在哮喘发病机制中的作用

哮喘是一种慢性炎症性气道疾病,以气道高反应性和气道重塑为特征。气道上皮在哮喘的发病机制中处于核心地位,其物理屏障、黏液纤毛清除、免疫调节等多种功能直接参与气道炎症反应,进而影响哮喘的发生、发展。本文综述哮喘中的气道上皮功能障碍及其潜在机制,这可能为哮喘提供新的治疗靶点。

人支气管上皮癌变各阶段组织蛋白质双向电泳图谱的差异分析

目的 :探讨肺鳞癌癌前病变恶性转化的机制。方法 :应用脱氧胆酸 三氯醋酸 (deoxycholate trichloroaeticacid ,DOC TCA)法提纯支气管上皮癌变各阶段组织总蛋白质 ,采用固相pH梯度 (immobilizedpHgradient,IPG)双向凝胶电泳 (two dimensionalelectrophoresis ,2 DE)分离总蛋白质 ,凝胶经银染显色后 ,ImageMaster 2D图像分析软件进行比较分析、识别差异表达的蛋白质 ,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (matrix assistedlaserdesorption/ionizationtime of flightmassspectrometry ,MALDI TOF MS)得到相应的肽质指纹图谱 (peptidemassfingerprint,PMF) ,然后搜索数据库鉴定部分差异蛋白质点。结果 :①重复性检测表明同一例鳞状上皮化生组织的三块凝胶的平均点数为 12 16± 75,平均匹配点数为 10 82± 6 7,匹配率达 89.3% ,且 3块胶在蛋白质点位置上有较好的重复性 ,不同胶间蛋白质点在IEF方向的偏差是 (0 .86 5± 0 .2 4 7)mm ,在SDS PAGE方向上的偏差为 (0 .971± 0 .10 4 )mm ,由此获得了分辨率较高、重复性较好的人支气管上皮癌变各阶段组织的双向凝胶电泳图谱 ,正常上皮、鳞状化生、不典型增生和上皮浸润癌组织凝胶的平均蛋白质点数依次为 1190± 36、12 2 7± 39、12 72± 4 1、132 6± 5 2 ;?

氟尿嘧啶诱发人支气管损伤修复过程及支气管干细胞的定位

目的 观察离体人支气管损伤修复过程 ,进行支气管干细胞的定位。方法 取肺癌手术切除的人支气管的正常部分进行组织培养 ,应用氟尿嘧啶 (5 FU)诱发支气管上皮损伤 ,动态观察修复过程 ,用免疫组化SP法检测PCNA ,β1 整合素及CK 19的表达 ,同时进行Hoechst33342荧光染色。结果 1. 5 FU作用 12h后人支气管上皮细胞绝大部分脱落 ,可见少量间隔分布的类似裸核的细胞呈钉状位于基底膜上 ,PCNA染色阴性 ,证明为G0 期细胞。其中部分细胞Hoechst33342染色阴性。 2 .将 5 FU去除 3～ 6h后 ,细胞形态变为扁平 ,PCNA染色见核染色阳性的细胞与阴性细胞 (G0期细胞 )间隔分布 ;12h后细胞变为立方 ,细胞数目逐渐增多 ,到 4 8～ 72h恢复假复层柱状上皮。 3.β1 整合素及CK 19在已分化细胞中呈阳性反应。结论 在 5 FU的打击下 ,进入增殖期细胞死亡、脱落 ,仅余G0 期细胞 ,其中含有支气管干细胞。正是这些干细胞增殖分化使支气管上皮修复。

人支气管上皮组织癌变各阶段2-DE图谱及差异分析

背景与目的:支气管上皮细胞的癌变是一个多基因参与、多阶段的复杂过程,但癌变机理仍不清楚,应用蛋白质组学技术研究此过程有可能识别癌变相关蛋白质,对揭示肺鳞癌癌变机制具有重要的意义。本研究的目的是优化支气管上皮组织的蛋白质样品制备方法,建立人支气管上皮癌变各阶段组织的2-DE图谱并进行差异分析,为鉴定肺鳞癌癌变相关蛋白质奠定基础。方法:收集、筛选人支气管正常上皮、鳞状上皮化生、不典型增生和上皮浸润癌组织标本。改良的脱氧胆酸-三氯醋酸(deoxycholate-trichloroaeticacid,DOC-TCA)法提纯支气管上皮总蛋白质,应用固相pH梯度双向凝胶电泳分离各阶段组织的总蛋白质,凝胶经银染显色后,用ImageMaster2D软件分析图谱,比较差异表达蛋白质。应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtime-of-flightmassspectrometry,MALDI-TOF-MS)得到相应的肽质指纹图谱(peptidemassfingerprint,PMF),然后搜索数据库鉴定部分差异蛋白质。结果:应用改良的DOC-TCA法提纯总蛋白质进行双向电泳,获得了分辨率高、重复性好的人支气管上皮组织的双向电泳图谱,支气管正常上皮、鳞状上皮化生、不典型增生和上皮浸润癌组织凝胶的平均蛋白质点数依次为1189.50±39.89、1227.

25羟维生素D_3对正常气道上皮细胞通透性的影响及可能机制

目的探讨25羟维生素D3对人正常气道上皮细胞通透性及ZO-1表达的影响。方法选取正常人支气管上皮细胞系16HBE为研究对象,MTT法分别检测不同浓度25羟维生素D3对细胞活力的影响;实验分组为:对照组,不同浓度25羟维生素D3处理组。各处理因素作用细胞总时间为24h。跨上皮电阻测量仪测量标准化单细胞层跨上皮电阻(TER),比较各组TER差别。进一步用实时定量PCR观测各处理组紧密连接蛋白ZO-1mRNA表达的变化。结果与对照组相比,25羟维生素D3处理组TER(P<0.05)显著增高,但各浓度的25羟维生素D3对ZO-1表达无明显影响(P>0.05)。结论 25羟维生素D3可以使气道上皮通透性减低,但这种效应并非通过上调气道上皮ZO-1表达实现的。

人非小细胞肺癌细胞膜钾离子通道特性的研究

目的 研究人非小细胞肺癌细胞膜钾离子通道特性。方法 采用原代培养的非小细胞肺癌细胞、肺部良性病变和癌旁支气管上皮细胞 ,应用膜片钳全细胞记录方式检测细胞膜钾离子通道特性。结果 ( 1)非小细胞肺癌细胞膜K+ 通道表达的K+ 电流具有电压依赖性 ,能被K+ 通道阻断剂TEA阻断。鳞癌细胞膜电流具有失活趋势和内向整流特点 ;腺癌细胞膜电流具有不失活特性 ,无内向整流特点。TP =5 0～ 90mV时 ,时间常数 (τ值 )为 3.6～ 9.8ms。非小细胞肺癌细胞膜电容为 ( 15 .35± 0 .65 )pF ,K+ 电流密度为 ( 12 1.0 8±8.35 )A/F。 ( 2 )非小细胞肺癌细胞膜K+ 电流幅度、电流密度和膜电容较支气管上皮细胞明显增高 (P <0 .0 0 1) ,癌细胞τ值显著小于支气管上皮细胞的τ值 (P <0 .0 0 1)。结论 ( 1)非小细胞肺癌细胞膜存在与延迟整流性类似的钾离子通道 ,且表达明显增加 ,活动明显增强。 ( 2 )检测肺癌细胞膜K+ 通道可为研究肺癌发生、发展。

宣威烟煤粉尘诱发树鼩支气管粘膜上皮改变的研究

背景与目的肺癌在许多国家和地区已成为发病率和死亡率最高的恶性肿瘤,建立科学合适的肺癌动物模型,用以模拟出与人类肺癌的病因、发病机制、发展过程相似的动物模型是亟待解决的问题。通过宣威烟煤粉尘PM10(particulate matter with diameters of 10μm or less,PM10)对树鼩支气管上皮的影响,探索建立宣威烟煤粉尘致肺癌模型的可行性。方法健康成年树鼩,切开颈部皮肤,充分暴露甲状软骨,于甲状软骨上方薄弱处,采用特制灌注针行穿刺的方法进行气管内试剂灌注。定期行X线检查,观察肺部影像学改变,处死动物行肺组织病理检查,观察灌注后支气管上皮改变情况。结果烟尘处理组树鼩灌注药物后1周内开始死亡,空白对照组、溶剂对照组树鼩灌注后至实验结束无异常死亡。定期处死树鼩行肺组织HE染色切片病理检查,空白对照组及溶剂对照组无明显病理改变,烟尘处理组树鼩肺组织可见支气管粘膜上皮过度增生-鳞状化生-不典型增生-早期浸润癌的病理变化过程。结论宣威烟煤粉尘可以导致树鼩支气管上皮出现支气管粘膜上皮过度增生-鳞状化生-不典型增生-早期浸润癌的病理变化,应用宣威烟煤粉尘PM10行气管内灌注可以诱发树鼩肺癌。可以建立肺癌模型。

人支气管上皮细胞恶性转化中凋亡敏感性及bcl-2的变化

目的：揭示细胞凋亡敏感性在人癌细胞体外恶性转化动态过程中的变化。方法：用已获部分恶 性的ＳＶ４０Ｔ转染的人支气管上皮细胞系Ｍ为材料，通过凋亡ＴＤＴ原位标记、染色体ＦＩＳＨ、ＲＮＡ及蛋白检测等技 术，研究同一株细胞恶性转化过程中凋亡及ｂｃｌ－２、Ｐ５３基因的变化。结果：恶性转化的Ｍ后代细胞较未转化的 Ｍ前代细胞对顺铂诱发细胞凋亡现象不敏感；ｂｃｌ－２基因的转录和表达在Ｍ后代细胞明显高于Ｍ前代细胞，而 且在皿细胞恶性转化进程中呈积累现象；Ｐ５３蛋白在Ｍ前、后代细胞均表达。结论：ｂｃｌ－２过表达使细胞对凋亡 敏感性下降在人支气管上皮细胞恶性转化中起重要作用；Ｐ５３蛋白的灭活不是此ＳＶ４０Ｔ转染细胞恶性转化进程 中ｂｃｌ－２表达积累的主要原因。

吸入重组人表皮生长因子对大鼠哮喘模型影响

目的观察吸入重组人表皮生长因子是否可以促进哮喘时损伤上皮的修复,并对气道炎症和气道重塑产生影响。方法应用卵蛋白致敏和激发的方法制作SD大鼠慢性哮喘模型。采用病理学和免疫组织化学等方法比较吸入重组人表皮生长因子(rhEGF)组和吸入布地奈得(BUD)组与哮喘模型组在哮喘样症状、BALF中细胞数、肺病理形态学、气道周围浸润的嗜酸细胞数、上皮下纤维连接蛋白(FN)沉积以及支气管上皮增殖指标BrdU、炎性因子ICAM_l、RANTES和生长因子EGF、TGF_βl表达的不同。结果与模型组相比,rhEGF组哮喘样症状评分下降、BALF中炎性细胞和上皮细胞数目减少,气道周围浸润的嗜酸细胞数减少,上皮下FN沉积减少,上皮表达BrdU的阳性细胞数增加,上皮ICAM_l、RANTES和TGF_βl的表达下调,上皮EGF表达上调。与模型组相比,BUD组支气管上皮BrdU、EGF和TGF_βl的表达差异无显著性。结论吸入rhEGF能促进损伤上皮的修复和增殖,恢复上皮形态和结构的完整性,对哮喘的气道炎症和气道重塑有部分抑制作用。

罗丹明123及P-糖蛋白在人支气管损伤修复过程中的表达(英文)

目的研究离体人支气管上皮经氟尿嘧啶(5-FU)损伤前后及修复过程中罗丹明123(Rh123)的染色及P-糖蛋白的表达情况。方法取5-FU作用前后及修复3、6、24h的人支气管上皮,进行如下实验:采用酶消化法获取细胞悬液,Rh123染色,流式细胞仪分析;用免疫荧光及蛋白印迹法观察P-糖蛋白的表达,RT-PCR法检测P-糖蛋白mRNA的表达。结果5-FU作用后支气管上皮中Rh123阴性染色细胞占活细胞的比例较正常组增多;随着损伤的修复,Rh123阴性活细胞所占比例逐渐降至接近正常。免疫荧光法可见5-FU作用后的上皮细胞涂片上有P-糖蛋白的表达,在蛋白及mRNA水平,5-FU作用后支气管上皮的P-糖蛋白表达均较正常组增加。结论5-FU作用后,Rh123染色阴性、表达P-糖蛋白的支气管干细胞占残留活细胞的比例增多,由它们完成损伤的修复。

环磷酰胺及塞替派诱导人支气管上皮细胞恶性转化的超微结构

为了解抗癌化疗药环磷酰胺 (CP)及塞替派(TE)诱导的永生化人支气管上皮细胞恶性转化过程中的细胞超微结构的动态变化 ,采用透射电镜方法观察的细胞模型由对照永生化人支气管上皮细胞(BEAS- 2 B) ,受环磷酰胺 (BEAS- CP)和塞替派(BEAS- TE)诱导的恶性转化细胞组成 .发现经 CP和 TE暴露的细胞可出现细胞死亡 ,凋亡和转化 ,它们具有各自的超微结构特征 .说明逃逸细胞死亡 ,凋亡的支气管上皮基细胞呈增生性改变 。

人支气管上皮损伤修复过程中Rhodamine 123染色的动态观察

目的探讨离体人支气管上皮经5-氟尿嘧啶(5-FU)损伤前后及修复过程中支气管上皮细胞Rhodamine 123的染色情况。方法分别取5-FU作用前后及修复3、62、4 h的人支气管上皮,蛋白酶消化法获取细胞悬液,进行流式细胞仪分析:1.应用PI染色,确定细胞周期中各期细胞所占百分数;2.Rhodamine 123染色,计算Rhodamine 123阴性细胞占活细胞的比例。结果1.5-FU处理后支气管上皮细胞中凋亡细胞增多,增殖期(S+G2/M期)细胞明显减少,剩余细胞绝大部分处于细胞周期的静止(G0/G1)期;随支气管上皮的恢复,S+G2/M期细胞增多;2.5-FU作用后支气管上皮中Rhodamine 123阴性细胞占活细胞的比例较正常组增多;随着损伤的修复,Rhodamine 123阴性活细胞所占比例逐渐降至接近正常。结论5-FU的作用使增殖期细胞凋亡、脱落,残留静止期细胞,其中包含具有Rhodamine 123排出能力的干细胞,由它们完成损伤的修复。应用Rhodamine 123染色,经流式细胞仪分选5-FU作用后残留的细胞,可用于富集纯化支气管干细胞。

维胺酸对体外转化人支气管上皮细胞及体内构建人支气管上皮组织的抑制作用

癌前改变是肿瘤演变过程中的关键阶段。许多研究显示维甲类化合物对动物肿瘤及体外恶性细胞系具有抑制作用,但尚未见其对肺癌前病变作用的实验室研究报道。人类肺癌的绝大部分起源于支气管上皮,为研究维胺酸对体外转化人支气管上皮M细胞系以及在大鼠气管构建后移植到裸鼠体内生长的具有癌前病变特点的人支气管上皮组织的抑制作用,采用上皮细胞无血清培养技术,人支气管上皮组织大鼠气管内构建/裸鼠皮下移植生长技术,流式细胞学分析,免疫组化、凋亡细胞原位末端标记以及病理学检查等研究方法发现,维胺酸可抑制体外培养的转化人支气管上皮细胞的增殖,使S期细胞比例下降,以及细胞增殖标志Ki-67、mpm-2阳性反应细胞比例下降;明显诱导细胞凋亡。裸鼠腹腔注射给予维胺酸也可使大鼠气管内构建后移植到裸鼠体内生长的癌前期人支气管上皮组织的生长率明显降低,病变程度明显减轻;同样可以诱导细胞凋亡。研究结果提示,维胺酸对体外培养的转化人支气管上皮细胞系及大鼠气管构建/裸鼠体内移植生长的人支气管上皮组织均有明显的抑制作用,是有希望的肺癌化学预防药物。

不同处理因素对呼吸道合胞病毒感染人支气管上皮细胞表达血管内皮生长因子的影响

目的探讨不同处理因素对呼吸道合胞病毒(RSV)感染原代培养的人支气管上皮细胞(NHBE)表达血管内皮细胞生长因子(VEGF)的影响。方法通过荧光定量PCR、ELISA检测不同处理因素对RSV感染NHBE VEGF表达的影响。结果 RSV感染NHBE后,NHBE对VEGF的表达明显增加,呈明显的时间依赖性和浓度依赖性,地塞米松可以显著抑制RSV感染NHBE细胞的VEGF表达,与RSV感染组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。25羟基维生素D3单独作用可以刺激NHBE细胞表达VEGF,但可以抑制RSV感染NHBE的VEGF表达,与RSV组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 RSV增加了NHBE对VEGF的表达,地塞米松和25羟基维生素D3可以减弱这种效应。

PM2.5对支气管上皮细胞色素上皮衍生因子表达的影响

目的探索不同浓度PM2.5对支气管上皮细胞(BEAS-2B)色素上皮衍生因子(PEDF)蛋白表达的影响。方法 BEAS-2B细胞传代培养,加入低、中、高浓度PM2.5悬液(25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml)刺激24 h。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养上清液中PEDF水平;Western blotting检测BEAS-2B细胞中PEDF蛋白表达水平。结果与对照组相比,PM2.5浓度为25μg/ml时,细胞内和上清液中PEDF蛋白水平均有增加趋势,但无统计学意义(t=-0.730,t=-1.840,P>0.05);PM2.5浓度为50μg/ml和100μg/ml时,细胞内和上清液中PEDF蛋白表达水平明显增高(t>5.798,P<0.01)。结论中、高浓度PM2.5能够增加支气管上皮细胞中PEDF蛋白水平,并呈浓度依赖性。

人支气管上皮蛋白质样品制备方法及其癌变各阶段组织2-DE图谱的建立

目的 :改良、优化支气管上皮组织的蛋白质样品制备方法 ,建立人支气管上皮癌变过程各阶段组织的2 DE图谱 ,为识别鉴定肺鳞癌癌变相关蛋白质奠定基础。方法 :收集、筛选人支气管正常上皮、鳞状化生、不典型增生和上皮浸润癌组织标本。改良的脱氧胆酸 三氯醋酸 (deoxycholate trichloroaeticacid ,DOC TCA)法提纯支气管上皮总蛋白质 ,应用固相 pH梯度双向凝胶电泳分离各阶段组织的总蛋白质 ,凝胶经银染显色后 ,用ImageMaster 2D软件分析双向电泳图谱。结果 :应用改良的DOC TCA法提纯的支气管上皮总蛋白质进行双向电泳 ,可获得分辨率高、重复性好的人支气管上皮组织的双向电泳图谱。正常上皮、鳞状化生、不典型增生和浸润癌 4种组织凝胶的蛋白质点数依次为 1 1 90± 6 3,1 2 2 7± 6 9,1 2 72± 71 ,1 32 6± 82。选取同例鳞状上皮化生组织进行 3次重复性检测 ,3块凝胶的平均蛋白质点数为 1 2 1 6± 75 ,平均匹配点数为 1 0 82± 6 7,匹配率达 89.3% ,且 3块胶在蛋白质点位置上有较好的重复性 ,不同胶间蛋白质点在IEF方向的偏差为 (0 .835± 0 .2 4 7)mm ,在SDS PAGE方向上的偏差为 (0 .92 1± 0 .1 0 4 )mm。结论 :改良的DOC TCA沉淀法是一种较好的支气管上皮组织蛋白质样品制备法 。

5-氟尿嘧啶诱发人支气管上皮损伤前后P糖蛋白表达的研究

目的:研究离体人支气管上皮经5-氟尿嘧啶(5-FU)损伤前后P糖蛋白(P-gp)的表达。方法:5-FU造成离体人支气管环严重损伤,分别取正常组及5-FU作用后的支气管上皮,应用流式细胞仪和蛋白印迹法检测P-gp的表达;RT-PCR法检测其mRNA的表达。结果:5-FU作用后支气管上皮细胞中P-gp阳性细胞所占比例较正常组增高,在蛋白及mRNA水平,5-FU作用后支气管上皮P-gp的表达均较正常组增加。结论:5-FU作用后,表达P-gp的支气管干细胞占残留活细胞的比例增多,由它们完成损伤的修复。

新生期小鼠肺炎链球菌肺炎对气道上皮损伤的影响

目的探讨新生期肺炎链球菌肺炎(S.pp)对气道上皮损伤的影响。方法生后7 d的C57BL/6小鼠鼻腔内滴注2×10^5 cfu肺炎链球菌(5μl)建立S.pp模型,对照组滴注等量磷酸盐缓冲液。感染5周后检测两组小鼠的气道高反应性,收集小鼠肺组织,利用实时荧光定量PCR检测CDH1、TJP1 mRNA水平;免疫组织化学、Western blotting检测气道上皮E钙黏蛋白(E-cadherin)、紧密连接蛋白(ZO-1)水平。Masson染色检测小鼠气道上皮下胶原蛋白沉积水平,ABPAS染色检测小鼠气道杯状细胞数量,HE染色检测小鼠肺组织的炎症改变情况。结果小鼠雾化吸入乙酰甲胆碱浓度为6.25~50 mg/ml时,S.pp组小鼠的气道高反应性明显高于对照组(P<0.001)。S.pp组小鼠肺组织CDH1、TJP1 mRNA水平明显低于对照组(分别为0.85±0.29 vs.1.42±0.40,P=0.033;0.43±0.16 vs.0.83±0.26,P=0.010),气道上皮细胞E-cadherin、ZO-1的表达水平明显低于对照组(分别为9.66±4.89 vs.24.52±7.58,P=0.001;13.54±3.79 vs.25.53±5.99,P=0.005),肺组织E-cadherin、ZO-1蛋白水平明显低于对照组(分别为0.23±0.06 vs.0.38±0.06,P=0.019;0.68±0.12 vs.0.96±0.16,P=0.032),上皮下胶原蛋白沉积与对照组比较明显增加(45.54±5.79 vs.26.3±5.53,P=0.001)。两组气道杯状细胞数量及肺组织炎症评分差异无统计学意义。结论S.pp可诱导小鼠气道上皮损伤,参与形成气道高反应性。

感觉神经肽与支气管对肺动脉缺氧反应的影响

豚鼠离体肺动脉用辣椒素（Ｃａｐｓａｉｃｉｎ）耗竭感觉神经肽（ＳＮＰ）后，缺氧性收缩反应（ＨＰＶ）显著增高（Ｐ＜０．０１）。套有带完整上皮支气管的肺动脉的ＨＰＶ显著弱于不套或套有去上皮支气管肺动脉的ＨＰＶ（Ｐ＜０．０５）；支气管与肺动脉同时用Ｃａｐ处理后，此差异消失；只有外套的支气管先用Ｃａｐ预处理时，肺动脉ＨＰＶ仍显著强于溶剂预处理的对照组（Ｐ＜０．０５）；套有去上皮支气管的肺动脉缺氧反应显著强于不套支气管的肺动脉。结果提示：肺动脉Ｃ－感觉神经所释放的ＳＮＰ在肺动脉缺氧反应中具调节作用；支气管上皮层可释放舒血管物质调节ＨＰＶ，此物质与ＳＮＰ密切相关；支气管还可能释放缩血管物质，介导ＨＰＶ。

FTIR显微红外光谱结合化学计量学在烧死鉴定中的研究

目的采用傅里叶变换红外(Fourier transform infrared,FTIR)显微光谱技术分析烧死者支气管上皮生化成分变化,为烧死案件鉴定提供辅助手段。方法采用10例烧死和20例非烧死案例,使用与红外显微镜联合的傅里叶变换红外光谱仪检测肺支气管上皮组织。对得到的红外光谱进行主成分分析和偏最小二乘判别分析。结果与对照组相比,烧死组支气管上皮细胞含有更多的β-转角和β-折叠以及更少的α-螺旋蛋白二级结构。构建的PLS-DA分类模型用于识别烧死,表现出优异的分类能力,准确率达到100%。结论红外光谱结合化学计量学方法可作为烧死死后诊断的补充手段。